专利名称：用于流感病毒感染的预防或治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及对流感病毒感染具有预防或治疗作用的物质、和用于流感病毒感染的 预防或治疗剂。本发明还涉及预防或治疗流感病毒感染(流行性感冒)的方法。
背景技术：
流感病毒在其被膜中具有两种类型的刺突糖蛋白、血凝素(HA)和唾液酸酶(NA， 神经氨酸酶)，它们在病毒感染的建立和病毒从宿主细胞的出芽中分别具有重要的作用。参与流感病毒感染的第一个步骤的血凝素具有多种亚型，这些亚型基于抗原决定 区(A-E)的氨基酸序列的多样性是高度可变异的。尽管在血凝素亚型中氨基酸序列同源性 在25-75%的范围内，但结合宿主细胞的受体的所谓受体结合袋区相对较少发生变异，并且 其三维结构是非常保守的(非专利文献1 (NPL 1))。为了预防流感病毒感染，已经进行了研究以开发特异性结合有助于感染建立的血 凝素并且因此抑制血凝素的功能的疫苗。例如，专利文献1(PTL 1)公开了用于预防流感病毒感染的肽，并且具体地公开了 其脂质体制剂；并且已经证实了该脂质体制剂的体外作用。专利文件2 (PTL 2)在图1中证明了肽H3G-1对Hmi和H3N2均具有抑制作用。然 而，肽H3G-1的抑制作用很弱。引用文件列表专利文献PTL 1 日本未审查的专利公开第2002-284798号PTL 2 日本未审查的专利公开第2006-101709号非专利文献NPL 1 :Y. Suzuki，Prog. Lipid. Res.，33,429 (1994)
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种对流感病毒感染(流行性感冒)具有高度预防或治疗作 用的物质。本发明的另一个目的是提供一种用于流感病毒的预防或治疗剂。本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗流感病毒的方法。解决向题的方案本发明人对如SEQ ID NO 1中给出的硬脂酰化肽的抗流感病毒作用进行了进一步 的研究。结果，本发明人发现脂质体制剂形式的该肽仅对H3N2发挥抗流感病毒作用，而该 肽的自组装体对于大量的流感病毒，诸如H1、H3、H5和H7亚型具有更大的效力。本发明人 进一步发现该肽的自组装体可以通过用具有1414个碳原子的酰基来酰化该肽的N-末端 而获得。
本发明提供了下列的自组装体和用于流感病毒感染的预防或治疗剂。第1项.一种化合物或其药学可接受的盐的自组装体，所述化合物由式I表示R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其 中R1代表具有14-M个碳原子的直链或支链酰基；R2代表OH、NH2, NR3R4、取代或未取代的 烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的芳烷氧基；且R3和R4独立地代表取代或 未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、烷氧基或羟基；条件是R3和 R4两者不同时代表羟基或烷氧基。第2项.根据第1项所述的自组装体，其中R1代表硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基或 棕榈油酰基(palmitoleyl)。第3项.根据第1项所述的自组装体，其中R2代表OH或NH2。第4项.根据第1项所述的自组装体，其中R1代表硬脂酰基，且R2代表OH或NH2。第5项.根据第1-4项中任一项所述的自组装体，其中所述自组装体为冻干产物 的形式。第6项.一种用于流感病毒感染的预防或治疗剂，包含第1-5项中任一项所述的 自组装体。 亚型。
第7项.根据第6项所述的预防或治疗剂，其中所述流感病毒为HI、H3、H5或H7
第8项.根据第6项所述的预防或治疗剂，其中所述流感病毒为Hl或H3亚型。 第9项.根据第6项所述的预防或治疗剂，其中所述流感病毒为Hl亚型。 第10项.一种化合物、其药学可接受的盐、或所述化合物或所述药学可接受的盐 的自组装体，所述化合物由式I表示R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其中R1代表硬脂酰基，且R2代表NH2。第11项.一种预防或治疗流感病毒感染的方法，包括向感染流感病毒的患者或处 于感染风险的受试者施用有效量的化合物、其药学可接受的盐、或所述化合物或所述药学 可接受的盐的自组装体，所述化合物由式I表示R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其 中R1代表具有14-M个碳原子的直链或支链酰基；R2代表OH、NH2, NR3R4、取代或未取代的 烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的芳烷氧基；且R3和R4独立地代表取代或 未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、烷氧基或羟基；条件是R3和 R4两者不同时代表羟基或烷氧基。发明的有益效果根据本发明，可以获得用于流行性感冒/流感病毒感染的有效预防或治疗剂。SEQ ID NO 2中给出的肽显示有效的体外作用。然而，此肽在体内无效，并且实际 上在体内加重流感病毒感染。相反，本发明的由式⑴表示的N-乙酰化肽，特别是SEQ ID NO :2中给出的肽，在 体内以及体内均显示对流感病毒的有效预防或治疗作用。此外，C18D1 (硬脂酰-GLAMAPSVGHVRQHG_NH2)，当形成为脂质体时，具有针对流 感病毒Hl和H3的非常低的约500nM的IC5tl值，并且显示基本上没有抗流感病毒作用；而
4C18D1的自组装体显示高度有效的作用。
图1显示通过向流感病毒感染小鼠施用肽C18-D1所获得的生存有益效果。使用 C18-D1(C18-GLAMAPSVGHVRQHG-NH2)和 C18-S2(C18-ARLPRTMVHPKPAQP_NH2)。肽 C18-D1 的 剂量为17. 4mg/(kg)，并且肽C18-S2的剂量为19. 4mg/(kg)。
具体实施例方式根据本发明，由下面显示的式I表示的化合物或其药学可接受的盐的自组装体可 以用作流感病毒感染的预防或治疗剂。R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其 中R1代表具有14-M个碳原子的直链或支链酰基；R2代表OH、NH2, NR3R4、取代或未取代的 烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的芳烷氧基；且R3和R4独立地代表取代或 未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、烷氧基或羟基；条件是R3和 R4两者不同时代表羟基或烷氧基。当根据本发明的由式I表示的化合物形成为自组装体时，该自组装体显示对流感 病毒感染的增加的预防或治疗作用。此外，该自组装体可以获得对大量的流感病毒，诸如 Hl亚型(例如H1N1、H1N2)、H3亚型(例如H3N2)、H5亚型(例如H5N1)、和H7亚型(例如 H7N1)的有效性。如下面实施例中所示，证明了本发明的自组装体对Hl和H3亚型的有效性。由于 由式I表示的化合物的自组装体有效地对抗Hl和H3亚型，据推测该自组装体结合宿主细 胞的受体结合袋区，该受体结合袋区相对较少发生变异，并且其三维结构是非常保守的，由 此显示抗流感病毒作用。因此，根据本发明的由式I表示的化合物的自组装体有效地对抗 Hl和H3亚型以及H5和H7亚型的感染，这些亚型均具有共同的受体结合袋区。本发明的自组装体在体内以及体外均有效。例如，通过S2 (ARLPRTMVHPKPAQP-NH2) 的N-末端的硬脂酰化获得的C18-S2 (硬脂酰ARLPRTMVHPKPAQP-NH2)，显示有效的体外抗流 感病毒作用。然而，C18-S2在体内无效，并且实际上导致由流感病毒感染引起的早期死亡 率。因此，C18-S2的抗流感病毒作用在体内和体外极大地不同。根据本发明的肽的一个特 征是本发明的肽在体内和体外均显示抗流感病毒作用。根据本发明的自组装体具有微团样结构，其中由R1代表的酰基部分指向内侧，并 且肽部分指向外侧。由于脂质体制剂为含有磷脂作为主要组分的脂质体形式，不能形成由 式I表示的化合物的自组装体。尽管专利文献1在实施例中公开了在C-末端上具有羧基 (COOH)的N-末端-硬脂酰化(C18)肽，但其中没有公开根据本发明的在C-末端上具有酰 胺(CONH2)的硬脂酰化肽。专利文献1仅公开了由式I表示的化合物的制备，其中R1代表硬脂酰基且R2代表 0H，并且公开了含有该化合物的脂质体制剂。专利文献1没有公开自组装体。尽管不希望 受理论约束，本发明人认为根据本发明的式I的化合物的自组装体对大量流感病毒的有效 性归功于自组装体的结构，因为专利文献1证明含有式I化合物的脂质体制剂仅对H3亚型 有效，且对Hl亚型(HlNl)无效。
在专利文献2的图1中显示为H3G-1的式⑴的N-末端非酰化肽(其中R1为H)， 在流感病毒Hmi的空斑化验中显示> 100 μ M的IC5tl值，并且因此具有非常弱的流感病毒 感染抑制作用。本发明人认为自组装体结构是很重要的，因为其中R1为H的式(I)的肽不 能形成自组装体。式I化合物的自组装体可通过将式I化合物溶解在水中，任选紧接着搅拌来制 备。关于形成自组装体的水溶液中的浓度，因为临界微团浓度为约0. 5-约2 μ M(例如，约 1. 3 μ Μ，当R1为硬脂酰基时)，自组装体可以通过以不低于该临界微团浓度的浓度溶解式I 的化合物来制备。式I化合物的浓度越高，自组装体的平均粒径趋于越大。式I化合物的 自组装体的平均粒径优选为约IOOnm或更大；并且可以为，例如，约IOOnm-约20 μ Μ,优选 约300nm-约10 μ Μ,更优选约500nm_约7 μ m，并且特别优选约700nm_约5 μ m。如本文使用的自组装体可以通过将化合物溶解在水中来获得，S卩，水分散体的形 式。自组装体的实例包括当与水接触时可以容易地再生产自组装体的大量产品，诸如其冻 干产物。如本文使用的酰基的实例包括可以用羟基取代的(141直链或支链酰基，诸如 肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基(arachidoyl)、山嵛酰基、木蜡酰基、十四 碳烯酰基(myristoleoyl)、棕榈油酰基、油酰基、亚油酰基(linoleoyl)、γ-亚麻酰 基(linolenoyl)、α -亚麻酰基、花生酰基、反油酰基(elaidoyl)、二十碳三烯酰基 (eicosatrienoyl)、异硬脂酰基、12-羟基硬脂酰基、蓖麻油酰基(ricinoleoyl)等。这样的R1基团可以通过使可用羟基取代的相应的C14_24、优选C16_22、更优选C16_2Q、 和特别地C18_2(l直链或支链高级脂肪酸的酰氯、酸酐或活性酯、或诸如DIC( 二异丙基碳二 亚胺)和DCC(二环己基碳二亚胺)的偶联剂以及相应的羧酸，与由Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2 (其中R2如上所定义)表示的肽反应来获 得，所述脂肪酸为诸如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、木蜡酸、肉豆蔻烯酸、棕 榈油酸、油酸、亚油酸、Y-亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、反油酸、二十碳三烯酸、异硬脂 酸、和12-羟基-硬脂酸、蓖麻油酸等。由于其中R1为H的式I化合物不能形成自组装体，与本发明的化合物相比，该化 合物显示非常弱的抗流感病毒作用。由于其中R1为十二烷基(C12)的式I化合物具有低的 自组装体形成能力，该化合物在体外试验中显示非常弱的活性。相反，其中R1含有14个碳 原子(肉豆蔻酰基)的多肽具有中等水平的活性。其中R1含有16-22个碳原子的多肽具 有有效的活性。当R1含有多于20个碳原子时，获得的肽具有低水溶性。因此，R1优选含有 16-20个碳原子，并且特别地为18-20个碳原子。如本文使用的烷基的实例包括含有1-6个碳原子，且优选1-4个碳原子的烷基，诸 如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。烷基的取代基 的实例包括羟基、氟原子、甲氧基、乙氧基等。芳基的实例包括苯基、萘基、芴基、蒽基、联苯基、四氢化萘基、苯并二氢吡喃基、2， 3- 二氧-1,4- 二氧萘基(dioxanaphthalenyl)、弗满基禾口菲基。芳烷基的实例包括苄基、萘甲基、芴甲基、蒽甲基、联苯基甲基、四氢化萘基甲基、 苯并二氢吡喃基甲基、2，3_ 二氢-1，4-二氧萘基甲基、茚满基甲基、和菲基甲基、苯乙基、萘 乙基、芴乙基、蒽乙基、联苯基乙基、四氢化萘基乙基、苯并二氢吡喃基乙基、2，3-二氢-1，4- 二氧萘基乙基、茚满基乙基和菲基乙基。烷氧基的实例包括0_(烷基)。烷基如上所定义。烷氧基的取代基的实例包括羟
基、氟原子、甲氧基、乙氧基等。芳氧基的实例包括0_(芳基)。芳基如上所定义。芳烷氧基的实例包括0_(芳烷基)。芳烷基如上所定义。烷基的取代基的实例包括氟原子、烷氧基、氰基、羟基等。芳基、芳烷基、芳氧基或类似的芳基部分的取代基；和芳烷氧基或类似的芳基部分 的取代基的实例包括卤素原子(F、Cl、Br、I)、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、乙酰基、 亚甲二氧基、烷基、烷氧基、氨基甲酰基、乙酰基氨基等。取代基的数目为1-5，优选1-3，和 更优选1-2。R2优选代表OH、NH2, NR3R4 (其中R3和R4如上所定义)或烷氧基。如本文所使用的式I的化合物可以通过下面获得根据普通的肽合成法，诸如 Fmoc法，通过液相合成或固相合成来合成式I表示的化合物，其中R1为氢原子，且R2为如上 所定义的基团(H-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2)； 并且通过使用诸如DIC的偶联试剂将酰基引入至R1。R2基团可以通过使用Gly-R2作为C-末 端上的氨基酸而被引入。R2基团可以通过适当地选择固相合成用载体而作为OH或NH2肽 被切除。如本文所使用的式I表示的化合物的药学可接受的盐的实例包括无机酸诸如盐 酸、硫酸、硝酸、磷酸、和氢溴酸；有机酸盐诸如三氟乙酸、乙酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒 石酸、甲磺酸、和甲苯磺酸；和碱金属或碱土金属盐诸如钠盐、钾盐、锂盐、钙盐和镁盐。本发明的自组装体可以配制成包括本发明的自组装体作为活性成分、和任选的其 他组分诸如药理学可接受的载体、稀释剂和赋形剂的药物制剂。该药物制剂可以施用于例 如，感染或未感染的人或其他哺乳动物、禽类等。施用根据本发明的用于流感病毒感染的预防或治疗剂的方法不受特别的限制，并 且可以适当地根据药物制剂的形式；患者的年龄、性别和其他状况；疾病的严重性等来选 择。优选的剂型的实例为口服制剂，诸如片剂、胶囊、颗粒剂和舌下片剂；和胃肠外剂型，诸 如注射剂、滴剂、滴鼻剂、吸入剂、贴剂和泥敷剂。吸入剂是特别优选的。用作根据本发明的用于流行性感冒的预防或治疗剂(包括药物组合物和药物制 剂)的活性成分的式I化合物的自组装体的日剂量可以根据受试者的状况、体重、年龄、性 别等而变化，并且不能完全统一。然而，剂量可以典型地选自约0.001-约IOOmg/天/成人 的范围。用于流行性感冒的预防或治疗剂可以一天一次、或以分次剂量给药。下面参照参考例和实施例进一步详细地描述本发明，但本发明不限于此。
实施例参考例1由 H-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-NH2表 示的多肽根据Fmoc法通过使用Fmoc氨基酸(1. 4当量)、HOBt (1-羟基苯并三唑；2. 5当 量)和DIC(2. 8当量)通过固相合成来合成。使用硬脂酸(1当量)、DIC(2. 8当量)和 HOBt (2. 5当量)在类似于肽合成的条件下，使获得的多肽在DMF和DCM的混合溶剂中反应90 分钟以合成由(硬脂酰)-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-NH2表示的本发明的肽，本发明的肽具有与N-末端处的氨基结合的硬脂酰基(此 后称为“C18-D1”)。C18-D1通过HPLC使用C-18柱纯化。通过质谱法确认C18-D1的产生 ([M+H]+ = 1782. 29)。参考例2C18-S2(硬月旨酷 ARLPRTMVHPKPAQP-NH2)、S2 (ARLPRTMVHPKPAQP-NH2)禾口 Dl (GLAMAPSVGHVRQHG-NH2)以类似于参考例1的方式合成。通过质谱法确认C18-S2、S2和 Dl的产生。Dl 由 SEQ ID NO 1 表示，且 S2 由 SEQ ID NO 2 表示。实施例1纯化的C18-D1的临界微团浓度(CMC)以下列的方式确定。制备含有1 μ M N-苯 基-1-萘胺(此后缩写为“ΝΡΝ”)的PBS(pH 7.5)。C18-D1肽储备溶液(ImM)连续地稀释 至0. 1,0. 3,1. 3、10和30 μ M的终浓度。这些溶液通过350nm的波长激发，并且测量450nm 处的荧光强度(FI)。每个稀释的肽溶液和单独PBS之间的FI差异绘制为纵坐标，并且肽 溶液绘制为横坐标。确定高浓度曲线和低浓度曲线交点处的浓度。交点的临界微团浓度 (CMC)为 1. 3 μ Μ。实施例2 抑制流行性感冒感染的体外试验通过对MDCK细胞的空斑化验确定流感病毒感染的抑制。6孔板中的MDCK细胞与 每个含有 Cl8-Dl、S2 (H-ARLPRTMVHPKPAQP"NH2)、Cl8-S2 (硬脂酰-ARLPRTMVHPKPAQP-NH2)或 Dl (H-GLAMAPSVGHVRQHG"NH2)的 0. 2mL 流感病毒 A/PR/8/34 溶液(100_200pfu ；pfu 表示空 斑形成单位；Hmi亚型)或流感病毒A/Victria/l/75溶液(100-200pfu ；H3N2亚型)孵育。 在37°C下在5% CO2中孵育30分钟后，去除上清液，并且用PBS洗涤细胞。加入2mL (每孔) 含有0. 6%琼脂糖、0. 01% 0- 二乙氨基乙基纤维素葡聚糖、0. 1% NaHCO3和0. 01 μ g/mL乙 酰基胰蛋白酶的& MEM+BSA，并将细胞孵育两天。用结晶紫溶液(在20%乙醇中lmg/mL) 染色活细胞，并且计数空斑数。最大感染活性(100% )定义为缺少C18-D1时的空斑数。 C18-D1的IC50值(50%抑制浓度)从log[f/(l-f)]和log[C18_Dl]之间的图获得，其中f 是感染活性百分比。以类似的方式计算S2、C18-S2和Dl的IC5tl值。化合物A对MDCK细胞的流感病毒感染抑制作用的研究结果如下。C18-D1对MDCK细胞的体内流感病毒感染抑制作用通过空斑化验来确定。在 C18-D1的存在下抑制流行性感冒A型病毒HAl (A/PR/8/34(HlNl))和流行性感冒A型病毒 HA3 (A/Victria/l/75 (H3N2))对 MDCK 细胞的感染。[表 1]
权利要求
1.一种化合物或其药学可接受的盐的自组装体，所述化合物由式I表示R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其中 R1 代表具有14- 个碳原子的直链或支链酰基；R2代表OH、NH2, NR3R4、取代或未取代的烷氧 基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的芳烷氧基；且R3和R4独立地代表取代或未取 代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、烷氧基或羟基；条件是R3和R4两 者不同时代表羟基或烷氧基。
2.根据权利要求1所述的自组装体，其中R1代表硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基或棕榈油 酰基。
3.根据权利要求1所述的自组装体，其中R2代表OH或NH2。
4.根据权利要求1所述的自组装体，其中R1代表硬脂酰基，且R2代表OH或NH2。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的自组装体，其中所述自组装体为冻干产物的形式。
6.一种用于流感病毒感染的预防或治疗剂，包括权利要求1-5中任一项所述的自组装体。
7.根据权利要求6所述的预防或治疗剂，其中所述流感病毒为H1、H3、H5或H7亚型。
8.根据权利要求6所述的预防或治疗剂，其中所述流感病毒为Hl或H3亚型。
9.根据权利要求6所述的预防或治疗剂，其中所述流感病毒为Hl亚型。
10.一种化合物、其药学可接受的盐、或所述化合物或所述药学可接受的盐的自组装 体，所述化合物由式I表示R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其中 R1 代表硬脂酰基，且R2代表NH2。
11.一种预防或治疗流感病毒感染的方法，包括向感染流感病毒的患者或处于感染风 险的受试者施用有效量的化合物、其药学可接受的盐、或所述化合物或所述药学可接受的 盐的自组装体，所述化合物由式I表示R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2(I)其中 R1 代表具有14- 个碳原子的直链或支链酰基；R2代表OH、NH2, NR3R4、取代或未取代的烷氧 基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的芳烷氧基；且R3和R4独立地代表取代或未取 代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、烷氧基或羟基；条件是R3和R4两 者不同时代表羟基或烷氧基。
全文摘要
本发明提供了一种化合物或其药学可接受的盐的自组装产物。R1-Gly Leu Ala Met Ala Pro Ser Val Gly His Val Arg Gln His Gly-R2 (I)，在式中，R1代表具有14-24个碳原子的直链或支链酰基；R2代表OH、NH2、NR3R4、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或取代或未取代的芳烷氧基；且R3和R4独立地代表取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、烷氧基或羟基，条件是R3和R4两者不同时代表羟基或烷氧基。
文档编号A61K38/00GK102137868SQ200980133918
公开日2011年7月27日 申请日期2009年8月7日 优先权日2008年8月29日
发明者佐藤智典, 石原豪史 申请人:学校法人庆应义墪