专利名称：黏着杆菌属细菌用于群体淬灭的用途的制作方法
黏着杆菌属细菌用于群体淬灭的用途本发明属于生物学和分子生物学领域，涉及能够降解N-酰基高丝氨酸 内酯(AHL)，以控制感染性细菌病，且避免生物被膜(biofilm)形成的黏着杆菌属 (Tenacibaculum)的禾中。
背景技术：
许多细菌种利用协调遗传调控机制对环境变化作出响应。该机制称作群体感应 (QS)，存在于信号分子的产生并释放入介质中，信号分子在介质中积聚从而控制多种基因 的表达(Fuqua等，1994.细菌学杂志176 :269-275)。通过QS通讯，细菌群体能够协调以执 行重要的生物功能，其中许多与重要病原体的毒性有关，例如迁移性，群游，聚集，发光，抗 生素的生物合成，毒性因子，共生，生物被膜的形成和分化，通过接合转移质粒等(Williams 等，2007. Phil Trans R Soc B 362:1119-1134)。最为广泛研究和了解的QS信号是许多革兰氏阴性菌使用的N-酰基-高丝氨酸 内酯(AHL) (Williams 等，2007. Phil Trans R Soc B 362:1119-1134)。AHL 也被称为自体 诱导物(Al)，是一类在许多细菌(主要是革兰氏阴性菌)的QS系统中使用的信号分子，其 基于一具有不同长度，在4-14个碳之间的酰基侧链的饱和或非饱和内酯环，在第三个碳原 子上具有或不具有氧或羟基取代(Whitehead等，2001. FEMSMicrobiol Rev 25:365-404)。 随着QS协调的细菌种群在其与其他原核生物或真核生物的多重作用中获得重要的竞争优 势，它们的竞争者会获得干扰其通过QS系统通讯的机制；这些机制被称为群体淬灭OiQ)。 它们基于模拟AHL封闭受体的抑制剂生产，例如海藻海洋红藻(Delisea pulchra)产生的 呋喃酮(Givskov 等，1996. JBacteriol 178 :6618-6622)。另一种封闭 AHL 介导的 QS 系统 的策略是酶降解信号分子。迄今，已经描述了两大类能进行这种降解的酶水解内酯环的 内酯酶和打断内酯环与侧链之间的键的酰基酶(Dong等，2007. Wiil Trans R Soc B 362 1201-1211)。虽然在上世纪，人工化疗剂的合成和抗生素的开发和改进意味着各种感染性疾病 治疗中真正的医学革命，但某些病原性细菌产生的抗生素耐药性成为了一个全球性的严重 问题，迫使药物工业开发新一代的更强大的抗生素，而产生了具有多重耐药性的菌株，从 而使得治疗耗时更长，常常无效，甚至导致病人死亡。细菌环境中存在的选择压力，宿主的 免疫情况，细菌微环境和所涉及的细菌典型因子在耐药性产生中起到了重要作用。由于大量人病原体(例如恶臭假单胞菌O^seudomonas putida)，沙雷氏菌 (Serratia spp)等)，植物病原体(例如农杆菌(Agrobacterium spp.)，胡萝卜软腐欧 文氏菌(Erwinia carotovora)，...)和海洋病原体(例如(杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida),獲弧菌(Vibrio anguillarum), . .)(Williams 等，2007. Phil Trans R Soc B362 :1119-1134 ;Bruhn 等，2005. Dis Aquat Org 65 :43-52.)利用 AHL 控制毒性 因子的产生，干扰这些通讯系统构成了控制感染性细菌病的一种感兴趣而有前景的途径 (Dong 和 Zhang. 2005. J Microbiol 43 :101-109 ;Dong 等，2007. Phil Trans R Soc B362 1201-1211)。另外，与抗生素联用的这类机制可能是治疗毒性机制的QS控制已有描述(Venturi，2006. FEMS Microbiol Rev 30 :274-291)的多重耐药性病原体，例如铜绿假单胞 菌(I^eudomonas aeruginosa)或其他人、动物和植物病原体所致感染性疾病的可能策略。 QQ策略对治疗感染性疾病的感兴趣之处在于，因为它们不直接影响病原体的生存，但影响 其毒性因子的表达，它们不会产生选择压力，因此避免了耐药性的出现。发明简述大规模使用化疗剂所代表的选择压力使得具有耐药性机制的微生物菌株传播，从 而在很多情况下阻碍了合适的临床治疗，甚至导致病人死亡。由于许多细菌利用QS信号系 统来同步群体内的遗传表达和协调生物活性，控制毒性和生物被膜形成等生物功能，一种 避免增加病原菌的耐药性机制的途径是控制这些QS信号系统。该信号系统的抑制被称作 群体淬灭(QQ)。本发明提供了控制细菌感染的途径，而不对这些细菌群体施加选择压力，因 此避免了耐药性的出现，以及抑制涉及QS信号、AHL类型的其他细菌寄居过程，例如生物被 膜的形成。本发明首次公开了利用能够降解N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的黏着杆菌属的 细菌细胞来控制感染性细菌病和抑制生物被膜的形成。因此，本发明的第一个方面涉及黏着杆菌属细菌细胞，其细胞粗提物，或其培养上 清液，或其任何组合在群体淬灭中的用途。在本发明该方面的一个优选实施方式中，黏着杆菌属的细菌细胞，其细胞粗提物， 或其培养上清液，或其任意组合用于降解N-酰基-高丝氨酸内酯(AHL)。任何细菌响应不同的环境信号调节其基因表达，这是与其他生物体竞争的必要 手段。在病原菌的特定情况下，基因调控是至关重要的，使得细菌能够在其宿主提供的特定 环境下存活。细菌毒性基因通过复杂的调控机制确保合适基因在合适时机表达。AHL是广 泛研究和公知的QS信号，被许多人、植物和海洋病原菌用之以控制毒性因子的产生。因此，本发明该方面的一个优选实施方式是利用能够降解N-酰基高丝氨酸内酯， 从而干扰细菌QS信号系统的黏着杆菌属的细菌细胞，所述黏着杆菌属细菌的细胞粗提物， 或其培养上清液，或其任意组合来制备药物。在更优选的实施方式中，药物用于治疗感染性 细菌疾病。本说明书所定义的"生物被膜"是包埋在胞外多糖基质，附着于惰性表面或活组 织上的微生物群落。它是附着在固体表面的细菌群落(包括一种或多种细菌)。抑制AHL 能够抑制QS所控制的过程所形成的生物被膜。生物被膜产生大量胞外多糖，产生粘性的外观，其特征是对抗生素具有很强的耐 药性。该耐药性可能是由于包埋细菌的胞外基质对杀菌剂的渗透提供了屏障。另一种可能 性是大部分生物被膜细胞由于缺乏食物生长非常缓慢，意味着对于抗微生物剂的效应不敏 感。第三个方面可能是生物被膜中的细胞，例如通过表达药物的排出泵而产生不同表型。表面的生物污染是常见的，而生物被膜能够在疏水、亲水、生物性或非生物性表面 产生，导致材料降解，污染产品，机械阻塞和阻碍水处理中的热传递。生物被膜也是饮用 水分配系统和其他管道中生物污染的首要原因，在防火系统中控制生物被膜也尤其重要。 附着在食物上，或与食物接触的表面上的细菌会引起严重的卫生问题，甚至导致食物毒性 感染的病例，以及由于产品丢弃所造成的大量经济损失(Carpentier和Cerf，1993. J App Bacter. 75 :499-511)。在养鱼业中，生物被膜形成与水下构造，例如笼、网和容器；或与设备例如管道、泵、滤器和收集罐，或与培养的物种，例如贻贝、蛤蜊、牡蛎等密切相关。这被称为生物污着， 影响了欧洲渔业的各方面，由于杀生物制品指令EC98/8/EC的生效而成为日益严重的问 题，并导致可观的经济损失。它也造成了严重的生态危害，因为附着在船壳上的水生生物作 为生物污着的后果跟随这些船到处散布。这意味着全球性的生态问题，因为这些船将侵略 性物种带到原来并不存在的湖泊、河流和海洋中。因此，用黏着杆菌属的细菌细胞，所述细菌的细胞粗提物或培养上清液制造的抗 水垢涂料将减少涂有这些涂料的船壳的生物污着，而不包含对海洋生命有毒的化学元素。因此，在另一个优选实施方式中，利用黏着杆菌属的细菌细胞，所述黏着杆菌属的 所述细菌的细胞粗提物或培养上清液抑制生物被膜的形成。有大量的流行病学证据将生物被膜与人中的不同感染过程联系起来(表 1) (Wilson,2001. Sci Prog 84 :235-254 ；Costerton 1999.Science 1999 ；284 1318-1322)。生物被膜产生疾病症状的机制仍然不完全清楚，但是已经有建议生物被膜细 菌能够产生内毒素，将细菌群释放到血流中，对免疫系统细胞的吞噬作用产生抗性，以及在 另一方面，为耐受抗生素治疗的细菌出现找到了机会。这最后一个方面可能是特别重要的， 因为源于生物被膜的耐药性细菌能够通过护理人员的双手从病人传到另一个病人。另外，与抗生素联合的这类机制可能是治疗毒性机制的QS控制已有描述 (Venturi，2006. FEMS Microbiol Rev 30 :274-291)的多重耐药性病原体，例如铜绿假单胞 菌，和其他人类、动物和植物病原体所致感染性疾病的感兴趣策略。因此，本发明该方面的 一个更优选的实施方式是联用能降解N-酰基高丝氨酸内酯的黏着杆菌属细菌细胞，所述 黏着杆菌属的所述细菌的细胞粗提物，或其培养上清液与抗生素来治疗感染性细菌病或抑 制生物被膜的形成。
权利要求
1.黏着杆菌(Tenacibaculum)属的细菌细胞、或其细胞粗提物、或其培养上清液，或它 们任意组合用于群体淬灭的用途，其中所述细菌细胞的rRNA的16S区与SEQ ID NO :1所包 含的同源性多核苷酸序列具有至少80%的相同性。
2.如前权利要求所述的细菌细胞，或其细胞粗提物、或其培养上清液，或它们任意组合 的用途，用于降解N-酰基高丝氨酸内酯。
3.如权利要求1-2任一所述的黏着杆菌属的细菌细胞，或其细胞粗提物、或其培养上 清液，或它们任意组合的用途，用于制备药物。
4.如权利要求1-3任一所述的黏着杆菌属的细菌细胞，或其细胞粗提物、或其培养上 清液，或它们任意组合的用途，用于制备治疗感染性细菌病的药物。
5.如权利要求1-2任一所述的黏着杆菌属的细菌细胞，或其细胞粗提物、或其培养上 清液，或它们任意组合的用途，用于抑制生物被膜的形成。
6.如权利要求1-4任一所述的黏着杆菌属的细菌细胞，或其细胞粗提物、或其培养上 清液，或它们任意组合的用途，其特征在于，与抗生素或其它抗菌剂联用。
7.如权利要求3-6任一所述的黏着杆菌属的细菌细胞，或其细胞粗提物、或其培养上 清液，或它们任意组合的用途，其中导致感染性疾病或生物被膜形成的细菌是革兰氏阴性 菌。
8.黏着杆菌属的细菌细胞的菌株，其保藏于西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，保藏 号为CECT7似6。
9.保藏号为CECT7426的黏着杆菌属的细菌细胞，或其细胞粗提物，或其培养上清液， 或它们任意组合的如权利要求1-7任一所述的用途。
10.组合物，其包含a.黏着杆菌属的细菌细胞，b.a)的细菌细胞的细菌培养物的细胞粗提物，c.b)的细菌提取物的上清液，或它们的任意组合，所述组合物用作抗菌剂。
11.如前权利要求所述的组合物的用途，，用于制造药物。
12.如权利要求10-11任一所述的组合物的用途，其特征在于，用于制造治疗细菌感染 的药物。
13.如权利要求10-12任一所述的组合物的用途，其特征在于，与抗生素或其他抗菌剂联用。
14.如权利要求8所述的组合物的用途，其特征在于，用于抑制生物被膜的形成。
15.如权利要求10-14任一所述的组合物的用途，其特征在于，所述生物被膜的形成或 细菌感染是革兰氏阴性菌导致的。
全文摘要
来自细胞粗提物或其培养上清液的黏着杆菌属的细菌细胞的用途，所述细胞能降解N-酰基高丝氨酸内酯，用于群体淬灭，用于治疗感染性细疾病或抑制生物被膜形成。
文档编号A61K35/74GK102149395SQ200980134158
公开日2011年8月10日 申请日期2009年7月23日 优先权日2008年8月1日
发明者卡萨尔 A·M·奥特罗, 里瓦达 A·罗加, 贝纳德斯 M·罗梅罗 申请人:圣地亚哥联合大学