使用丝状噬菌体治疗帕金森病的方法

专利名称：使用丝状噬菌体治疗帕金森病的方法
使用丝状噬菌体治疗帕金森病的方法发明背景发明领域本发明涉及用于治疗帕金森病(Parkinson’ s disease)的疗法和方法。相关技术描述帕金森病(PD)是进行性神经变性疾病，其主要临床特征包括运动异常，诸如静止性震颤、运动徐缓和强直(Fahn和Sulzer，2004)。PD的特征在于黑质致密部中失去多巴胺能神经元和相同区域的仍然存在的神经元中存在称为雷维小体和雷维神经突的包含体 (Forno，1996)。尽管普遍公认失去中脑多巴胺能神经元在很大程度上负责主要的运动症状，但是这不是显示PD患者中病理改变的唯一区域。雷维病理学和细胞失去首先出现在下脑干神经核(lower brain stem nuclei)中，逐渐上升至中脑并以高度可预测的方式最终到达皮质区(Braak等，2004)。雷维病理学向中脑外不同区域的进展可以解释PD患者中常见次要症状，诸如忧郁、痴呆和多种自主神经和感觉功能障碍的大量存在。尽管PD的原因仍不清楚，但是存在大量证据提示α -突触核蛋白的错折叠和异常聚集是该疾病发病机理的重要组成。遗传连锁分析已经鉴定了三种处于帕金森病遗传形式的错义突变(Kruger等1998 ；Polymeropoulos等1997 ；Zarranz等2004)，且所有突变变体已经显示出加速低聚化作用或纤维化颤动(Conway等2000 ；Greenbaum等200 。野生型 α-突触核蛋白的累积足以导致该疾病。α-突触核蛋白纤维状聚集体似乎是雷维小体和雷维神经突的主要组成，且这些现在被认为是用于验尸诊断的最可靠PD标记物(Spillantini等1998)。因为α -突触核蛋白是胞质蛋白，所以已经假设由该蛋白诱导的病理学变化和影响出现在胞质中并局限在单个细胞中。然而，近期关于胞外α-突触核蛋白的研究提示病理学作用范围超出其起源的胞质(Lee，2008)。最近体内和体外地证明了 α-突触核蛋白的存在及其在胞外流体中的聚集形式。 胞外α-突触核蛋白似乎通过泡囊内α-突触核蛋白的非常规胞吐作用来递送，尽管精确的机制尚未表征。泡囊内α-突触核蛋白倾向于聚集并是胞外聚集体的潜在来源。胞外空间中的分泌的α-突触核蛋白的作用可以由使用组织培养系统的研究来推断。若干研究报告了胞外α -突触核蛋白及其内部疏水性片段(非淀粉状成分或NAC)在所述蛋白被加入至培养基时的细胞毒性作用(Albani等2004 ；Bodies等2000 ；Du等2003 ； El-Agnaf 等 1998 ；Forloni 等 2000 ；Lee 等 2004 ；Seo 等 2002 ；Sung 等 2001)。一些研究已经证明了纤维状聚集体的毒性作用(Bodies等2000 ；El-Agnaf等1998)，而其他研究将初原纤维状或低聚聚集体确定为引起毒性的原因(Du等2003)。α -突触核蛋白可以容易地结合到膜中并可以存在于突触泡囊中和细胞膜上。不存在很大关于毒性机制的充分构造的模型。近期研究说明α-突触核蛋白孔样初原纤维在帕金森病发病机制中的可能作用(Tsigelny等，2007 ；Lee等，2002 ；Voiles和Lansbury, 2002)。一种模型提议低聚α-突触核蛋白可以形成具有中心孔的环状结构(Voiles和Lansbury 2003)。这些聚集体可以与膜结合(Voiles等2001)，并且它们的膜渗透作用已经在合成模型膜，诸如磷脂脂质体(Voiles等2001)和平面双层膜(Kayed等2004)中证明。将这些聚集体插入至细胞膜中应该对细胞存活具有灾难性影响，这归因于离子和小代谢物在胞质和胞外空间之间的自由交换。尽管这种毒性孔模型解释至少一些低聚聚集体的细胞毒性，但是孔和孔活性尚未在生物学系统中得到证明。胞外α-突触核蛋白，和特别是其他聚集体形式的神经毒性的另一种潜在机制可以包括神经炎性应答Chang等，2005 ；Klegeris 等，2006)。尽管至今已对开发治疗PD的疗法获得了进步，但是仍存在对另外的疗法的巨大需求。本文中任何文件的引用不意欲承认该文件是相关的现有技术，或关于本发明任何权利要求专利性所考虑的内容。关于内容的任何陈述或任何文件的日期基于提交申请时申请人所能获得的信息并不构成关于该陈述的正确性的认可。发明概述本发明提供用于治疗帕金森病或帕金森病的易感性的丝状噬菌体，和用于治疗患有或易感帕金森病(PD)的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用丝状噬菌体，所述噬菌体不展示出哺乳动物细胞内化信号。本发明还提供药物组合物，所述组合物包含丝状噬菌体，其展示特异于促炎细胞因子的抗体和第二丝状噬菌体，其不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii) α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体；(iii) β-淀粉状抗原或β-淀粉状抗体；或(iv)特异于促炎细胞因子的抗体。附图简述图IA和IB显示膜α-突触核蛋白(AS)聚集体的计算机模型，来自以孔样结构嵌入细胞膜中的α-突触核蛋白聚集体前面的透视图(

图1Α)和显示插入至膜中的蛋白深度的膜横截面图(图IB) (Tsigelny等，2007)。图2Α和2Β显示噬菌体在体外对AS片段聚集体的分散活性，如通过Tht测量地 (图2Α)和通过TEM视觉化地(图2Β)。图3是描述噬菌体对SH-SY5Y细胞存活的影响的图。图4Α和4Β显示在α-突触核蛋白过滤阻滞测定中利用α-突触核蛋白多克隆抗体，如视觉化(图4Α)和在ELISA中测量(图4Β)的由噬菌体(辅助子)引起的AS聚集体的减少。图5Α显示SH-SY5Y细胞的膜级分的Western印迹分析，其证明多种α -突触核蛋白(AS)低聚物的存在，且图5B显示用于在M13处理后测量低聚物的ELISA。在图5A中， As使用针对AS的多克隆抗体(Sigma(西格玛))来检测。在图5B中，来自膜级分的AS低聚物的量在特异于AS低聚物的ELISA中量化，所述AS低聚物使用针对AS的单克隆抗体 (Sigma (西格玛)，克隆Syn 211)来检测。在使用野生型丝状噬菌体处理的SH-SY5Y细胞的膜级分中测量到AS低聚物的量的显著减少。*=与非处理细胞相比的限制性差别(ρ < 0. 05)。图6是显示与载体相比，在与M13相互作用后AS反应性减小的图。该数据表示为用M13注射的一半脑半球中观察到的AS的神经元聚集体的平均数与使用PBS载体注射的另一半脑半球相比的比率(+M13)。在-M13对照中，两半脑半球均注射PBS载体。发明详述定义为了本说明书和附加权利要求的目的，应用以下定义。术语“患者”、“受试者”和“受体”可交替使用。它们包括作为治疗处理目标的人和其他哺乳动物。术语关于帕金森病的“治疗”意指基本抑制、减慢或逆转帕金森病的进展，诸如减少或抑制α-突触核蛋白聚集体的形成或分解预形成的α-突触核蛋白聚集体；基本改善帕金森病的一种或多种临床症状，诸如减少与帕金森病相关的炎症；或疾病预防帕金森病临床症状的出现。术语“共施用”意指通过同时、相继或分别施用的单剂量形式或多剂量形式施用。 优选地，共施用导致各待施加的施用对以重叠时期，更优选同时处理的细胞的作用。术语“抗体”用于本文中时包括多克隆抗体、单克隆抗体、具有多肽特异性的抗体组合物、双特异性抗体、双抗体、或其他纯化的抗体和重组抗体试剂。抗体可以是完整抗体， 例如任何同种型(IgG，IgA, IgE, IgM，等)的抗体，或结合目的抗原的抗体片段。在本发明中使用的抗体的特殊实例中，待配制的抗体是具有IgG同种型的抗体。抗体可以利用常规或其他技术来片段化，并且筛选所述片段与目的抗原的结合。一般地，抗体片段包含完整抗体的抗原结合和/或可变区。术语“抗体片段”包括通过蛋白水解裂解或通过重组制备抗体分子部分的片断， 其可以选择性结合选择的蛋白。所述蛋白水解和/或重组片段的非限制性实例包括Fab， F(ab' )2, Fab'，Fv，和包含由肽连接体相连的Vl和/或Vh结构域的单链抗体(scFv)，结构域抗体(dAbs)，Nanobodies (抗体-来源的生物治疗剂，其包含天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性)，和UniBodies (缺乏铰链区的抗体)。scFvs可以共价或非共价连接，以形成具有两个或更多结合位点的抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人源化单克隆抗体或完全人源化的单克隆抗体。术语“人源化单克隆抗体”用于本文中时，是来自非人来源(受体)的单克隆抗体，其已经被改变为包含等价人单克隆抗体(供体)中存在的至少一个或多个氨基酸残基。“完全人源化单克隆抗体”是来自非人来源的单克隆抗体，其已经被改变为包含等价人单克隆抗体的抗原结合区中存在的全部氨基酸残基。人源化抗体还可以包含受体抗体或供体抗体中均不存在的残基。可以进行这些修饰，从而进一步改善和最优化抗体的功能性。人源化抗体还可以任选地包含人免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分。术语“促炎细胞因子”指参与与帕金森病相关的脑炎症的促炎细胞因子，其优选地包括IL-6，IL-1，IL-17和TNFa，并且最优选是IL-6。术语“哺乳动物细胞内化信号”指任何细胞粘着序列，其作为细胞粘着/附着于细胞的结果，促进内在化。已知许多哺乳动物细胞粘着序列并且包括Arg-Gly-Asp (RGD) 细胞粘着序列，来自HIV的Tat肽和包含序列Arg-Glu-Asp (RED)，Arg-Lys-Lys (RKK)， Leu-Asp-Val(LDV ；Humphries,1992)， Leu-Leu-Gly (LLG ；Koivunen 2001), Asp-Gly-Glu-Ala(DGEA ；SEQ ID NO 2), Ile-Arg-Val-Val-Met(IRVVM ；SEQ ID NO 3 ； Kosfeld 等，1993)，Pro-His-Ser-Arg-Asp (PHSRN ；SEQ ID NO 4)和 RFYWMWK(SEQ ID NO 5;K0Sfeld等，199 的肽。在细胞粘性分子诸如层粘连蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，纤维蛋白原，血小板反应蛋白，等中已知许多细胞粘着序列(也称为细胞附着基序)。术语“α-突触核蛋白抗原”指来自人α-突触核蛋白的抗原，其中人α -突触核蛋白优选具有氨基酸序列SEQ ID NO 6 (NCBI基因ID :6622，登记号ΝΡ000336 ；UniProtKB/ Swiss-Prot登记号Ρ37840)。“ α -突触核蛋白抗体”是识别和结合α -突触核蛋白SEQ ID NO 6或其变体或突变体的抗体。术语“ β -淀粉状抗原”指来自斑形成“ β -淀粉状肽”的抗原，也称为“ β ΑΡ”， “βΑ”，“Αβ ”或“ΑβΡ”，其源自人淀粉状前体蛋白。“β-淀粉状抗体”是识别和结合天然存在的人A β 1-42肽及其变体和突变体的β -淀粉状肽的抗体。用于本文中时，“药物组合物”指本文中偶数的一种或多种活性成分与其他化学成分诸如生理学适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向患者的施用。短语“生理学可接受载体”和“药用载体”，可交替使用，指不对生物体引起显著刺激并不消除所施用的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。术语“赋形剂”指添加至药物组合物以进一步促进活性成分施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、 植物油和聚乙二醇。术语“野生型丝状噬菌体”用于本文中时意指天然存在的丝状噬菌体，所述丝状噬菌体与其在自然界中典型相关的其他成分分隔开。术语还包括可商购的丝状噬菌体，其特征为“野生型”。术语“失活的野生型丝状噬菌体”用于本文中时意指这样的野生型丝状噬菌体，其不通过重组DNA手段遗传改变，但是已经，诸如通过UV照射，致使不能复制。致使噬菌体不能复制但是不干涉噬菌体丝状结构(保持其通过嗅觉途径渗透入脑中的能力)的任何机制通过本发明预期。
术语“WT噬菌体”指野生型丝状噬菌体和失活的野生型丝状噬菌体二者。用于治疗的丝状噬菌体和治疗方法在一个实施方案中，本发明提供用于治疗帕金森病或对帕金森病的易感性的丝状噬菌体和通过向患者施用丝状噬菌体来治疗患有或易感帕金森病的患者的方法，其中所述噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号，(ii) α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体，或(iii) β -淀粉状抗原或β -淀粉状抗体。在该实施方案的一方面，噬菌体作为药用组合物的一部分施用于患者，所述药用组合物另外包含药用载体。在该实施方案的另一方面，噬菌体是WT噬菌体。在不受理论束缚的条件下，提议本发明中使用的噬菌体结合膜中的胞外α -突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体并减少细胞膜中α-突触核蛋白的聚集。本发明人提议膜中α-突触核蛋白聚集体的这种减少也导致α-突触核蛋白的胞内聚集体的减少，其可能由α-突触核蛋白的平衡由胞内向胞外移动引起。然而，在不受人具体机制束缚的条件下， 本发明的丝状噬菌体和方法有效用于治疗患有或易感帕金森病的患者。在一个实施方案中，所述丝状噬菌体有效用于鼻内施用。鼻内使用容许这些噬菌体跨过血脑屏障。噬菌体然后在不对外周器官产生不利影响的条件下，经由尿液和粪便从脑和身体中排出。促炎细胞因子对帕金森病的神经炎性症状作出贡献。去除这些促炎细胞因子将改善这些症状。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于治疗帕金森病或对帕金森病的易感性的展示特异于促炎细胞因子的抗体的丝状噬菌体，和通过向患者施用展示特异于促炎细胞因子的抗体的丝状噬菌体来治疗患有或易感帕金森病的患者的方法。在该实施方案的一方面，噬菌体通过鼻内施用。在另一方面，噬菌体作为药用组合物的一部分施用，所述药用组合物另外包含药用载体。在另一方面，特异于促炎细胞因子的抗体是IgG类的抗体并具有Fc部分。在再一方面，所述抗体是特异于IL-6的抗体。在又一方面，具有促炎细胞因子的噬菌体不包含哺乳动物细胞内化信号。当鼻内施用时，具有抗体的噬菌体将被递送至脑，在那里它们将通过其上展示的抗体被指引至促炎细胞因子，由此灭活这些细胞因子。这些噬菌体-展示抗体的噬菌体部分应该具有双重作用，即使所述抗体越过血脑屏障和直接抑制α -突触核蛋白聚集。根据相关实施方案，本发明提供用于治疗的第一和第二丝状噬菌体和通过向患者共施用(a)第一丝状噬菌体，其展示特异于促炎细胞因子的抗体；和(b)第二丝状噬菌体， 其中所述第二噬菌体不展示特异于促炎细胞因子的抗体来治疗患有或易感帕金森病的患者的方法。在一方面，所述第二丝状噬菌体另外不展示哺乳动物细胞内化信号。在另一方面，所述第二丝状噬菌体另外不展示(i) α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体；或 (ii) β-淀粉状抗原或β-淀粉状抗体。在再一方面，所述第二丝状噬菌体另外不展示(i) 哺乳动物细胞内化信号；(ii) α -突触核蛋白抗原或α -突触核蛋白抗体；或(iii) β -淀粉状抗原或β -淀粉状抗体。在另一方面，各丝状噬菌体作为药用组合物的一部分施用，所述药用组合物另外包含药用载体。在任意上述组合物的另一方面，所述第二丝状噬菌体是WT噬菌体。在再一方面，所述第二丝状噬菌体是UV-照射的噬菌体。在又一方面，所述第一和所述第二噬菌体各自鼻内施用于患者。在另一方面，特异于促炎细胞因子的抗体是IgG类的抗体并具有Fc部分。在再一方面，所述抗体是特异于 IL-6的抗体。在另一方面，所述第一噬菌体不包含哺乳动物细胞内化信号。可以通过本领域已知任何技术将噬菌体制成展示针对促炎细胞因子的抗体。例如，可以通过公知的技术将抗体改造为单链抗体并且可以修饰噬菌体载体以使其在噬菌体表面上展示这样的单链抗体(scFv)。导致任何给定的抗体，优选单克隆抗体展示在噬菌体上的另一种方法时产生展示多肽的噬菌体，所述多肽结合免疫球蛋白的Fc部分。这样的噬菌体是本领域中已知的且记述在PCT公开W02007/095616中。使用这样的修饰的噬菌体，可以仅通过使抗体和噬菌体相接触而导致任何含有Fc部分的抗体在其上展示。抗体的Fc部分应该通过由噬菌体展示的Fc结合多肽来结合。因此，抗体或其片段的结合得到促进。在一个实施方案中，结合免疫球蛋白的Fc部分的多肽是蛋白A、蛋白G、其包含蛋白A的抗体结合部分(即结合结构域B)的片段或蛋白G、或蛋白A或蛋白G的变体。在另一个实施方案中，蛋白A的变体是具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的变体。当使用缺乏Fc区的抗体时，其必须通过噬菌体直接展示。
丝状噬菌体是一组结构相关的病毒，其包含环状单链DNA基因组。它们在生产性感染过程中不杀死它们的宿主。感染包含F质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)的噬菌体总称为Ff噬菌体。它们不感染哺乳动物。在一个实施方案中，上述发明中使用的各种丝状噬菌体独立地选自丝状噬菌体M13、Π和fd。在一方面，当使用第一和第二丝状噬菌体时，各噬菌体是同一亚型的噬菌体并且选自丝状噬菌体M13、fl和fd。改造具有特异于促炎细胞因子的抗体或结合免疫球蛋白Fc部分的多肽的噬菌体，以在其表面上展示所述蛋白。这典型地涉及表达待展示的多肽的cDNA克隆，作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白。展示外源蛋白或肽作为与噬菌体外壳蛋白的融合的丝状噬菌体是本领域技术人员公知的。可以使用多种噬菌体和外壳蛋白，包括，但不仅限于M13蛋白 III，M13 蛋白 VIII，M13 蛋白 VI，M13 蛋白 IX，和 fd 小外壳蛋白 pill (Saggio 等，1995 ； Uppala和Koivunen，2000)。可获得一大列载体来生成这样的融合蛋白(参见Kay等，1996 ； Berdichevsky等，1999 ；和Benhar，2001)。用于将外源编码序列插入至噬菌体基因中的方法是公知的(参见例如，Sambrook等，1989 ；和Brent等，2003)。在一个实施方案中，结合免疫球蛋白的Fc部分的多肽通过其与丝状噬菌体的小外壳蛋白(蛋白III)的融合来展示。本文中描述的方法还包括那些方法，其中鉴定患者为需要特别指定的治疗。鉴定患者需要所述治疗可以通过患者或健康护理专业人员的判断并可以是主观的(例如鉴定) 或客观的(例如可通过测试或诊断方法测量)。药物组合物在相关的实施方案中，本发明提供药物组合物(例如，无热原)，所述药物组合物包含(a)第一丝状噬菌体，其展示特异于促炎细胞因子的抗体；和(b)第二丝状噬菌体，其中所述第二噬菌体不展示特异于促炎细胞因子的抗体。在一方面，所述第二丝状噬菌体另外不展示哺乳动物细胞内化信号。在另一方面，所述第二丝状噬菌体另外不展示(i) α-突触核蛋白抗原或α -突触核蛋白抗体；或(ii) β -淀粉状抗原或β -淀粉状抗体。在再一方面，所述第二丝状噬菌体另外不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii) α-突触核蛋白抗原或α -突触核蛋白抗体；或(iii) β -淀粉状抗原或β -淀粉状抗体。在该实施方案的一方面，所述第二噬菌体是WT噬菌体。在更特殊的方面，所述第二噬菌体是UV照射的噬菌体。在另一方面，特异于促炎细胞因子的抗体是IgG类的抗体并具有Fc部分。在又一方面，所述组合物中的第一噬菌体展示特异于IL-6的抗体。在再一方面，所述第一噬菌体不包含哺乳动物细胞内化信号。在进一步的方面，所述组合物配制为用于鼻内施用。用于配制和施用药物的技术可以参见〃 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿制药科学)，“Mack Publishing Co.(马克出版公司)，Easton, PA，最新版，其通过参考被结合在本文中并且在本领域中公知。根据本发明使用的药物组合物因此可以以常规方式，使用一种或多种包括赋形剂和助剂的生理学可接受载体来配制，其促进处理活性成分进入可以制药使用的制剂。为了通过鼻吸入施用，根据本发明使用的活性成分方便地以气溶胶喷雾表观形式，由加压包装或喷雾器中，借助于合适的推进物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷或二氧化碳来递送。鼻腔喷雾剂，其不需要加压包装或喷雾器作为吸入喷雾剂，可以备选地用于鼻内施用。在加压气溶胶的情形中，给药单元可以通过提供阀来递送计量的量来确定。分配器中使用的例如，明胶的胶囊和药盒可以被配制为包含所述化合物和合适的粉末基诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。适合在本发明的方法的背景中使用的药物组合物包括这样的组合物，其中以有效实现预期目的的量包含活性成分。更具体地，有效量意指有效治疗帕金森病的活性成分的量。治疗有效量的确定充分在本领域技术人员的能力之内，特别是根据本文中提供的详细内容。给药量和间隔可以逐个地调节，以提供足以治疗的丝状病毒展示载体的脑水平 (最小有效浓度，MEC)。MEC对于各种制剂是不同的，但是可以由体外数据来评估。获得MEC 所必需的剂量应该取决于个体特征。给药间隔也可以使用MEC值来确定。制剂应该利用这样的方案来施用，所述方案保持脑水平在治疗期间内10-90 %的时间，优选30-90 %的时间和最优选50-90 %的时间内高于MEC。根据患者中待治疗的帕金森病的严重性和应答性，给药可以是单次给药或多次施药，治疗时期持续数日至数周或直至实现帕金森病状态的消减。待施用的组合物的量当然应该取决于待治疗的受试者、痛苦的严重性、开处方医师的判断等。本发明的方法中使用的组合物，如果需要，可以存在于包装或分配器装置，诸如 FDA批准的试剂盒中，其可以包含一种或多种包含活性成分的单位给药形式。所述包装可以，例如，包括金属或塑料薄片，诸如泡罩包装。所述包装或分配器装置可以附带有关于施用的说明书。所述包装或分配器装置还可以通过公告联合处于管理医药品制造、使用或销售的政府机构规定的形式的容器来提供，所述公告反映该机构批准的组合物或人或兽施用形式。该公共，例如，可以是由美国食品药品管理局(U. S. Food and Drug Administration) 批准的处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备包含在兼容药物载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于合适容器中，并标记指定病症的治疗，好像以上进一步详述的那样。在一个特殊实施方案中，本发明提供治疗帕金森病的试剂盒，其在分开的容器中包含(a)第一丝状噬菌体，其展示特异于促炎细胞因子的抗体；和(b)第二丝状噬菌体，其中所述第二噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii) α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体；(iii) β-淀粉状抗原或β-淀粉状抗体；或(iv)特异于促炎细胞因子的抗体；和(C)描述使用该试剂盒来治疗帕金森病的方法的说明书。虽然现在已经一般性地描述了本发明，但是通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例通过示范是方式提供并且不意欲限制本发明。
实施例该实施例中的实验结果证明丝状噬菌体对参与PD发病机理的α -突触核蛋白聚集体分解的影响。
制备丝状噬菌体M13丝状噬菌体由感染的TGl大肠杆菌培养物，使用Mi;3K07辅助噬菌体(New England Biolabs (新英格兰生物实验室)，Beverly, ΜΑ)，在含有50 μ g/ml卡那霉素 (kanamycin)的2YT培养液(Sigma-Aldrich (西格玛奥德里奇)，Louis，M0)中制备。离心细菌细胞(8300Xg，15min)，并噬菌体通过添加l/5(wt/vol)的16. 7%聚乙二醇(PEG) 从上清中沉淀出来，并离心(14，OOOXg, lh，在4°C )。将沉淀物重新悬浮在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)(上清体积的3%)中。剩余的细菌通过以6，OOOXg离心15min除去，并然后对噬菌体进行PEG-NaCl沉淀。最后将沉淀物重新悬浮在PBS (上清体积的2% )中并使噬菌体溶液经过无热原0. 45 μ m滤器过滤以除去任何剩余的细菌。球形噬菌体通过在具有等体积氯仿的PBS中培养丝状噬菌体产生。溶液在室温(RT)下经过;3min涡旋6次，每次10s， 并以18，5000xg离心lmin。水溶液和氯仿溶液均无盖地置于排风罩内，直至所有氯仿残余已经蒸发并然后重新悬浮在PBS中达到初始体积。通过使用超声波细胞分解仪(Microson Heat Systems (Microson 热系统)，Farmingdale，NY，美国)对处于冰上的 PBS 中的 500 μ 1 IxlO13个噬菌体进行超声波处理l^^sec来破坏噬菌体的完整性。研究体外α -突触核蛋白聚集测试和分析与人α-突触核蛋白(SEQ ID NO 7)的氨基酸71-82，即雷维小体中心相对应的12个氨基酸的片段，和完全重组α-突触核蛋白二者的聚集水平。检验丝状噬菌体防止并分解所述肽和重组α-突触核蛋白二者的能力。α-突触核蛋白聚集的水平针对硫黄素T(Tht)和蛋白质过滤测定来决定，如下所述。通过电子显微术视觉化α -突触核蛋白原纤维和丝状噬菌体为了评价丝状噬菌体的抗聚集作用，将900μ 1跨越α-突触核蛋白的氨基酸残基 71-82的α-突触核蛋白片段样品在37°C温育6周。在该阶段，使用聚集的肽温育丝状噬菌体1周的时期。检验两种噬菌体浓度1012/ml和IO11AiL将肽样品稀释至水性0.3μΜ Tht溶液中，达到最浓度225 μ Μ。量化480nm处的样品荧光发射。如通过480nm处发射的减少观察的，在含有1012/ml噬菌体的量的样品中检测到显著的43%减少(图2A)。样品还通过透射电子显微术(TEM)来观察。将样品加载在碳格中并包被乙酸铀酰。在仅含有α-突触核蛋白肽的样品中，检测到显著量的处于密集形式的复合原纤维(图 2Β，左图)。在使用IO11噬菌体温育的样品中观察到原纤维量和复杂性的充分降低，而在使用IO12噬菌体温育的样品中，没有检测到原纤维，并且仅可见无定形聚集体(图2Β，中图和右图)。作为细胞模型的SH-SY5Y细胞培养物成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y是作为PD模型使用的良好候选者，因为它是多巴胺能细胞。所述细胞使用野生型人α-突触核蛋白基因和突变α-突触核蛋白Α53Τ基因来稳定转染。 通过Wfestern印迹来确定α -突触核蛋白表达。 使用α-突触核蛋白抗体染色细胞以视觉化雷维小体。稳定转染从而过表达Α53Τα -突触核蛋白的SH-SY5Y细胞在IOcm器皿中生长并保持在含有非必需氨基酸(NEAAs)并增补FCS (10% )，谷氨酰胺QmM)，青霉素-链霉素溶液(1%)的 DMEM Ham' s F12(l 1)改良培养基(Biological hdustries (生物工业))中，其处于37°C，5%C02的湿润温育器中。细胞溶解为了分离α-突触核蛋白，利用由Lee等Q004)所述的细胞提取，如由本发明人的实验改进地，进行溶解程序。简言之，细胞使用PBS来冲洗，使用收集在15ml管中的 1. 5ml胰蛋白酶/器皿进行胰蛋白酶化，使用PBS离心并再次洗涤，随后收集至Eppendorf 管中。细胞使用 ΙΟΟμ 1 缓冲液 T (含有 20mM Tris pH7. 4,25mM KCl,5mM MgCl2，0. 25M 蔗糖，Triton X-IOO和蛋白酶抑制剂混合物)来溶解，吸吹直至不存在细胞团，在室温下温育lOmin，并以13，OOOkg离心lOmin。收集上清并将其置于分开的Eppendorf管中，标记为"sup"(注意任何上清均不应该与沉淀物级分保持在一起)。用缓冲液N(含有0. IM Na2CO3,pH 11. 5和蛋白酶抑制剂混合物)在不混合的条件下轻轻地覆盖该沉淀物，并在4°C 温育过夜。这容许该蛋白轻轻地重新悬浮在该缓冲液中。温育后，利用小吸移管头移出现在浑浊的缓冲液并弃去。管中的剩余物质标记物“沉淀物”。将上清和沉淀物提取物保持在_20°C，并通过Wfestern印迹来分析，从而测量可溶和不可溶α -突触核蛋白的量。噬菌体毒性使用噬菌体温育后的不同SH-SY5Y细胞的存活力使用MTT试剂来测试。在96孔板中，使用IxlO9和IxlO11噬菌体/孔来温育细胞过夜。该温育后没有观察到细胞死亡(图 3)。过滤阻滞测定为了蛋白聚集体过滤，使用可商购的狭线印迹装置(Bio-Rad Laboratories，慕尼黑，德国)。样品经过阻断的硝化纤维膜(0-. 2 μ m孔尺寸，Schleicher & Scheull,Dassel, 德国)来过滤。过滤后，使用0.1% SDS洗涤各狭线。α-突触核蛋白聚集体使用单克隆抗体LB509(1 10，000)及二级HRP-偶联的山羊抗小鼠抗体来检测，并最后通过化学发光来视觉化。PAF印迹的密度计量化使用SigmaGel vl. 0来进行。加入相等数量的细胞/IOcm器皿，并容许达到80%汇合。在那时，使用不同量的噬菌体处理细胞M和72小时。然后从各板收集细胞并溶解和分析，如下所述。过表达野生型α -突触核蛋白的不同SH-SY5Y细胞使用总量IxlO12噬菌体在37°C温育3小时的时期或过夜。提取可溶和不可溶的级分并通过0.2μπι硝化纤维膜来过滤不可溶的级分。保留滤器上的α -突触核蛋白聚集体的量在未处理的细胞中较高(图4Α)。α -突触核蛋白低聚物的ELISA改进用于检测α -突触核蛋白低聚种类的ELISA(El-Agnaf等，2000)，从而测量 SH-SY5Y细胞不可溶级分中的α-突触核蛋白低聚物的量。为了仅检测AS的低聚物，使用用于包被(与生物素缀合)的相同单克隆抗体。在使用噬菌体处理3小时和温育过夜的细胞的不可溶级分中均检测到AS低聚物的40% -50%减少。在细胞模型中Μ13噬菌体与α -突触核蛋白的相互作用α-突触核蛋白(AQ是位于突触前端的天然未折叠蛋白。As容易地通过N端结合至膜中，并由此以两种形式存在于细胞中膜结合和无序胞质形式。不断积累的数据表明 AS的膜形式在细胞毒性中起作用。初原纤维可以形成在细胞膜上的嵌入的环状结构，并引起膜渗透性。最近证明AS在存在液体的条件下具有较高聚集的倾向并且膜聚集体可以诱导AS胞质形式的聚集。在此，呈现在过表达野生型AS的SH-SY5Y细胞中使用野生型(MU)丝状噬菌体处理后的AS低聚物的调节。细胞的膜级分利用用于AS检测的膜提取试剂盒(MBL)，通过 Western印迹分析来提取。在膜级分中不仅检测到AS单体，而且还检测到AS 二聚体和三聚体(图5A)，这证明在我们的细胞模型的膜区室内存在AS低聚物。在使用丝状噬菌体温育后，丝状噬菌体对AS膜低聚化作用的影响显示在图5A和5B中。SH-SY5Y细胞利用视黄酸来区分，并使用处于噬菌体/ml的野生型噬菌体来温育过夜。次日提取膜级分，并在设计用于仅识别AS低聚种类的ELISA中测量各提取物样品的AS低聚物的量(图5B)。在使用丝状噬菌体温育后的SH-SY5Y细胞中测量到来自膜级分的AS低聚物的显著减少。野生型噬菌体对由膜级分提取的AS聚集体的影响提示野生型噬菌体影响质膜上的AS，其可能是通过经由以前证明的相互作用区域与AS直接相互作用实现，所述相互作用区域位于AS 的NAC区的氨基酸73-85。还可能的是，由于使用噬菌体长期温育细胞，小百分比的噬菌体内在化进入细胞，从而影响细胞中除质膜以外的其他膜区室。噬菌体与细胞的结合以及可能的内在化作用可以通过激活溶酶体降解来促进α-突触核蛋白从质膜中清除。使用帕金森病的转基因小鼠模型来研究与α -突触核蛋白的Μ13相互作用年龄为7个月的PDGFa-突触核蛋白转基因小鼠(D品系)和非转基因小鼠接受海马内注射IxlO14 Μ13噬菌体，并在7天后使用针对α-突触核蛋白的抗体Μ13和Ibal(用于小胶质活化)通过IHC分析脑。在注射Μ13的α-突触核蛋白Tg小鼠中观察到大量Μ13 免疫反应性。在新皮质和海马中的神经元细胞体中观察到Μ13免疫染色。在海马中，Μ13免疫染色也在神经毡中很丰富。在一半球中进行Μ13注射和在另一半球中进行磷酸盐缓冲液 (PBS)载体注射后，在脑两半球中测量α-突触核蛋白的神经元聚集体的平均数目，并且各半球中测量值之间的比率显示在图6中。虽然现在已经完整地描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解本发明可以在不偏离本发明的精神和范围并不需要过度实验的条件下，在广泛范围的等价参数、浓度和条件下进行。尽管本发明已经关于其具体的实施方案进行了描述，但是应该理解可以进一步改进。本申请意欲涵盖本发明的任何变体、应用或改进，它们一般性地遵从本发明原则并包括如在本发明所属领域中已知或常规实践范围内的和如可以应用于在所附权利要求范围内如上所述的基本特性的那些偏离本发明的内容。参考已知的方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法不以任何方式承认相关领域中公开、教导或提示了本发明的任何方面、描述或实施方案。具体实施方案的前述描述应该如此完整地揭示本发明的一般天性，从而使其他人可以通过应用本领域技术人员的知识(包括本文中引用的参考文献的内容)，在不需要过度实验、不偏离本发明一般概念的条件下，容易地改变和/或改进多种应用诸如具体的实施方案。因此，基于本文中存在的教导和指导，这些改进和改变意欲属于所公开的实施方案的等价物的含义和范围。应该理解本文中的措词或术语是为了描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措词应该由技术人员根据本文中存在的教导和指导，结合本领域一般技术人员的知识来解释。参考文献
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权利要求
1.用于治疗帕金森病或对帕金森病的易感性的丝状噬菌体，其中所述丝状噬菌体展示针对促炎细胞因子的抗体。
2.用于治疗帕金森病或对帕金森病的易感性的丝状噬菌体，其中所述丝状噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii) α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体；或(iii) β-淀粉状抗原或β-淀粉状抗体。
3.根据权利要求1或2的丝状噬菌体，其中所述噬菌体不展示哺乳动物细胞内化信号。
4.根据权利要求1-3中任一项的丝状噬菌体，其中所述噬菌体是WT噬菌体。
5.根据权利要求4的丝状噬菌体，其中所述噬菌体是UV照射的噬菌体。
6 用于治疗帕金森病的第一和第二丝状噬菌体，其中a)所述第一丝状噬菌体展示针对促炎细胞因子的抗体；和b)所述第二丝状噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii)α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体；(iii) β-淀粉状抗原或β-淀粉状抗体；或(iv)针对促炎细胞因子的抗体。
7.根据权利要求6的丝状噬菌体，其中所述第一噬菌体不展示哺乳动物细胞内化信号。
8.根据权利要求6或7的丝状噬菌体，其中所述第二噬菌体是WT噬菌体。
9.根据权利要求8的丝状噬菌体，其中所述第二噬菌体是UV照射的噬菌体。
10.根据权利要求1、3、4和5中任一项的丝状噬菌体，其中展示结合促炎细胞因子的抗体的丝状噬菌体进一步展示蛋白A或蛋白G的抗体结合部分，并且其中结合促炎细胞因子的抗体与蛋白A或蛋白G的抗体结合部分结合。
11.根据权利要求3-10中任一项的丝状噬菌体，其中所述结合促炎细胞因子的抗体是结合IL-6的抗体。
12.根据权利要求1-11中任一项的丝状噬菌体，其中各噬菌体用于鼻内施用。
13.根据权利要求1和3-12中任一项的丝状噬菌体，其中各丝状噬菌体独立地选自 M13、Π和fd噬菌体，及其混合物。
14.根据权利要求13的丝状噬菌体，其中各丝状噬菌体是M13。
15.一种药物组合物，其包含a)第一丝状噬菌体，其展示特异于促炎细胞因子的抗体；b)第二丝状噬菌体，其中所述第二噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii) α -突触核蛋白抗原或α -突触核蛋白抗体；β -淀粉状抗原或β -淀粉状抗体；或(iv)特异于促炎细胞因子的抗体；和c)药用载体。
16.权利要求15的组合物，其配制为用于鼻内施用。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述第一噬菌体不展示哺乳动物细胞内化信号。
18.权利要求15-17中任一项的组合物，其中所述第二噬菌体是WT噬菌体。
19.权利要求18的组合物，其中所述第二噬菌体是UV照射的噬菌体。
20.权利要求15-19中任一项的组合物，其中所述第一丝状噬菌体进一步展示蛋白A或蛋白G的抗体结合部分，并且其中结合促炎细胞因子的抗体与蛋白A或蛋白G的抗体结合部分结合。
21.权利要求15-20中任一项的组合物，其中所述结合促炎细胞因子的抗体是结合 IL-6的抗体。
22.权利要求15-21中任一项的组合物，其中所述第一和第二丝状噬菌体中的每个独立地选自M13、Π和fd噬菌体，及其混合物。
23.权利要求22的组合物，其中所述第一和第二丝状噬菌体是M13。
24.一种通过向有此需要的患者施用丝状噬菌体来治疗患有或易感帕金森病的患者的方法，其中所述噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号；(ii) α-突触核蛋白抗原或 α -突触核蛋白抗体；或(iii) β -淀粉状抗原或β -淀粉状抗体。
25.一种通过向有此需要的患者施用丝状噬菌体来治疗患有或易感帕金森病的患者的方法，所述丝状噬菌体展示针对促炎细胞因子的抗体。
26.权利要求25的方法，其中所述噬菌体不展示哺乳动物细胞内化信号。
27.权利要求M或25的方法，其中所述噬菌体是WT噬菌体。
28.权利要求27的方法，其中所述噬菌体是UV照射的噬菌体。
29.一种通过向有此需要的患者共施用以下各项来治疗患有或易感帕金森病的患者的方法a)第一丝状噬菌体，其展示针对促炎细胞因子的抗体；和b)第二丝状噬菌体，其中所述第二丝状噬菌体不展示(i)哺乳动物细胞内化信号； (ii) α-突触核蛋白抗原或α-突触核蛋白抗体；(iii) β-淀粉状抗原或β-淀粉状抗体； 或(iv)针对促炎细胞因子的抗体。
30.权利要求四的方法，其中所述第一噬菌体不展示哺乳动物细胞内化信号。
31.权利要求四或30的方法，其中所述第二噬菌体是WT噬菌体。
32.权利要求31的方法，其中所述第二噬菌体是UV照射的噬菌体。
33.权利要求25-32中任一项的方法，其中展示结合促炎细胞因子的抗体的丝状噬菌体进一步展示蛋白A或蛋白G的抗体结合部分，并且其中结合促炎细胞因子的抗体与蛋白 A或蛋白G的抗体结合部分结合。
34.权利要求25-33中任一项的方法，其中所述结合促炎细胞因子的抗体是结合IL-6 的抗体。
35.权利要求M-34中任一项的方法，其中各噬菌体通过鼻内施用。
36.权利要求M-35中任一项的方法，其中各丝状噬菌体独立地选自M13、fl和fd噬菌体，及其混合物。
37.权利要求36的方法，其中各丝状噬菌体是M13。
全文摘要
本发明涉及展示特异性结合促炎细胞因子的抗体的丝状噬菌体单独地或与不展示哺乳动物细胞内化信号的丝状噬菌体组合地治疗帕金森病的应用。
文档编号A61K35/76GK102223887SQ200980146744
公开日2011年10月19日 申请日期2009年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者海姆·M·戴门特, 贝卡·所罗门 申请人:台拉维夫大学拉莫特