专利名称：组合物、口腔护理产品及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及生物矿物组合物和口腔护理产品。本发明进一步涉及制备和使用生物矿物组合物和口腔护理产品的方法。
背景技术：
近年来，在纳米(生物)技术中，参与纳米级范围生物矿化的自然过程的生物分子开始逐渐引起人们的兴趣。“自然纳米技术”的实例是(i)珍珠，其由碳酸钙晶体(即文石)组成，或(ii)鲍鱼-贻贝的壳，其由方解石晶体构成，该晶体通过结合特定蛋白产生新的有利的物质性质，或(iii) mOphiocoma wendtii的光学微型透镜系统。特别地，一些海生生物或水生生物，比如硅藻和硅质海绵具有由生物起源的二氧化硅建立骨架结构的能力。硅质海绵具有在在室温下，在温和条件下，采用酶机制形成二氧化硅(“生物硅”) 的令人惊奇的能力，如在 Siimizu 等人的Natl Acad. Sci USA 95，6234-6238 (1998)中公开的。相反，用于制备二氧化硅的无机化学方法需要使用高温和更侵袭性化学品。由海绵产生的生物硅用于建立针状骨架成分(即，“骨针”)，如例如在MUller等 K, FEBS J. 272，3838-3852 Q005)和 Miiller 等人，Iicro/ 37，107-120 Q006)中公开的。涉及的酶，即，硅聚合酶(silicateins)可以是从海生硅质海绵寄居蟹皮海绵 (Suberites i/ofiMwcWa)和大量其它海绵克隆的，如在 Krasko 等人，^/ro/7. J. Biochem. 267:4878-4887 QOOO)中公开的。硅聚合酶及其技术描述在例如PCT/US99/30601、DE 1003 72 70 Al、PCT/EP01/084 23、EP 132 0624 和 US 7，169,589 B2 (即，提及硅聚合酶-α和硅聚合酶)；DE 103 52 433.9 (提及硅聚合酶-β)；以及DE 102006001759. 5 (即，公开了 Lubomirskia baicalensis的四种硅聚合酶同工型)。利用上述酶，有可能在室温下制备纳米级的生物硅，如公开在例如khroder等人， J. Biol. Chem. 281，12001-12009 O006)和 Schroder 等人，Μ ΓΝ··5·56 ·^Α3Λ· 94， 339-359 (2007)中。通过固定的蛋白质形成生物硅可以利用各种技术来证实，所述技术包括，但不限于如公开在Tahir等人，Chem. Commun. 2848-2849 Q004)中的“扫描力显微镜术”(SFM)和“扫描电子显微镜术”(SEM)。硅聚合酶同时具有合成代谢(即，二氧化硅-聚合酶)和分解代谢(即，二氧化硅-酯酶)活性，因此，其使得可能制备柔性二氧化硅壳，经由表达的硅聚合酶的酯酶活性可以对其修饰或打孔。硅聚合酶的二氧化硅-酯酶活性所基于的机制显示在图IA中。低聚/多硅酸盐基质的水解是基于硅聚合酶活性中心中丝氨酸基团的羟基亲核攻击聚合物基质的硅原子之一。在这种情况下，聚合物硅酸盐中的氧键裂解。该反应受到活性中心中组氨酸的咪唑-氮和丝氨酸的羟基之间氢桥键形成的促进，其导致丝氨酸-氧的亲核性增加。酶和基质之间的过渡性共价键被水所水解，释放出硅酸。图IB显示硅聚合酶的二氧化硅-聚合酶活性的机制。该酶活性中心中的组氨酸基团起酸-碱催化剂的作用。将质子从原硅酸转移到咪唑-氮导致形成活性硅酸盐物种，其能够攻击第二个原硅酸盐分子。然后，形成的带负电、五价中间体化合物转变成焦硅酸(或高级低聚物)，释放出水，其是由来自组氨酸基团的质子化咪唑环的质子转移所形成的。
大量出版物公开了硅聚合酶的如下用途(i)在多种基质上形成无机涂层，所述基质包括金属、金属氧化物、塑料、碳纤维、羊毛纤维、棉纤维、药品添加剂(例如淀粉)和半导体载体(参见例如，MUller等人，美国专利申请公布No. 2007/0280921，第W115]至
段，和MUller等人，美国专利No. 7，169，589，第10栏，第55-59行)，(ii)改良石头的外表面(参见，Miiller等人，美国专利No. 7，229，807，第16栏，第6_15行)，和(iii)体外形成二氧化硅和硅氧烷聚合物网状结构(参见，Morse等人的美国专利No. 6，670，438)。进一步，Goldberg等人的美国专利申请公布No. 2007/ 0238808公开了生物催化剂(例如硅聚合酶)形成包括聚合基质材料和在该聚合基质材料上和/或其内部的生物催化剂(例如硅聚合酶)的牙齿修复材料的用途，其中所述生物催化剂促进矿物质(例如二氧化硅)沉积在聚合基质材料上和/或其内部。该聚合基质材料通常是热固性(即可硬化的)材料(参见，第W056]段)，在聚合化和/或固化之后，形成得到的牙齿材料的整体部件。所公开的牙齿材料可以用作修复物和牙齿结构之间的粘合剂，如公开在第W089]段中的。一直努力开发酶/生物催化剂比如硅聚合酶的另外的用途，以及包含这样的酶/ 生物催化剂的组合物。进一步，一直努力开发利用酶/生物催化剂比如硅聚合酶的催化性质，和向牙齿提供保护/修复性质而不会在牙齿上形成含有机聚合物层的生物硅产品。发明简述
本发明涉及包含酶和前体物质的组合物的发现，所述前体物质被所述酶催化形成无机涂层物质(例如二氧化硅)。该组合物可以使用在其中期望无机或矿物涂层的多种应用中， 并且特别地用作能够在动物牙齿上形成无机涂层的牙齿护理组合物(即，应用在动物牙齿上的组合物)。在一个示例性的实施方案中，本发明的组合物包括(i)酶，和(ii)前体物质，其能够被所述酶催化形成无机涂层物质。所述组合物也可包括保护剂，其从化学上或物理上保护所述酶避开该混合物内的前体物质，以便阻止酶与前体物质过早反应，或口腔护理组分比如含磷化合物、清洗剂(例如，表面活性剂比如月桂基硫酸钠)、抛光剂、磨擦剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂(例如聚乙二醇)、增稠剂或其混合物。所述组合物也可包括加速剂、促进剂、活化剂或其混合物，其起增加前体物质聚合速率的作用。在另一个示例性的实施方案，本发明的组合物包括口腔护理组合物，其中所述口腔护理组合物包括一种混合物，其包括酶；前体物质，其能够与所述酶反应形成无机涂层物质；和保护剂，该保护剂分开酶与所述混合物中的前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。示例性的口腔护理组合物可包括任何口腔护理物质或装置或与其一起使用，所述任何口腔护理物质或装置包括，但不限于牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、护齿器或牙托、牙齿贴片、牙齿排列矫正器、食品、饮料、糖锭、或其它可食用物质，及其组合。另外，本发明的组合物可以与任何口腔护理产品一起用于任何动物。这样的物质可包括典型的成分， 包括，但不限于含磷化合物、清洗剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂、填充金属、水或其混合物。理想地，所述牙齿护理组合物包括可涂层的组合物，即，具有使用常规涂布方法能够使所述组合物涂布在基质上的粘度的组合物。
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在另一个示例性的实施方案中，本发明的组合物包括口腔护理组合物，其中所述口腔护理组合物包括含有酶和能够与该酶反应形成无机涂层物质的前体物质的牙膏。所述牙膏可进一步包括另外的成分，比如在牙膏中通常存在的那些，以及在牙膏通常不存在的那些(例如保护剂比如聚交酯、加速剂、促进剂、活化剂或其混合物)。合适的另外的成分可包括，但不限于保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶与该混合物之内的前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应，含磷化合物、清洗剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂、填充金属和水。在包括本发明的口腔护理组合物的任一种公开的组合物中，所述酶可以包括能够催化前体物质的任何酶，比如例如硅聚合酶、组织蛋白酶L、木瓜蛋白酶等。所述前体物质可以包括例如金属氧化物，比如二氧化硅、硅酸盐、硅酸、硅醇盐、或具有通式Si (R1)m(R2)n(R3) P(R4)tl的化合物、其缩合产物或其混合物，其中礼、&、R3和R4各自独立地包括H、OH、C1至 C12烷烃基，或C1至C12烷氧基；m、n、p和q各自独立地为0或1至4的整数；和(m + η + ρ + q) =4。在本发明的一个示例性的实施方案中，这些物质可以是对任何动物无毒的或无害的。在任一种公开的组合物中，比如本发明的口腔护理组合物，所述含磷化合物可以包括例如焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、焦磷酸二钠或两种或多种磷酸盐的组合，而清洁剂可以包括例如表面活性剂比如十二烷基硫酸钠。本发明还涉及制备包含酶和能够与该酶反应形成无机涂层物质的前体物质的组合物的方法。在一个示例性的实施方案中，制备组合物的方法包括形成包含如下组分的混合物(i)酶，( )前体物质，其能够与所述酶反应形成无机涂层物质，和(iii)至少一种另外的组分或口腔护理组合物的组分，所述另外的组分包括保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶与所述混合物中的前体物质，以便阻止所述酶与前体物质的过早反应。另外的组分可以包括至少一种加速剂、促进剂、含磷化合物、清洁剂、磨擦剂、抛光剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂或其混合物。在另一个示例性的实施方案中，制备组合物的方法包括形成口腔护理组合物。一种制备口腔护理组合物的示例性的方法包括形成包含下述组分的混合物酶；前体物质， 其能够被所述酶催化形成无机涂层物质；和保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶和在该混合物内的前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。制备口腔护理组合物的方法可以进一步包括向该混合物中加入一种或多种另外的成分，其中一种或多种另外的成分包括，但不限于至少一种促进剂、加速剂、含磷化合物、清洁剂、抛光剂、磨擦剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂、填充金属、水或其任意组合。在另一个示例性的实施方案中，制备组合物的方法包括形成口腔护理组合物，其中该口腔护理组合物包括牙膏。制备牙膏的方法包括形成包括下述组分的混合物酶，和能够与该酶反应形成无机涂层物质的前体物质。制备牙膏的方法可以进一步包括向该混合物中加入至少一种另外的成分，其中至少一种另外的成分可以包括，但不限于保护剂，含磷化合物、抛光剂、磨擦剂、促进剂、加速剂、清洁剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂、填充金属、水或其任意组合，其中所述保护剂从化学上或物理上分开所述酶与该混合物之内的前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。
本发明进一步涉及在基质上形成涂层的方法。在一个示例性的实施方案中，在基质上形成涂层的方法包括用包含下述组分的混合物涂布至少一部分基质酶；前体物质， 其能够被所述酶催化形成无机涂层物质；和保护剂，其从化学上或物理上分开在该混合物内的所述酶和所述前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。在基质上形成涂层的方法可以进一步包括一个或多个另外的步骤，该步骤包括，但不限于从所述酶中除去保护剂；使该酶与前体物质接触，以便引发酶与前体物质之间的反应；和向该混合物中加入至少一种另外的反应性或非反应性成分，其中至少一种另外的反应性或非反应性成分包括，但不限于含磷化合物、促进剂、加速剂、清洁剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味添加剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂、填充金属、水或其任意组合。所述基质可以包括各种基质，包括，但不限于牙齿和骨。本发明进一步涉及经由上述方法形成的无机涂层和涂布的基质。在一个示例性的实施方案中，所述涂层包括生物硅和/或羟基磷灰石，所述涂布的基质包括至少部分地涂布有包括生物硅和/或羟基磷灰石的涂层的牙齿或骨。本发明可以进一步用于填充牙齿和骨骼中的裂缝或裂痕，以便修复牙齿或骨。在回顾下述公开实施方案的详细说明和附加权利要求书之后，本发明的这些及其它特征和优点将变得显而易见。附图
简述
图IA描述酶硅聚合酶的二氧化硅-酯酶活性的机制； 图IB描述酶硅聚合酶的二氧化硅-聚合酶活性的机制； 图2A-2D描述使用本发明的组合物在牙齿上提供保护性无机涂层的示例性步骤； 图3描述编码在下述实施例2中形成的羟磷灰石-结合硅聚合酶-α蛋白的cDNA的扩增；
图4描述扩增子与细菌表达载体pTRC-His2经由如在下述实施例2中描述的T/ A克隆的连接；
图5A-5D描述在用如下述实施例5中描述的本发明的无机涂层物质涂布之前和之后， 在两个不同放大倍数下，牙齿的示例性的扫描电子显微镜(SEM)图像；和
图6描述如在实施例5中描述的，在猪牙齿上形成的生物硅/生物磷灰石层的EDX (“能量色散X射线”)谱图。发明详述
为了促进理解本发明的原理，下面描述本发明的具体实施方案并使用特定术语描述具体实施方案。然而，应当理解本发明的范围并不意味着受到使用特定术语的限制。所讨论的本发明原理的变更、进一步改良和这样的进一步应用都预期是本发明所属领域的普通技术人员通常能想到的。必须指出，如在本说明书和附加权利要求书中使用的单数形式“一个(种)”和“所述的”包括复数形式，除非上下文另有清楚的规定。因此，例如，提及“氧化物”包括这样的氧化物的复数形式，提及“氧化物”包括提及一个或多个氧化物和本领域技术人员已知的其
等同物等。在对本公开的实施方案的描述中，使用“约”来修饰例如某种组分在组合物中的量、浓度、体积、处理温度、处理时间、回收率或产率、流速等值及其范围时，指可能例如通过典型的测量和处理程序、通过这些方法中的偶然误差、通过用于进行这些方法的组分的差异以及类似的近似理由而产生的数值变化。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的制剂的老化而导致不同的量，和由于具有特定初始浓度或混合物的制剂的混合或处理而导致不同的量。无论是否用"约"修饰，附加的权利要求书都包括这些量的等同物。如本文使用的术语“金属氧化物”定义二元含氧化合物，其中所述金属为阳离子， 所述氧化物为阴离子。金属也可包括类金属。金属包括元素周期表上从硼到钋所画对角线左边的那些元素。类金属或半金属包括位于此线上的那些元素。金属氧化物的实例包括二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、氧化锆等，及其混合物。优选地，所述金属氧化物是无定形的，比如例如沉淀法二氧化硅。如本文使用的术语“矿物质”或“无机物质”定义为由金属氧化物组成的物质。如本文使用的术语“酶”定义为由在植物或动物细胞中形成的或合成的多种蛋白组成的物质，其在引发或加速某些化学反应中起有机催化剂的作用。本发明涉及组合物，其包含酶和能够被该酶催化形成无机涂层物质(例如二氧化硅)的前体物质。本发明进一步涉及制备包含酶和能够被该酶催化形成无机涂层物质的前体物质的组合物的方法。本发明甚至进一步涉及在基质上形成涂层的方法，其中所述涂层包括(i)酶，和能够被该酶催化形成无机涂层物质的前体物质，或(ii)所述酶和所述前体物质之间反应的反应产物(例如，无机涂层物质形式的反应产物)。本发明甚至进一步涉及涂层和涂布的基质，比如涂布的牙齿或骨。本发明的组合物可以提供之前组合物和其形成的涂层领域没有提到的一个或多个益处和/或技术优势。例如，公开的组合物和其形成的最终涂层不需要聚合物基质物质或潜在地毒性组合物组分(例如，不适用于人类消费品的组分)。进一步，得到的无机涂层物质(例如，生物硅和/或羟基-磷灰石)提供优越的抗拉强度、韧性、自我修复能力和对给定基质(例如牙齿)的粘附力。这样的涂层在化学组成上与天然牙质/釉质几乎不能区别，且不包含潜在的毒性聚合物基质物质。示例性的组合物和组合物组分的说明提供如下 I.组合物
本发明的组合物可以包括大量独立组分。独立组分和独立组分组合的说明提供如下。 进一步，本发明的组合物可以以多种形式存在。组合物类型的说明也提供如下。A.组合物组分
本发明的组合物可以包括一种或多种下述组分。1.酶
本发明的组合物包括至少一种酶。合适的酶包括能够催化前体物质导致形成无机纳米层的酶。合适的酶包括二氧化硅蛋白质，比如硅聚合酶，和类似蛋白质，比如组织蛋白酶、木瓜蛋白酶等，及其突变体。在某些实施方案中，所述酶包括硅聚合酶，比如硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y ；包含动物、细菌、植物或真菌的硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y结构域的多肽，其与下述SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所显示的序列具有至少25%的序列相似性；或其同源多肽。在其它实施方案中，所述酶包括包含硅聚合酶-α、硅聚合酶或硅聚合酶-Y结构域的上述多肽，其与SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所显示的序列和低聚谷氨酸序列具有至少25%的序列相似性。合适的酶(例如，来自符合SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3的寄居蟹皮海绵 iSuberites)的硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ，其同源多肽，即在硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y结构域的氨基酸序列中的多肽，其与显示在例如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中的序列具有至少25%的序列相似性)可以是从天然形式的动物、细菌、植物或真菌提取的，或者可以合成制备，或者其中所述多肽存在于原核细胞或真核细胞提取物中或细胞溶胞产物中。所述细胞提取物或溶胞产物可以由间接体内或间接体外的细胞，例如由重组细菌细胞或海绵产生。可以根据现有技术中已知的常规方法纯化多肽，因而，其可以不含其它蛋白质。编码来自寄居触皮海绵(5 domuncula)的硅聚合酶-α多肽或硅聚合酶-β多肽以及来自核苷酸序列的多肽的cDNAs的性质描述在例如PCT/US99/ 3060UDE 10037270 AUPCT/ EPOl/ 08423和DE 103 52 433. 9中，将每篇的主题都全部引入作为参考。一种或多种酶在本发明的组合物中的存在量通常为基于该组合物的总重量计超过0重量％ (wt%)，至多50 wt%0在一些示例性的实施方案中，所述组合物包括一种或多种酶，含量为基于该组合物总重量计约0.0001 wt%至约10 wt%，更通常地为约0.001衬％至约5 wt%，甚至更通常地为约0. 01 wt%至约1 wt%。Z前体物质
本发明的组合物也包括至少一种前体物质，其能够被所述酶催化形成无机涂层物质。在某些实施方案中，所述前体物质包括金属氧化物，比如二氧化硅、硅酸盐、硅酸、 硅醇盐或具有通式Si(R1)m(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其缩合产物或其混合物，其中RpI^R3 和R4各自独立地包括IC1至C12烷烃基，或C1至C12烷氧基；m、n、p和q各自独立地为0或 1至4的整数；和(m + η + ρ + q) = 4。一些示例性的前体物质包括，但不限于硅酸、单烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基甲硅烷醇、四烷氧基硅烷及硅酸的螯合复合物。一种或多种前体物质可以加入到本发明的组合物中。一种或多种前体物质在本发明的组合物中的存在量通常为基于组合物的总重量计超过0重量％ (wt%)，至多约80 wt%0 在某些示例性的实施方案中，所述组合物包括一种或多种前体物质，含量为基于该组合物总重量计约0.01 wt%至约30 wt%，更通常地为约0. 1 wt%至约20 wt%，并且甚至更通常地为约1 wt%至约10 wt%。3.保护剂
本发明的组合物可以进一步包括至少一种保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶与给定混合物中的前体物质，以便阻止所述酶与前体物质的过早反应。保护剂可以比如通过包封、分离或包含所述酶而从物理上分离所述酶。保护剂也可以比如通过分子内键合或分子间键合或位阻等而从化学上保护所述酶。通常，当存在时，使用一种或多种保护剂保护酶，而不保护前体物质；然而，可以使用一种或多种保护剂单独地保护酶、单独地保护前体物质或同时保护酶和前体物质。合适的保护剂包括，但不限于聚交酯、聚乙烯醇、海藻酸盐、共聚物比如聚(丙交酯-共-ε-己内酯)。最好是，保护剂是(i)水溶性的，(ii)在唾液的存在下可降解，或 (iii)同时具有⑴和(ii)。
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当存在时，一种或多种保护剂在本发明的组合物中的存在量通常为基于组合物的总重量计超过0重量％ (wt%)，至多约60 wt%0在某些示例性的实施方案中，所述组合物包括一种或多种保护剂，含量为基于该组合物总重量计约0. 1衬％至约30 wt%，更通常地为约 1 wt%至约20 wt%，并且甚至更通常地为约2 wt%至约15 wt%。4.含磷化合物
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种含磷化合物。合适的含磷化合物包括，但不限于磷酸盐，比如磷酸钠、磷酸二钠、磷酸三钠、磷酸四钠、偏磷酸钠、三磷酸五钠、单氟磷酸钠、单氟磷酸盐、十二烷基磷酸钠(月桂基磷酸钠)、磷酸钙钠、磷酸四钾、三磷酸五钾、焦磷酸二钠、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、磷酸锡(磷酸亚锡)和焦磷酸锡(焦磷酸亚锡)。当存在时，一种或多种含磷化合物在本发明的组合物中的存在量通常为基于组合物的总重量计超过0重量％ (wt%)，至多约90 wt%0在某些示例性的实施方案中，所述组合物包括一种或多种含磷化合物，含量为基于该组合物总重量计约0. lwt%至约50 wt%，更通常地为约1 wt%至约30 wt%，并且甚至更通常地为约1 wt%至约20 wt%。5.促进剂/加速剂
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种促进剂、加速剂或活化剂，其能够增强酶促反应。用于增强酶促反应的试剂可以是活化所述酶亲核攻击前体物质的那些。合适的试剂包括，但不限于各种金属、金属盐、金属氧化物、及其混合物。实例包括i^、Se、F、Al盐及其氧化物。当存在时，一种或多种促进剂，加速剂或活化剂在本发明的组合物中的存在量通常为基于组合物的总重量计超过0重量％ (wt%)，至多约30 wt%。在某些示例性的实施方案中，所述组合物包括一种或多种促进剂、加速剂或活化剂，含量为基于该组合物总重量计约 0. 001 wt%至约20 wt%，更通常地为约0. 01 wt%至约10 wt%，并且甚至更通常地为约0. 1 wt% 至Ij 约 5 wt%。6.磨擦剂和抛光剂
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种磨擦剂和抛光剂。所述磨擦剂和抛光剂可以除去任何过量的无机物质。合适的磨擦剂试剂包括金属氧化物颗粒，比如硅胶、沉淀二氧化硅或煅制二氧化硅、或其混合物。合适的抛光剂包括金属氧化物颗粒，比如胶体二氧化硅。当存在时，一种或多种磨擦剂和抛光剂在本发明的组合物中的存在量通常为基于组合物的总重量计超过0重量％ (wt%)，至多约30 wt%0在某些示例性的实施方案中，所述组合物包括一种或多种磨擦剂和抛光剂，含量为基于该组合物总重量计约0. 001wt%至约 20 wt%，更通常地为约0. 01 wt%至约10 wt%，并且甚至更通常地为约0. 1 wt%到约5 wt%。7.另外的成分
本发明的组合物可以进一步包括一种或多种另外的组分。适合用在本发明的组合物中的另外的组分包括，但不限于清洁剂、牙齿增白剂、呼吸清新剂、调味剂或甜味剂、芳香剂、 着色剂、PH调节剂、抗微生物剂、发泡剂、增稠剂、用于将酶结合到另一种组合物组分(例如保护剂)的双功能连接剂、生产加工助剂及其组合。大量市售可获得的清洁剂可以用在本发明的组合物中。合适的市售清洁剂(即表面活性剂)包括，但不限于从M^an (Northfield, IL)可买到的十二烷基硫酸钠。合适的调味剂包括，但不限于薄荷调味剂(例如绿薄荷或欧薄荷调味剂)、橙调味齐U、樱桃调味剂、酸橙调味剂、泡泡糖调味剂等。合适的甜味剂包括，但不限于葡萄糖、山梨醇、三氯半乳蔗糖、纽甜(neo-tame)、乙酰舒泛钾等。在本发明的一个示例性的实施方案中， 本发明的组合物包括山梨醇作为甜味剂。合适的芳香剂包括，但不限于柠檬、橙、薄荷、松树、青苹果、桉树、茉莉和各种 spa-like 香料。合适的着色剂包括，但不限于FD& C Blue #_1、FD & C Green #_3、FD & C Yellow #_5和FD & C Red #_40。在本发明的一个示例性的实施方案中，本发明的组合物包括FD & C Blue #_1 或 FD & C Yellow #_5。适合用于本发明的pH调节剂包括，但不限于柠檬酸、磷酸、碳酸钠、柠檬酸钠、苯甲酸钠、苯甲酸、柠檬酸钠、柠檬酸银、柠檬酸二氢银或其组合。在一个示例性的实施方案中，所述PH调节剂包括柠檬酸(即2-羟基-1，，2，3-丙烷三羧酸)、磷酸、苯甲酸钠或其任
思组合。适合用于本发明的增稠剂或胶凝剂包括，但不限于碱金属淀粉、羧基纤维素化合物、纤维素胶、黄原胶、聚丙烯酸及所有天然存在的树胶和淀粉。如本文使用的上述增稠剂或胶凝剂包括交联的和未交联的增稠剂或胶凝剂。例如，任何上述的淀粉、树胶、纤维素基化合物或聚合物都可以经由给定化合物或聚合物之内的键合力或经由加入一种或多种交联剂来交联。合适的生产加工助剂包括，但不限于聚乙二醇、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、 麦芽糖糊精等。在本发明的一个示例性的实施方案中，本发明的组合物包括聚乙二醇。在本发明中可以使用大量市售的另外的组分。合适的市售的另外组分包括，但不限于泡沫增强剂比如可以从M^an (Northfield, IL)买到的商品名ΝΙΝΟΙ；的泡沫增强剂；和牙齿保护剂，比如可以从Univar USA (Bellevue, WA)买到的氟化钠。在本发明中可以使用许多种市售的增稠剂。合适的市售增稠剂包括，但不限于可以从 W. R. Grace & Co.-Conn.购得的硅胶；Sigma Aldrich (St. Louis, MO)以商品名 Sigma Aldrich G 1253 销售的黄原胶；和 Dow Chemical ((Midland, MI)以商品名 METH0CEL 比如METH0CEL 40-202销售的羟丙基甲基纤维素。在本发明中可以使用许多种市售的加工助剂。合适的市售的加工助剂包括，但不限于可以从 Dow Chemical (Midland, MI)购得的 CARB0WAX 8000 和从 Union Carbide (Houston, TX)购得的 PEG 3350o每种另外的组分的存在量可以为基于给定组合物的总重量计超过0至约60 wt%0 在某些示例性的实施方案中，当存在时，每种另外的组分在给定组合物中的存在量为基于该组合物总重量计约0. 01wt%至约50 wt%，更通常地为约0. 05 wt%至约40 wt%，并且甚至更通常地为约0. 1 wt%至约30 wt%。B.组合物形式
本发明的组合物可以配制成具有一种或多种下述形式。1.粉末
本发明的组合物可以配制成粉末混合物。
2.液体和悬浮液
本发明的组合物也可以配制成具有液体基质和悬浮在该液体基质中的颗粒材料的溶液、分散液或悬浮液。. .3.糊剂和乳膏剂
本发明的组合物可以配制形成糊剂比如牙膏或乳膏剂。4.气雾剂
本发明的组合物可以配制形成气雾剂。II制备组合物、无机涂层和涂布的基质的方法
技术领域：
本发明进一步涉及制备包含酶和能够与该酶反应形成无机涂层物质的前体物质的组合物的方法。所述制备组合物的方法可以包括形成包括如下组分的混合物(i)酶，和(ii) 前体物质，其能够与所述酶反应形成无机涂层物质。可以进一步将一种或多种另外的组合物组分加入到包括本文公开的一种或多种组分的任意组合的混合物中。在一个示例性的实施方案中，制备组合物的方法包括形成口腔护理组合物，其中所述方法包括形成包含下述组分的混合物酶；前体物质，其能够与所述酶反应形成无机涂层物质；和保护剂，其从化学上或物理上保护所述酶免于接触该混合物内的所述前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。制备口腔护理组合物的方法可以进一步包括向所述混合物中加入至少一种另外的成分，其中所述至少一种另外的成分包括，但不限于加速剂、促进剂、活化剂、磨擦剂、抛光剂、牙齿增白剂、呼吸清新剂、调味剂或甜味齐U、 芳香剂、着色剂、PH调节剂、抗微生物剂、发泡剂、增稠剂、用于将酶结合至另一种组合物组分的双功能连接剂、生产加工助剂、填充材料、含氟化物物质、含磷化合物、清洁剂、水及其任意组合。示例性的口腔护理组合物可以包括或与任何口腔护理物质或装置一起使用，其包括但不限于牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、护齿器或牙托、牙齿贴片、牙齿排列矫正器、食品、饮料、糖锭、或其它可食用物质，及其组合。组合物的制备方法可以包括形成口腔护理组合物，其中所述口腔护理组合物包括牙膏。制备牙膏的方法可以包括形成包含下述组分的混合物酶，和能够与该酶反应形成无机涂层物质的前体物质。制备牙膏的方法可以进一步包括向该混合物中加入一种或多种另外的成分，其中所述一种或多种另外的成分可以包括，但不限于保护剂，含磷化合物、清洁剂、抛光剂、磨擦剂、加速剂、促进剂、活化剂、抗微生物物质、PH调节剂、生色添加剂、香味剂、含氟化物物质、生产加工助剂、增稠剂、填充材料、水、本文公开的任何其它组分和本文公开的组分的任何组合，其中所述保护剂从化学上或物理上分开所述酶与该混合物之内的前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。在某些实施方案中，将至少一种保护剂加入到该混合物中，其中所述至少一种保护剂从化学上或物理上分开所述酶与该混合物中的前体物质，以便阻止所述酶与前体物质的过早反应。通常，至少一种保护剂将存在于该混合物中的一种或多种酶包封。然而，在某些实施方案中，可以使用一种或多种保护剂包封一种或多种酶、一种或多种前体物质或两
者ο当使用一种或多种保护剂时，化学分离所述酶与前体物质的方法包括将一种或多种酶键合到组合物中的一种或多种组分，比如一种或多种保护剂。这样的键可以是分子内键，比如共价键或离子键，或分子间键，比如氢键或偶极与偶极键(例如范德华力)。例如，
12酶可以共价键合保护剂或经由氢键键合保护剂。在其它示例性的实施方案中，可以使用双功能的连接剂将一种或多种酶键合到组合物中的一种或多种组分，比如一种或多种保护剂。所述保护剂可以是化学惰性的或反应性的，并且可以是有机的或无机的。保护酶或前体也可以通过改变pH来实现。在某些实施方案中，制备组合物的方法可以进一步包括将纳米球引入组合物中， 比如由可生物降解的聚合材料比如聚交酯形成的纳米球。在该实施方案中，一种或多种酶可以直接地或经由双功能连接剂键合到聚交酯纳米球的表面。例如，所述双功能连接剂可以包括包含次氮基三乙酸基团的聚合物，所述次氮基三乙酸基团经由络合至连接组氨酸标记的多肽键合到所述酶，所述多肽比如包括动物、细菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y结构域的多肽，其与在例如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中显示的序列具有至少25%的序列相似性。在其它的实施方案，所述酶键合至无机材料，比如金属氧化物(例如二氧化硅颗粒)。所公开的形成组合物的方法可以进一步包括使一种或多种酶和一种或多种前体物质彼此接触，以便(i)使酶与前体物质反应，和(ii)形成无机涂层物质。使一种或多种酶与一种或多种前体物质接触的步骤可以包括例如化学地或物理地从该组合物混合物之内的酶或前体物质中转移和/或除去保护剂。转移和/或除去保护剂可以包括例如利用机械作用(例如，经由刷牙步骤期间的机械摩擦)以物理方式转移保护剂，或通过增溶和/ 或降解保护剂(例如，经由刷牙步骤期间与唾液中的淀粉酶接触)除去保护剂。从所述酶或前体以化学方式除去保护剂可以通过反应、调节温度或PH等来进行。本发明还涉及形成涂层的方法和形成涂布的基质的方法。在一个示例性的实施方案中，公开了一种形成涂层的方法，其中所述方法包括将任一种上述组合物施加于基质上。 得到的带涂层的基质包括用如上所述混合物(即，反应前或反应后)至少部分地涂布的基质。形成涂层的方法可以进一步包括在将所述组合物/混合物施加于基质上之前或之后， 使一种或多种酶与一种或多种前体物质接触的步骤。形成涂布的基质的方法可以进一步包括一个或多个另外的制备步骤。合适的另外的制备步骤包括，但不限于从涂布的基质中除去任何未反应的混合物组分(例如，经由漂洗或洗涤步骤)，再将任一种上述混合物施加于涂布的基质上(即，该混合物与最初或之前施加的组合物/混合物相同或不同)，使一种或多种酶与随后施加的组合物/混合物之内的一种或多种前体物质反应，并重复任一个上述步骤。优选的是，得到的无机涂层物质、涂层和涂布的基质(即，涂层在其上)包括(更优选的是，“基本上由其组成”，最好是“由其组成”)非晶形二氧化硅(二氧化硅)、羟基磷灰石或其组合。在一个实施方案中，形成涂布的基质的方法包括至少部分地涂布具有外表面、内表面或两者的牙齿。形成涂布的牙齿的方法得到至少部分地盖住牙齿的外表面、内表面或外表面和内表面两者的涂层。在任一种上述的方法中，所述酶最好包括硅聚合酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和/ 或具有低聚谷氨酸酯序列的多肽，所述前体物质最好包括金属氧化物，比如二氧化硅、硅酸盐、硅酸、硅醇盐和/或具有通式Si (R1)ffl(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其缩合产物和/或这些物质混合物，其中R1A2A3和R4各自独立地包括OHC1至C12烷烃基，或C1至C12烷氧基；m、n、p和q各自独立地为0或1至4的整数；和(m + η + ρ + q) = 4。典型地，所述酶包括硅聚合酶，比如硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ ；包含动物、细菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Υ结构域的多肽，其与下述SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 3所示的序列具有至少25%的序列相似性；或与其同源的多肽。在其它的实施方案中，所述酶包括包含硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y结构域的上述多肽， 其与如在SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中所显示的序列和低聚谷氨酸酯序列具有至少25% 的序列相似性。典型地，所述前体物质包括硅酸、单烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基甲硅烷醇、四烷氧基硅烷及硅酸的螯合复合物。进一步，在任一种上述方法中，所述方法可以进一步包括向所述混合物中加入一种或多种含磷化合物。一种或多种含磷化合物可以进一步与一种或多种酶反应，形成羟基磷灰石。在形成其中基质为牙齿的涂布的基质的方法中，该混合物最好包括一种或多种含磷化合物。合适的含磷化合物包括，但不限于磷酸盐，比如磷酸钠、磷酸二钠、磷酸三钠、磷酸四钠、偏磷酸钠、三磷酸五钠、单氟磷酸钠、单氟磷酸盐、十二烷基磷酸钠(月桂基磷酸钠)、磷酸钙钠、磷酸四钾、三磷酸五钾、焦磷酸二钠、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、磷酸锡(磷酸亚锡)和焦磷酸锡(焦磷酸亚锡)。本发明的组合物可以进一步包括至少一种保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶与给定混合物中的前体物质，以便阻止所述酶与前体物质的过早反应。保护剂可以比如通过包封、分离或包含所述酶而从物理上分离所述酶。保护剂也可以比如通过分子内键合或分子间键合或位阻等而从化学上保护所述酶。通常，当存在时，使用一种或多种保护剂保护酶，而不保护前体物质；然而，可以使用一种或多种保护剂单独地保护酶、单独地保护前体物质或同时保护酶和前体物质。一种用于化学上分开酶与前体物质的示例性的方法可以包括将一种或多种酶键合到组合物中的一种或多种组分，比如一种或多种保护剂。这样的键可以是分子内键，比如共价键或离子键，或分子间键，比如氢键或偶极与偶极键(例如， 范德华力)。例如，酶可以共价键合保护剂或经由氢键键合保护剂。在其它示例性的实施方案中，可以使用双功能的连接剂将一种或多种酶键合到组合物中的一种或多种组分，比如一种或多种保护剂。所述保护剂可以是化学惰性的或反应性的，并且可以是有机的或无机的。保护酶或前体也可以通过改变PH来实现。[00891合适的保护剂包括，但不限于聚交酯、聚乙烯醇、海藻酸盐、共聚物比如聚 (丙交酯-共己内酯。最好是，保护剂是⑴水溶性的，( )在唾液存在下可降解的， 或( )同时具有⑴和(ii)。本发明的组合物可以进一步包括一种或多种能够增强酶促反应的促进剂、加速剂或活化剂，以及如本文提及的其它另外的组分。III.应用/用途
如上讨论的，本发明的组合物可以用于在基质上形成涂层。合适的基质包括，但不限于牙齿、骨等。在一个示例性的实施方案中，本发明的组合物用于形成生物活性的口腔护理产品，其封闭和保护硬的牙齿组织(釉质/牙质)。所述组合物引起酶催化形成由非晶形二氧化硅(生物硅)组成的纳米层，因而，闭合了釉质/牙质中的裂痕。对于酶催化而言，使用的多肽最好是上述包括动物、细菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y 结构域的多肽，其与在例如SEQ ID No. 1或SEQID No. 3中显示的序列具有至少25%的序列相似性。在某些示例性的实施方案中，本发明的组合物用于形成生物活性的口腔护理产品，其封闭和保护硬的牙齿组织(釉质/牙质)，其中该组合物引起酶催化形成由非晶形二氧化硅(生物硅)和生物磷灰石组成的纳米层。所述生物磷灰石与生物硅一起闭合齿面的釉质/牙质中的裂痕。示例性的口腔护理组合物可以包括或与任何口腔护理物质或装置一起使用，其包括但不限于牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、护齿器或牙托、牙齿贴片、牙齿排列矫正器、食品、饮料、糖锭、或其它可食用物质，及其组合。另外，本发明的组合物可以与用于任何动物的任何口腔护理产品一起使用。图2A-2D描述使用本发明的组合物在牙齿上提供保护性无机涂层的示例性步骤。 如图2A所示，可以将包括酶20 (例如硅聚合酶)、前体物质(例如二氧化硅)22和含磷酸盐化合物25的牙膏组合物10递送到牙齿12上具有裂痕13和龋15的釉质11周围。在酶20 催化的第1阶段中，硅聚合酶形成的二氧化硅构建块在釉质11的上表面19上形成生物硅的纳米级层17，部分地或完全地闭合和封闭龋污染的裂痕13，如图2B所示。形成龋15的兼性需氧菌被切断氧气和葡萄糖，随时间逐渐败坏。如图2C所示，磷酸盐构建块在生物硅层17上形成生物羟基磷灰石18，得到层21 形式的与釉质相同的物质。如图2D所示，在最终阶段，二氧化硅清洁体27，比如磨擦剂或抛光金属氧化物颗粒(没有显示在上图中)，其是牙膏10的一种可能的组分，可以从釉质11 除去任何剩余的生物羟基磷灰石层21，但是留下沉积在裂痕13之内的生物羟基磷灰石18 的层19。本发明方法的一个优点是其使有可能用二氧化硅纳米层(例如，生物硅17的纳米级层)获得齿面(例如，釉质11的上表面19)的致密和紧紧粘附的封闭，其也引起甚至最细微的裂痕的封闭。筛分酶形成的生物硅纳米颗粒，以便(i)穿透最细微的裂痕，比如具有最小尺寸约20纳米(nm)的裂痕，和(ii)沉积在裂痕(例如裂痕13)的侧壁代表的内表面上。与本发明中形成的酶促形成的生物硅纳米颗粒相比，在许多牙膏中作为磨料存在的二氧化硅颗粒不能闭合细微裂痕，因为其尺寸特别是平均最小尺寸(例如直径)为至少 20 nm。生物硅纳米颗粒穿透并随后形成磷灰石沉积物，闭合裂痕，生成龋的细菌比如任选的厌氧性变异葡萄球菌Staphylococcus mutans)被切断了其需要的葡萄糖和氧气的供应。本发明的方法也可以利用上述酶和前体物质形成硅化的纳米球(例如，聚交酯纳米球)。一种或多种上述酶可以键合到大量纳米球(例如聚交酯纳米球)的表面，并沉积在牙齿周围。一种单独的组合物组分可以包括一种或多种前体物质。该一种或多种前体物质可以被另一种物质包封，或者以其它方式与酶活性纳米颗粒分离，以便使(i)纳米球 (即，位于最细微的裂痕之内)，和(ii) 一种或多种前体物质之间接触的时间延迟。当反应时，通过如下方式进行硅化(i)在纳米球的表面上形成无机涂层或部分层(例如二氧化硅壳)，或(ii)形成二氧化硅核心。作为前体物质，可以使用任一种上述前体物质(例如，硅酸、单烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基甲硅烷醇、四烷氧基硅烷、硅酸的螯合复合物)。在使用本发明的组合物的任一种上述方法中，用于酶催化(和闭合裂痕)的多肽
15包括低聚谷氨酸序列，所述酶最好包括硅聚合酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和/或具有低聚谷氨酸酯序列的多肽。进一步，在任一个上述使用本发明组合物的方法中，用于形成无机涂层物质(和闭合裂痕)的前体物质包括金属氧化物，比如二氧化硅、硅酸盐、硅酸、硅醇盐和/或具有通式Si (R1)m(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其缩合产物和/或这些物质混合物，其中 R1^ R2> R3和R4各自独立地包括OH、H、C1至C12烷烃基，或C1至C12烷氧基；m、η、ρ和q各自独立地为0或1至4的整数；和(m + η + ρ + q) = 4。通常，所述酶包括硅聚合酶，硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ ；包含动物、细菌、植物或真菌硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-Y结构域的多肽，其与如在下述SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3中显示的序列具有至少25%的序列相似性；或其同源的多肽。在其它的实施方案中，所述酶包括包含硅聚合酶-α、硅聚合酶-β或硅聚合酶-γ结构域的上述多肽，其与如SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 3显示的序列和低聚谷氨酸序列具有至少25%的序列相似性。通常，所述前体物质包括硅酸、单烷氧基硅烷三醇、二烷氧基硅烷二醇、三烷氧基硅烷醇、四烷氧基硅烷和硅酸的螯合复合物。在任一个上述使用本发明组合物的方法中，所述组合物可以配制成适合用作口腔护理产品，其为低粘性液体形式或呈高粘性糊剂或乳膏剂。所述组合物可以用于每日口腔卫生。进一步，所述组合物可以在医师指导下以调整的剂量使用，或者可以由医师以改良的形式用于在门诊过程中修复牙齿。例如，所述酶和前体可以由医师施用于患者牙齿，而不使用保护物质。通过下述实施例进一步阐述本发明，其不应当解释为以任何方式对发明的范围施加限制。相反，应当清楚地理解，在阅读了本说明书之后，可以允许各种其它实施方案、修改和其等同物存在，这些实施方案、修饰和等同物对本领域技术人员而言是显而易见的，而不背离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。
实施例试验方法
在下述实施例中使用下述试验方法。硅聚合酶活性的测定
为了测定(重组)硅聚合酶的酶活性，可以应用基于在四乙氧基甲硅烷(TEOS)水解和随后聚合之后，测量聚合的和沉淀的二氧化硅的试验。在这一点上，通常将所述酶溶于1 ml 的MOPS缓冲液(pH 6.8)中，并与1 ml的1-4.5 mmol的四乙氧基甲硅烷溶液混合。通常在室温下，进行酶促反应不同的时间。为了检测二氧化硅产物，离心出所述物质，用乙醇洗涤，并风干。然后，用1 M的 NaOH水解沉淀物。在产生的溶液中，使用钼酸盐-支持的检测方法(例如，从Merck Company 可获得的硅测定法)来定量地测量释放的硅酸盐。二氧化硅形成的测定
可以利用多种方法(即，SEM、SDS-PAGE、在外源硅酸钠或四乙氧基甲硅烷的存在下二氧化硅形成的钼酸盐测定、酶谱法等)分析硅聚合酶基因产物的功能活性、硅聚合酶介导的形成和多孔(生物)二氧化硅纳米层的物理化学特性。通过用荧光染料罗丹明123染色形成的二氧化硅颗粒(即，在形成颗粒中结合荧光染料)或利用β-硅钼酸盐-染色系统(即，硅酸盐检测试剂“Aquaquant试剂盒”)，如公开在 Cha 等人，Natl. Acad. Sci USA 96:361-365 (1999)；和 Krasko 等人， J. Biochem. 267:4878-4887 (2000)中的，测定生物硅的形成。另外，可以利用EDX( “能量色散X射线”)分析来分析样品。实施例1-重组硅聚合酶多肽的牛成
从寄居蟹皮海绵Suberites domuncula的cDNA库分离出硅聚合酶-α和硅聚合酶-β 的 cDNAs，所述海绵 Suberites domuncula 是例如在 pBK-CMV 载体(从 Stratagene (La Jolla, CA)可获得的)中生成的。利用聚合酶链反应(PCR)，使用合适的引物，获得对应于成熟蛋白质的开放阅读框(ORF)。重组蛋白质(硅聚合酶-α ；SEQ ID No. 1;硅聚合酶-β SEQ ID No. 3)的生成是在大肠杆菌中进行的(尽管在酵母菌和哺乳动物细胞中生成是另外的选择)。将相应的cDNA克隆在表达载体例如pQE-30中。在大肠杆菌转化之后，用IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导蛋白质的表达(如描述在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1995)中。重组蛋白质的纯化在 Ni-NTA基质上借助组氨酸标记进行。(应当注意到在低聚组氨酸和硅聚合酶之间，可以引入对应于肠激酶缺口位点的序列。然后可以用肠激酶切割融合蛋白)。使用低聚组氨酸表达载体pBAD/glllA (从hvitrogen (Carlsbad, CA)购得)在大肠杆菌中生产重组硅聚合酶，其中，基于基因III的信号序列，重组蛋白质被分泌到周质间隙(periplasmatic space)中。利用PCR，使用下述引物(硅聚合酶-α的短形式) 扩增编码硅聚合酶-α的cDNA序列(S卩，如下显示的SEQ ID No. 2) :(i)正向引物TAT CC ATG GAC TAC CCT GAA GCT GTA GAC TGG AGA ACC,和(ii)反向引物TAT T CTA GA A TTA TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT AGC ；并克隆在pBAD/glllA中(即，插入表达载体中的限制性核酸酶Ncol和)(bal)。在大肠杆菌XLl-Blue转化之后，用L-阿拉伯糖诱导融合蛋白的表达。应当注意到也可以使用包括全部衍生的硅聚合酶_α蛋白(长形式) 的插入片段。也使用与上述类似的方法表达硅聚合酶-β的短形式和长形式(cDNA:SEQ ID No. 4 ；其衍生的氨基酸序列SEQ ID No. 3)。实施例2-重组羟磷灰石-结合硅聚合酶-α蛋白的生产
如下进行重组硅聚合酶的生产，该重组硅聚合酶不仅由于存在6xHis标记而可以通过 Ni-NTA金属亲和层析纯化，而且由于存在SxGIu标记具有羟基磷灰石-结合性质。在用正向引物和反向引物生产修饰的硅聚合酶-α扩增子中，使用寡核苷酸，所述正向引物包括 5’ GAA GAG GAA GAG GAA GAG GAA GAGCCT GAA GCT GTA GAC TGG 3’ (下划线ΗΑ_ 结合 GIu标记；双下划线成熟硅聚合酶蛋白质的开始)，所述反向引物包括5’ TAG GGT GGG ATA AGA TGC ATC GGT 3’(下划线编码成熟硅聚合酶_ α的最后密码子)。.在PCR步骤中， 在所有退火温度(即，56-60°C )下，扩增都是成功的，如图3所示。经由T/ A 克隆，用细菌表达载体 pTRC-His2 (从 hvitrogen (Carlsbad, CA) 购得)进行扩增子的连接反应，如图4所示。在大肠杆菌BL21细胞(从^witrogen (Carlsbad, CA)购得)中，进行构建物的克隆。分离十个菌落，每个都具有整合在其中的校
17正构建物。最终重组蛋白质具有下述形态
i^ZEEEEEEEEPEAVDWRTKGAVTAVKDQGDCGASYAFSAMGALEGANALAKGNAVSLSEQNΠDCSIPYGNH GCHGGNMYDAFLYVIANEGVDQDSAYPFVGKQSSCNYNSKYKGTSMSGMVSIKSGSESDLQAAVSNVGPVSVAIDGA NSAFRFYYSGVYDSSRCSSSSLNHAMVVTGYGSYNGKKYWLAKNSWGTNWGNSGYVMMARNKYNQCGIATDASYPTL KGEFEA TVEQKLISEEDLNSA VDHHHHHH
(标记为下划线的；载体序列为草书体的)。用1 mmol的IPTG刺激各个克隆小时)，进行重组蛋白质的合成。实施例3-各种组合物混合物的制备如下制备组合物混合物样品A-E
通过如下方法制备组合物3A:将在实施例1中形成的酶硅聚合酶-α包封在聚交酯 (来源，城市，状态)中，以便形成具有聚交酯外壳和硅聚合酶-α内核的球状颗粒。实施例4-牙膏形式的组合物混合物的制备
通过形成在下表1中显示的组分的混合物来制备适用作牙膏的组合物。表1.牙膏组合物
权利要求
1.组合物，其包括酶；前体物质，其能够被所述酶催化形成无机涂层物质；和保护剂，所述保护剂将所述酶与在该混合物内的所述前体物质分开，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。
2.权利要求1的组合物，其中所述包含硅聚合酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和/或具有低聚谷氨酸序列的多肽。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述前体物质包括二氧化硅、硅酸盐、硅酸、硅醇盐、 和/或具有通式Si (R1)ffl(R2)n(R3)p(R4)q的化合物、其缩合产物或这些物质的混合物，其中 R1^ R2> R3和R4各自独立地包括OH、H、C1至C12烷烃基，或C1至C12烷氧基；m、η、ρ和q各自独立地为0或1至4的整数；和(m + η + ρ + q) = 4。
4.根据权利要求1至3中任一项的组合物，其进一步包括含磷化合物。
5.权利要求4的组合物，其中所述酶、所述前体物质和所述含磷化合物彼此反应形成羟基磷灰石。
6.权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述含磷化合物包括磷酸盐，比如磷酸钠、 磷酸二钠、磷酸三钠、磷酸四钠、偏磷酸钠、三磷酸五钠、单氟磷酸钠、单氟磷酸盐、十二烷基磷酸钠(月桂基磷酸钠)、磷酸钙钠、磷酸四钾、三磷酸五钾、焦磷酸二钠、焦磷酸四钠、焦磷酸四钾、磷酸锡(磷酸亚锡)和焦磷酸锡(焦磷酸亚锡)。
7.权利要求1的组合物，其中所述保护剂化学键合所述酶或前体物质。
8.权利要求1至7中任一项的组合物，其中所述保护剂包封所述酶。
9.权利要求1至8中任一项的组合物，其中所述保护剂包括聚交酯。
10.权利要求1至9中任一项的组合物，其中所述保护剂进一步包括用于将所述酶或前体结合至所述保护剂的连接剂。
11.权利要求1至10中任一项的组合物，其中所述组合物是口腔护理组合物，其包括牙膏、口香糖、嗽口水、牙刷、护齿器或牙托、牙齿贴片、牙齿排列矫正器、食品、饮料、糖锭、或其它可食用物质，及其组合。
12.涂层，其包括权利要求1至11中任一项的组合物。
13.涂层，其包括由权利要求1至11中任一项的组合物内的反应性组分之间反应形成的反应产物。
14.基质，至少部分地被权利要求1至11中任一项的组合物覆盖。
15.基质，至少部分地被权利要求12或13的涂层覆盖。
16.权利要求14或15的基质，其中所述基质包括具有外表面、内表面或两者的牙齿。
17.权利要求16的基质，其中所述涂层至少部分地覆盖所述外表面、所述内表面或两者。
18.一种形成组合物的方法，所述方法包括形成包含下述组分的混合物酶；前体物质，其能够被所述酶催化形成无机涂层物质；和保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶和所述前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。
19.一种在牙齿上形成无机涂层物质的方法，所述方法包括 混合酶和能够被该酶催化形成无机涂层物质的前体物质；和用无机涂层物质涂布所述牙齿，在至少部分所述牙齿上形成无机涂层。
20.权利要求19的方法，其进一步包括保护剂，其从化学上或物理上分开所述酶和所述前体物质，以便阻止所述酶与所述前体物质的过早反应。
21.根据权利要求18至20中任一项的方法，其中该混合物进一步包括含磷化合物。
22.。
23.权利要求18至22中任一项的方法，其中所述酶包括硅聚合酶；所述前体物质包括二氧化硅、硅酸盐、硅酸、硅醇盐、和/或具有通式si (RiagnOgpO 山的化合物、其缩合产物或这些物质的混合物，其中I^、I 2、I 3和R4各自独立地包括OHC1至C12烷烃基，或C1 至C12烷氧基；m、η、P和q各自独立地为0或1至4的整数；和(m + η + ρ + q) = 4。
24.权利要求19至23的任一项的方法，其进一步包括使所述酶与所述前体物质接触，以便引发所述酶和所述前体物质之间的反应。
25.权利要求对的方法，其中所述涂层包括羟基磷灰石。
全文摘要
本发明公开了组合物和口腔护理产品。本发明还公开了制备和使用组合物和口腔护理产品的方法。
文档编号A61K8/66GK102231975SQ200980146714
公开日2011年11月2日 申请日期2009年11月20日 优先权日2008年9月24日
发明者H.C.施勒德尔, H.H.赫费尔, J.G.米勒, M.维恩斯, P.拉克, W.E.米勒, W.格伊尔特森 申请人:格雷斯股份有限两合公司