专利名称：修饰的肺炎链球菌溶血素(ply)多肽的制作方法
技术领域：
本公开内容 涉及包含修饰的的肺炎链球菌溶血素(PLY)多肽的免疫原性组合物。还提供核酸、由其编码的多肽、包含它们的组合物、使用所述核酸、多肽和组合物的方法。置量肺炎链球菌是重要的病原体，引起侵袭性疾病如肺炎、脑膜炎和菌血症。即使在可免费获得有效的抗生素疗法的地区，肺炎链球菌肺炎导致的死亡率可高达住院患者的19%。在发展中国家，每年3百万以上不到5岁的儿童死于肺炎，其中肺炎链球菌是最常见的确定病原体。肺炎链球菌还导致没那么严重但非常普遍的感染如中耳炎和鼻窦炎，在发达国家，其对健康护理成本有巨大影响。中耳炎对幼童尤其重要，而鼻窦炎影响儿童和成人。目前，已批准的抗肺炎球菌疫苗以衍生自非常普遍的菌株的各种荚膜多糖抗原的制剂为基础。在世界上各个地区，最通常引起侵袭性肺炎球菌感染的血清型似乎稍有不同。在前免疫时代的北美，血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F是引起年龄彡5岁的儿童内的侵袭性疾病的7种最常见的血清型(Butler等人.J. Infect. Dis. 171(4) :855-889 (1995))。已有报道这些血清型是造成这些」L童内的70-88 %侵袭性疾病的原因并占具有高水平青霉素耐药性的肺炎链球菌的100%。两类肺炎球菌疫苗正处于临床使用23价肺炎球菌多糖疫苗(23-PPV)和7价肺炎球菌缀合疫苗(PCV7) (Siber 等人· Pneumococcal Vaccines The Impact of ConjugateVaccine. Washington DC ASM Press ；2008)。23-PPV中的多糖抗原诱发T细胞非依赖性免疫应答，导致免疫性记忆差。此外，尽管23-PPV在成人和老人体内给予抵抗侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的60-80%保护，5年后免疫基本上衰退且在年龄< 2岁的儿童中它是低免疫原性的。在用PCV7 (Prevnar_ , Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)接种的幼童中观察到具有免疫性记忆的强T细胞应答。最近，在疫苗与相关生物产品方面，美国食品与药品管理顾问委员会推荐批准Prevnar 13 (PCV13，其包含PCV7的血清型和血清型1、3、5、6A、7F和19A)。还正在对包含缀合到载体蛋白的10种肺炎球菌血清型(1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)的多糖的十价疫苗(Synflorix，GSK)进行研究。尽管其巨大成功和重大公共健康影响，抗肺炎球菌缀合疫苗也有一些众所周知的缺点，包括缀合疫苗生产的复杂性，这提高了制造成本。然而，更重要的是发现基于多糖的缀合疫苗仅保护抵抗表达该疫苗代表的特定荚膜型的细菌引起的感染。这是在例如拉丁美洲、亚洲和非洲等地区的问题，其中PCV7代表的血清型是使得侵袭性疾病比世界上其它地方少许多的原因(Black等人，In :Plotkin SA等人编辑，Vaccines,第5版· WB Saunders.第 23 章(2008) ；Garcia 等人，Rev. Panam. Salud. Publica. 19(5) :340-8(2006) ；Lagos,R. Pediatr. Infect. Dis. J. 21 (12) : 1115-23 (2002))。这种需求可通过目前正在开发和 / 或审批阶段的新一代缀合疫苗10价和13价PCV疫苗(PCV-10和PCV-13)来满足。本领域技术人员理解地区性问题(例如，有限的血清型覆盖范围、用非疫苗血清型、荚膜转变、载体诱导抑制替代疾病的可能性及制造和供应限制)是在对全世界人口进行接种中出现的重要问题。已知肺炎球菌是抗原和克隆多样性的(Hanage等人，Infect.Immun. 73(1) :431-5 (2005))，其中单一肺炎球菌血清型通常包含许多基因分歧克隆体。已知肺炎链球菌蛋白在血清型 之间是相当保守的且因此被考虑作为潜在疫苗。已报道肺炎球菌溶血素为胞内蛋白，其在肺炎球菌裂解后被释放时在体内引起多种毒性作用。在临床分离物中，该蛋白在氨基酸序列和抗原性方面都是高度保守的，因此，满足其用作疫苗抗原的一些基本标准(Paton等人· Infect. Immun. 40(2)548-52(1983)；Lock等人.Microb. Pathog. 5(6) :461-67 (1988))。然而，它具有固有的溶血特性，因此已开发突变体并研究它们作为疫苗的可能性。从历史角度来看，最通常研究的肺炎球菌溶血素突变体为PdB,其包含单一氨基酸变化Trp433Phe (Paton等人，Infect. Immun. 59 (7)2297-304(1991) ;Lu 等人，Infect. Immun. 77 (5) :2076-83(2009) ;0gunniyi 等人，Infect.Tmmun. 75 (I) :350-7(2007) ;Berry 等人,Infect. Immun. 63 (5) :1969-74(1995) ;Berry 等人，Infect. Tmmun. 67 (2) :981-85 (1999))。最近已经描述了其它PLY突变体，包括氨基酸146缺失的AAlal46和AAlal46R147 (Kirkham 等人，Infect. Immun. 74(1) :586-93 (2006))。AAlal46 和AAlal46R147都表现出缺少抵抗人红细胞的溶血活性。含铝佐剂的AAlal46也表现出与含铝佐剂的野生型PLY相同的保护性。尽管所用的小鼠品系中存在不同，所用的肺炎链球菌血清型和免疫路径、从采用败血症模型的研究得到的结果的汇编已经表明与空白对照组相比，PdB或AAlal46延长了小鼠的存活。在肺炎模型中，与空白对照相比，用PdB对小鼠免疫导致感染小鼠的肺中肺炎球菌的数量显著下降(Briles等人，J. Infect. Dis. 188(3) :339-48 (2003))。此外，在大多数这些发现中，当与其它毒力因子如PspA、PspC或PsaA组合使用时，发现PdB提供抵抗许多种菌株的优越保护(Lu,同上；0gunniyi,同上；Berry (1995),同上)。尽管PdB突变体在一些模型中提供了显著的保护，它存在具有残余溶血活性的缺点。然而，如上所述，Δ Alal46提供保护性免疫并缺少溶血活性。尽管已经开发了几种突变PLY疫苗，本领域中存在对保护性和缺少溶血活性的其它突变体的明确需要。本文中描述了一种这样的突变体PlyDl。本文中提供的数据表明PlyDl缺少溶血活性，产生中和抗体且在某些动物模型中是保护性的，所述中和抗体在体外抑制PLY的体外溶血作用。附图
简述图I.示例性PLY氨基酸序列-等位基因和修饰。图2.在位置293有突变的绵羊红细胞的体外溶血活性、毒素介导的裂解。图3.用mPLY免疫后减少的PLY介导的肺组织损伤。图4.基于SDS-PAGE分析的PlyDl蛋白纯化。图5.用不同剂量的含佐剂Ply-Dl免疫三次的CBA/J小鼠的存活率公开内容概述本公开内容涉及修饰的肺炎链球菌溶血素蛋白(“mPLY”)或其片段，其可在抵抗由肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌疾病的免疫原性组合物或疫苗中用作免疫原。所述mPLY通常包含至少一个不同于野生型PLY(“wtPLY”;例如SEQ ID NO. :2_42中的任一个)的氨基酸。将mPLY给药至宿主后，mPLY诱导抗wtPLY和/或抗mPLY抗体的产生，其可包括防止和/或抑制WtPLY的溶血活性的抗体和/或抵抗表达WtPLY的生物的保护性抗体。优选地，mPLY诱导可与wtPLY反应的抗体且与wtPLY相比,展示对红细胞降低的溶血活性(包括无溶血活性)。在一些实施方 案中，wtPLY在氨基酸65 (苏氨酸，“Thr65”)、氨基酸293(甘氨酸，“617293”)和/或428 (半胱氨酸，“Cys428”)中的一个或多个处被修饰成任何其它氨基酸。在某些实施方案中，wtPLY在Gly293和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Thr65和/或Cys428处被修饰。在某些实施方案中，Thr65被半胱氨酸替代，Gly293被半胱氨酸替代，和/或Cys428被丙氨酸替代。还提供了编码mPLY的核酸，制备mPLY的方法，对宿主免疫、保护宿主免受表达wtPLY的生物感染、治疗和/或预防宿主被表达wtPLY的生物感染的方法及用于所述方法的组合物。根据本文中提供的描述，其它实施方案将变得清楚。本文中提供修饰的肺炎球菌溶血素(PLY)多肽及其片段，包含所述多肽和/或片段(例如肽)的免疫原性组合物和疫苗，制备所述多肽和/或片段的方法，和使用所述多肽和/或片段的方法。修饰的PLY多肽(“mPLY”)和/或mPLY片段是与wtPLY序列相比，在核酸或氨基酸序列上具有差异的PLY多肽和/或PLY多肽的片段。与wtPLY和/或其片段相比，mPLY多肽通常，但不必须地，具有至少一个修饰的氨基酸序列。所述修饰通常为氨基酸替代、插入和/或缺失。与相同剂量的、基本上对应于wtPLY蛋白的蛋白相比,所述mPLY多肽和/或其片段可优选为基本无毒的。优选地，所述修饰的序列提供通常与wtPLY有关的某些mPLY活性变化，尤其不希望的活性，包括但不局限于膜渗透、细胞裂解和对人红细胞与其它细胞(细胞可为人和/或非人细胞)的溶细胞活性变化。还优选在给药至宿主(例如动物如哺乳动物，例如人)后，mPLY保持诱导抗PLY(包括但不局限于抗wtPLY)的保护性和/或中和抗体的能力。在某些实施方案中，这类抗体降低(包括消除)wtPLY的溶血活性和/或肺组织毒性，和/或结合到表达wtPLY的微生物和/或结合到wtPLY本身，和/或提供抵抗由表达wtPLY的微生物(例如肺炎链球菌)引起的疾病的感染或传播的保护。所述wtPLY序列可为在生物内表达的任何PLY，所述生物包括但不局限于在高等生物(例如动物，如哺乳动物，例如人)体内致病的(例如“引起疾病的”)微生物。示例性致病生物为肺炎链球菌。野生型PLY多肽通常由ply基因编码，其为高度保守的基因，但确实展不一些变异(例如，Walker 等人，Infect. Immun. 55 :1184-1187 (1987) ；Mitchell等人，Nucleic Acid Res. 18 :4010 (1990) ；Jefferies 等人，J Infect Dis. 196 (6)936-44(2007))。使用可从 Accelrys Software, Inc 获得的 Discovery Studio 程序套根据与产气荚膜梭菌细胞溶素0的序列相似性和同源性建模来构建PLY结构模型。该模型表明wt-PLY为 20% α-螺旋和 40% β -折叠，具有四个不同结构域Dl (残基6-21、58-147、198-243、319-342)、D2(残基 22-57，343-359)、D3(残基 148-197,244-318)和D4(残基360-469)。野生型PLY可在Dl、D2、D3或D4中的一个或多个处被修饰。示例性wtPLY氨基酸序列包括但不局限于以下任一中显示的那些Walker等人.(同上)、Mitchell等人.(同上)、Jeffries等人·(同上)、图I、SEQ ID NO. :2_42、基因库登录号 M17717、EF413923、EF413924、EF413925、EF413926、EF413927、EF413928、EF413929、EF413930、EF413931、EF413932、EF413933、EF413934、EF413935、EF413936、EF413937、EF413938、EF413939、EF413940、EF413941、EF413942、EF413943、EF413944、EF413945、EF413946、EF413947、EF413948、EF413949、EF413950、EF413951、EF413952、EF413953、EF413954、EF413955、EF413956、EF413957、EF413958、EF413959 和 / 或 EF413960。注意到这些序列之间的任何变异可与这类wtPLY中发现的任何其它变异(其可包括本文中或其它地方描述的合成修饰)结合以产生可被 修饰以产生mPLY的其它wtPLY。如采用mafft确定的，这类wtPLY多肽通常，但不必须地，与SEQ ID NO. :2中显示的wtPLY氨基酸序列具有至少约(独立地提及以下各值)905^95%或99%序列同一性(Kato等人.NucleicAcidsRes. 30 :3059-3066(2002) ;Kato 等人· Brief Bioinform. 9 :286-294 (2008))。在某些实施方案中，如采用mafft确定的，wtPLY与SEQ ID NO. 2中所示的wtPLY序列可具有98. 8%序列同一性。为产生mPLY而引入wtPLY的修饰可对与野生型PLY具有同一性的任何多肽(包括与SEQ ID NO. :2具有约90%、95%、98%、99%或99.9%同一性的那些多肽)进行。wtPLY多肽的氨基酸序列中的任何差异通常，但不必须地，为表型上沉默的。应注意本文中列出的wtPLY仅为示例性的；其它合适的wtPLY序列在本领域是已知的且将适合于本文中所述的修饰。示例性mPLY多肽包含，例如在氨基酸苏氨酸65 (“Thr65”)、甘氨酸293 (“Gly293”)和/或半胱氨酸428( “Cys428”)处被修饰的wtPLY。任意这些氨基酸的修饰可使用常规命名法则提及，例如通过指出被修饰的氨基酸和对其进行的修饰(例如，Thr65X、Gly293X、Cys428X，其中X通常表示替代的氨基酸或该氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，wtPLY在Thr65处被修饰成半胱氨酸(“Ply_T65C”)。在另一实施方案中，wtPLY在甘氨酸293处被修饰成丙氨酸(“Ply_G293A”)、半胱氨酸(“Ply_G293C”)、缬氨酸(“Ply_G293V”)或苏氨酸(“Ply-G293T”)。在另一实施方案中，wtPLY在Cys428处被修饰成丙氨酸(“Ply-Cys428A)。在其它实施方案中，wtPLY在Gly293和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Thr65和/或Cys428处被修饰。在其它实施方案中，wtPLY在Thr65和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Gly293和/或Cys428处被修饰。在其它实施方案中，wtPLY在Cys428和一个或多个其它氨基酸如但不局限于Thr65和/或Gly293处被修饰。在Thr65、Gly293和/或Cys428处的修饰可对任何wtPLY进行以产生mPLY多肽。在这些实施方案的每一个中，优选的替代是半胱氨酸替代Thr65 ;半胱氨酸、缬氨酸或苏氨酸替代Gly293 ;和/或丙氨酸替代Cys428。示例性mPLY多肽显示于SEQ ID NO. 43和44中。可使用标准分子生物学和生物化学技术将这些修饰中任何修饰引入本文中或其它地方描述的任何wtPLY，其结合任何其它修饰以产生mPLY多肽。可通过本领域技术人员已知的方法对PLY (wtPLY或mPLY)活性进行测定和表征(例如，Paton 等人，同上；Nato 等人· Infect Immun. 59 (12) :4641-4646 (1991))。可使用本文中描述的测定中的任何一种或多种，或任何其它一种或多种合适测定来确定mPLY作为疫苗的适当性。两种合适的示例性测定是体外溶血性测定和溶血抑制测定。体外溶血测定测量mPLY相对wtPLY的溶血(例如溶细胞)活性。溶血抑制测定测量抵抗mPLY以抑制PLY的溶血作用而产生的抗血清的能力，且(通常)将抗mPLY抗血清与抗wtPLY抗血清相t匕。可使用这些测定中任一种或两种来确定特定mPLY的活性。也可使用体内测定，包括但不局限于基本上如实施例8中描述的败血症模型、病灶性肺炎模型和鼻内刺激模型。因此，合适的mPLY可为展示比wtPLY低的溶血活性(例如，通过体外溶血测定)的那种。合适的mPLY也可为在给药至宿主后引起宿主产生抑制wtPLY的溶血作用(例如，通过溶血抑制测定)的抗体的那种，是免疫原性的(例如免疫原性组合物，诱导抵抗wtPLY或表达wtPLY的微生物的抗体产生或细胞毒性T细胞应答的那种)，保护性的(例如，预防性或治疗性疫苗组合物，分别诱导保护宿主免受表达wtPLY的生物感染或限制已经存在的感染的免疫应答的那种)，提供如通过本文中描述的任何 一种或多种体内测定(例如，败血症模型、病灶性肺炎模型、鼻内刺激、肺损伤测定)测量到的益处和/或与wtPLY相比提高或降低巨噬细胞的细胞因子表达。应理解确认和/或表征mPLY的这些方法是示例性且非限定性的；其它测定也可是合适的。在体外溶血测定中，可在塑料微滴定板中、在系列稀释物(例如2倍)中将测试多肽(例如，wtPLY、mPLY)分别连续稀释，其中测试多肽的最高浓度通常为约O. 5mg/mL。可包含牛血清白蛋白(BSA)以防止在塑料微滴定板上的吸附损失。接着可将绵羊红细胞加至所有孔中，将各板孵育足够长时间(例如30min.)。通常包括阳性对照物(例如，通过将1% Trition X-100加到特定孔中获得100%裂解测定)和阴性对照物(例如，仅PBS)。接着可将板离心以将完整细胞与裂解细胞分离。接着可将包含裂解细胞的上清液转移至新鲜板并进行A54tl血红蛋白释放测定(裂解细胞释放血红蛋白)。可按照相对阳性对照物发生50%溶血时的蛋白浓度(mg/mL)的倒数确定比活性。采用此测定系统，优选特定mPLY的比活性低于wtPLY。例如，mPLT的比活性可为wtPLY的比活性的约0%,0. 0005%,O. 001%,O. 005%,O. 01%,O. 05%,O. 1%,0. 5%、1%、5%或< 10%。大致在这些范围内的比活性通常表明该特定mPLY在可接受的参数内。在溶血抑制测定中，基本上如本领域中或本文中所述生产抗PLY (wtPLY或mPLY)抗血清并在微滴定板(例如96孔板)中连续稀释(例如，两倍)并将恒量的wtPLY加入各孔中以备分析。将绵羊红细胞加入所有孔中并按照上一段中描述的体外溶血测定进行测定。将数据以百分溶血率对抗血清效价作图(对数标度)。取百分溶血率降低至50%时血清稀释物的倒数作为50%溶血抑制效价。使用此测定系统，优选特定mPLY具有与wtPLY相似(例如，约75至约100%的任何值)或比wtPLY高的50%溶血抑制效价。例如，优选特定mPLY诱导抗血清，所述抗血清的50%溶血抑制效价(使用2倍系列稀释物)为约I : 16、I 32、1 64、1 128,1 256,1 512,1 1024,1 2048,1 5096 或 I : 10， 192 或更大。大致在这些范围内的50%溶血抑制效价通常表明该特定mPLY在可接受的参数内。在某些实施方案中，可能希望mPLY具有可接受的比活性(如通过体外溶血测定确定的)和可接受的50%溶血抑制效价。例如，合适的mPLY的比活性可为wtPLY的比活性的(独立提及以下各值)0%、0· 0005%,O. 001%,O. 005%,O. 01%,O. 05%,O. 1%,0. 5%,1%、5%或<10% (如使用体外溶血测定确定的)，而50%溶血抑制效价(使用2倍系列稀释物)为约 I : 128、1 256,1 512,1 1024,1 2048,1 5096 或 I : 10,192。已知wtPLY激活巨噬细胞来产生细胞因子(Malley等人.PNAS USA, 100 (4)1966-71 (2003))。可通过确定巨噬细胞激活来确认合适的mPLY，所述巨噬细胞激活通过体外测定mPly诱导的细胞因子(例如，IL-I β、IL-6和IL-10)产生来确定。可用wtPLY或mPLY与巨噬细胞样细胞(例如，人MM6和小鼠J774A. I细胞)孵育过夜，并经过或不经过蛋白酶K和加热处理(以区分处理组中脂多糖(LPS)污染导致的假阳性)。可在过夜孵育后通过ELISA测定细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TNF- a、IL-I β )的产生。在某些实施方案中，合适的mPLY将比wtPLY更多诱导细胞因子(例如，IL-I β、IL-6和IL-10)的表达。在其它实施方案中，合适的mPLY将比wtPLY更少诱导细胞因子(例如，IL-I β、IL-6和IL-10)的表达。mPLY和wtPLY诱导的表达水平的差异可为，例如约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或超过 100%。还希望抵抗mPLY而产生的抗 体提供较低的wtPLY或表达wtPLY的生物诱导的肺组织损伤水平。为了使用动物模型测试此类抗体的有效性，可用mPLY(例如，用于足够长时间的一剂约1、2、5或IOyg)对一个或多个小鼠(或其它合适的模型动物)接种，然后用wtPLY(例如，用于足够长时间的一剂约1、2、5或IOyg)或表达wtPLY的生物刺激。经过足够长时间(例如，几小时、几天、几周时间)后，可收获肺并染色以观察组织损伤。wtPLY通常引起血管周围水肿、变厚且破裂的肺泡壁、减小的肺泡腔及肺泡腔的液体和血液渗入。在某些实施方案中，与wtPLY或表达wtPLY的生物诱导的抗体相比,合适的mPLY可诱导减少肺损伤的抗体约 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。此外，在某些实施方案中，优选合适的mPLY展示免疫原性(例如，在给药至宿主后，诱导中和和/或保护性免疫应答)。可通过证实在接种的个体(例如，人，或使用动物模型)中被表达wtPLY的生物感染下降来证实中和和/或保护性免疫应答的存在。合适的动物模型包括败血症模型、病灶性肺炎模型和鼻内刺激模型。在败血症模型中，可用mPLY(具有或没有一种或多种佐剂，在合适的时间点如第0、7、14、21、28、35、42天)对测试动物(例如，小鼠或类似模型)进行接种(例如，皮下、静脉、肌肉、皮内、结内(intranodally)、鼻内接种)，然后在合适量的时间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用合适量的表达wt-PLY的生物(例如，IO7集落形成单位(cfu)的肺炎链球菌血清型6B)通过鼻内注射(IN)进行刺激。刺激之后，可监测小鼠的死亡率，并可采集样品血液。可使用例如抗体ELISA分析血清的总PLY特异性IgG应答和使用例如溶血抑制测定分析PLY中和能力。然后可对存活率和ELISA/溶血抑制测定数据进行统计学分析(例如，Fisher精确检验、Wilcoxon符号秩次检验、Mann-Whitney秩和检验)以确定mPLY是否有效。也可使用病灶性肺炎小鼠模型测试mPlyDl。简单而言，可用具有或不具有佐剂的纯化的重组PlyDl蛋白对动物接种(例如，皮下、静脉、肌肉、皮内、结内、鼻内接种)。可用mPLY(具有或不具有一种或多种佐剂，在合适的时间点如第0、7、14、21、28、35、42天)对测试动物(例如，小鼠或类似模型)接种，然后在合适量的时间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用合适量的表达wt-PLY的生物(例如，3-7xl06cfu肺炎链球菌株EF3030(血清型19F))通过鼻内注射(IN)进行刺激。刺激之后，可监测小鼠的死亡率，并可采集样品血液。可使用例如抗体ELISA分析血清的总PLY特异性IgG应答和使用例如溶血抑制测定分析PLY中和能力。然后可对存活率和ELISA/溶血抑制测定数据进行统计学分析(例如，Fisher精确检验、Wilcoxon符号秩次检验、Mann-Whitney秩和检验)以确定mPLY是否有效。还可使用鼻内刺激小鼠模型内部(in-house)评价mPlyDl作为疫苗的有效性。在此模型中，可用有效剂量(例如，约O. 25-25 μ g)的纯化的重组PlyDl蛋白(具有或不具有一种或多种佐剂，在合适的时间点如第0、7、14、21、28、35、42天)对小鼠接种(例如，皮下，静脉，肌肉，皮内、结内、鼻内接种)，然后在合适量的时间(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周)后用合适量的表达wt-PLY的生物(例如，致死量(5xl05cfu)的肺炎链球菌株14453(血清型6B))通过鼻内注射(IN)进行刺激。刺激之后，可监测小鼠的死亡率，并可采集样品血液。可使用例如抗体ELISA分析血清的总PLY特异性IgG应答和使用例如溶血抑制测定分析PLY中和能力。然后可对存活率和ELISA/溶血抑制测定数据进行统计学分析(例如，Fisher精确检验、Wilcoxon符号秩次检验、Mann-Whitney秩和检验)以确定mPLY是否有效。包含mPLY多肽和/或其片段的免疫原性组 合物和疫苗可用于治疗诸如例如侵袭性肺炎球菌性疾病，如肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等。与天然毒素相比，所述多肽和片段展示显著减小的毒性。还提供编码该mPLY多肽和/或片段的核酸序列、包含这类核酸序列的载体和能表达所述突变的PLY多肽和/或片段的宿主细胞。相对于wtPLY，mPLY多肽和/或片段优选展示降低的毒性(例如，降低的溶血/溶细胞活性)并诱发中和抗体，所述中和抗体与wtPLY诱发的抗体交叉反应。mPLY多肽和/或片段可用于生产免疫组合物，所述组合物可包括疫苗。免疫组合物是给药至宿主(例如动物)后，诱导或增强定向抵抗所述组合物内包含的抗原或免疫原的免疫应答的免疫组合物。该应答可包括产生抗体(例如，通过B细胞刺激)或基于T细胞的应答(例如，溶细胞活性)。这些应答可是或不是保护性或中和的。保护性或中和免疫应答有害于与该抗原对应的感染性生物(例如，从其中衍生出抗原)且有利于宿主(例如，通过减少或预防感染)。本文中所用的保护性或中和抗体和/或细胞应答可与mPLY、wtPLY或其片段反应且当在动物中测试时降低或抑制wtPLY (或表达wtPLY或mPLY的生物)的致死率。可认为在给药至宿主后产生保护性或中和免疫应答的免疫组合物是疫苗。包含一种或多种mPLY多肽的免疫组合物还可包含一种或多种其它抗原，如一种或多种肺炎链球菌抗原。示例性抗原包括，例如PcPA和/或PhtD。免疫组合物的其它变异也认为是本领域技术人员将理解的。如上所述，mPLY多肽和/或其片段通常具有至少一个核酸和/或一个氨基酸替代。与wtPLY相比，修饰的多肽可还在生物功能(例如，免疫原性、溶血活性)上具有至少一种变化。当与相同剂量的wtPLY蛋白相比时，mPLY多肽或其片段优选基本上无毒性，诱发抗体，所述抗体优选是保护性或中和的且可与wtPLY蛋白诱发的抗体交叉反应。可使用各种方法产生mPLY多肽和/或其片段，所述方法包括但不局限于定点诱变、随机诱变、常规诱变、体外诱变、自发诱变和化学合成。诱变方法可在例如Sambrook等人，A Guide toMolecular Cloning,Cold Spring Harbour,N. Y. (1989)和Sambrook和 Russel. MolecularCloning A Laboratory Mannual (2001)中找到。本公开内容还涉及使用mPLY多肽或其片段产生的抗体，优选保护性或中和抗体，其中所得抗体可与wtPLY和/或其片段反应。还提供诱发抗体的产生的方法，所述抗体可为保护性和/或中和的，可与所述mPLY或其片段反应。所述抗体可诱发自动和被动免疫。所述mPLY多肽和/或其片段还可用于识别和分离抗体，所述抗体可为保护性和/或中和性的，可与wtPLY诱发的那些交叉反应。还提供编码mPLY多肽的核酸。还提供这类序列的变体，包括其简并变体。在某些实施方案中，如下面更详细讨论的，可将编码mPLY多肽和/或片段的核酸分子插入一种或多种表达载体中。在这类实施方案中，所述mPLY多肽和/或片段由与氨基酸序列对应的核苷酸编码。编码各氨基酸的核苷酸的特定组合在本领域中是众所周知的，如本领域技术人员使用的各种文献(即，Lewin, B. Genes V, Oxford University Press, 1994)中所述和下表I中所示。核酸变体可使用编码关注的多肽的核苷酸的任何组合。
表I
权利要求
1.分离的多肽，由野生型肺炎球菌溶血素多肽组成，所述野生型肺炎球菌溶血素多肽在选自苏氨酸65、甘氨酸293和半胱氨酸428的氨基酸处包含至少一个氨基酸替代。
2.分离的多肽，由野生型肺炎球菌溶血素多肽组成，所述野生型肺炎球菌溶血素多肽在苏氨酸65处及甘氨酸293或半胱氨酸428中的至少一个处包含至少一个氨基酸替代。
3.权利要求I或2所述的多肽，其中所述野生型肺炎球菌溶血素与SEQID NO. :3的同一1丨生为至少90%。
4.权利要求I或2所述的多肽，其中所述野生型肺炎球菌溶血素与SEQID NO. :3的同一性为至少95%。
5.权利要求I或2所述的多肽，其中所述野生型肺炎球菌溶血素与SEQID NO. :3的同一1丨生为至少99%。
6.权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中苏氨酸65被半胱氨酸替代，甘氨酸293被选自半胱氨酸、缬氨酸和苏氨酸的氨基酸替代，半胱氨酸428被丙氨酸替代。
7.免疫原性组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。
8.权利要求7所述的免疫原性组合物，还包含至少一种其它肺炎链球菌抗原。
9.权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌抗原为PcPA或PhtD中的至少一种。
10.权利要求9所述的免疫原性组合物，包含PcPA和PhtD。
11.分离的核酸序列，编码权利要求1-6中任一项所述的肺炎球菌溶血素多肽。
12.表达载体，包含编码权利要求1-6中任一项所述的修饰的肺炎球菌溶血素多肽的核酸序列。
13.宿主细胞，包含编码权利要求1-6中任一项所述的多肽的表达载体。
14.被权利要求12所述的表达载体转化、转染或感染的宿主细胞。
15.制备权利要求1-6中任一项所述的多肽的方法，包括用编码所述多肽的表达载体转染宿主细胞，培养所述宿主细胞使得所述多肽被表达，和分离所述多肽。
16.诱发哺乳动物的免疫应答的方法，所述方法包括给药至所述哺乳动物包含权利要求1-6中任一项所述的分离的多肽与药学上可接受的载体的组合物。
17.产生结合到野生型肺炎球菌溶血素多肽的抗体的方法，所述方法包括向哺乳动物体内引入包含权利要求1-6中任一项所述的分离的多肽与药学上可接受的载体的组合物，所述组合物任选还包含佐剂。
18.与权利要求1-6中任一项所述的多肽反应的分离的抗体。
19.基本纯化的权利要求1-6中任一项所述的多肽在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。
20.疫苗组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的多肽。
全文摘要
本公开内容涉及修饰的肺炎球菌溶血素(PLY)蛋白，其缺少溶血活性并可在抵抗由肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌疾病的免疫原性组合物或疫苗中用作免疫原。所述修饰的肺炎球菌溶血素蛋白在苏氨酸65、甘氨酸293和半胱氨酸428处包含氨基酸替代。还提供核酸、由其编码的多肽、包含它们的组合物、使用所述核酸、多肽和组合物的方法。
文档编号A61K39/09GK102712680SQ200980157678
公开日2012年10月3日 申请日期2009年12月22日 优先权日2008年12月24日
发明者E·奥卢, J·耶弘, M·奥赫斯-奥诺勒姆黑姆亨, R·奥门 申请人:荷兰王国卫生福利和运动部国家公共卫生和环境研究所