专利名称：：环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
。确切地说它是一种环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体及其制备方法。
背景技术：
：环胞苷是临床上常用的抗白血病药物，但是，环胞苷易被肝脏中的胞嘧啶脱氨酶脱氨降解而失去抗癌活性。为了维持有效的血药浓度，必须对患者连续多次地给药，造成骨髓抑制和病人消瘦。为提高环胞苷的疗效，克服其在体内易脱氨降解的缺点，发明人对环胞苷的分子结构进行了改造，在其戊糖环上连接了两条肉豆蔻酸脂肪链，合成了3’，5’-环胞苷二肉豆蔻酸酯，其分子结构见说明书附图1。实验证明，环胞苷二肉豆蔻酸酯的抗癌活性高于其母体药物环胞苷，经配对秩和检验，t=3.5，P<0.05，环胞苷二肉豆蔻酸酯对小鼠腹水型肝癌的抑制率为37.25%，而环胞苷对小鼠腹水型肝癌的抑制率为15.69%。由于在环胞苷的戊糖环上连接了两条肉豆蔻酸脂肪链，所以环胞苷二肉豆蔻酸酯分子的水溶性差，造成了给药难和吸收难的问题。发明人利用脂质体作为药物载体，自主研制了环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体，并对其显微形态、包封率、粒度分布及药效学进行了研究。结果表明，脂质体颗粒呈球型，粒度分布均勻，包封率高，抗癌活性比游离的环胞苷二肉豆蔻酸酯提高了1.41倍。
发明内容本发明的目的是提供环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体及其制备方法，以改善环胞苷二肉豆蔻酸酯给药难和吸收难的缺陷，同时提高药物的疗效。由于脂质体本身对人体无毒，无免疫原性，适合于生物体内降解，在血液中稳定。通过脂质体的包裹技术，可以保护被包裹的环胞苷二肉豆蔻酸酯在血液中不被稀释和降解，提高药物的生物利用度，实施高效安全的程序精确释药模式。本发明是由环胞苷二肉豆蔻酸酯与作为辅料的天然卵磷脂、胆固醇、稳定剂制备而成的脂质体。制备方法采用反相蒸发法。制备脂质体所采用的磷脂均是天然卵磷脂(蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、猪脑卵磷脂)。其组成包括环胞苷二肉豆蔻酸酯、天然卵磷脂、胆固醇及稳定剂。其中卵磷脂与胆固醇的摩尔比为11，膜材与环胞苷二肉豆蔻酸酯的摩尔比为21，稳定剂二硬脂酰基磷脂酰胆碱与磷脂的比例为0.51。本发明的优点是合成了环胞苷二肉豆蔻酸酯，并发展了环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体释药系统，改善了环胞苷二肉豆蔻酸酯因水溶性差导致的给药难和吸收难的缺陷，同时提高了药物的疗效。本发明制备的脂质体具有颗粒呈球型，粒度分布均勻，包封率高的特点ο本发明说明书附图共5幅，图1为环胞苷二肉豆蔻酸酯的分子结构。图2为环胞苷二肉豆蔻酸酯溶液的标准曲线。图3为环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体的透射电镜照片。图4为环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体分别在室温及37°C条件下经72小时温育后的粒度分布图。图5为空白脂质体分别在室温及37°C条件下经72小时温育后的粒度分布图。具体实施例方式本发明的具体制备方法，由以下实施实例举例说明。但本发明的的保护范围不局限于此。实施例(一)制备采用反相蒸发法制备环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体。天然卵磷脂经氧化铝柱层析分离得纯品，将卵磷脂胆固醇二硬脂酰基磷脂酰胆碱按110.5的摩尔比置于鸡心瓶中，加入适量的氯仿使其溶解。准确称取所需量的环胞苷二肉豆蔻酸酯，加入同一鸡心瓶中使其溶解，45°C氮气气氛中减压旋转蒸发除去氯仿，在鸡心瓶内壁上形成干膜，将乙醚及PH值为7.15的磷酸缓冲溶液按31的体积比加入(先加入乙醚使脂膜溶解，然后再加入磷酸盐缓冲溶液)，经超声波清洗仪20min的超声分散后，将得到的混合物在旋转蒸发仪上旋转蒸发成胶状除去乙醚，再加入所需量的磷酸缓冲溶液震荡5min，在25-30°C的条件下继续在旋转蒸发仪上旋转蒸发IOmin彻底除去有机溶剂，即制得乳白色的环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体悬浮液。最后充氮气至乙醚味消失。未包封的环胞苷二肉豆蔻酸酯通过SephadexG-75(葡聚糖凝胶G-75)柱(30cmX1.5cm)以磷酸缓冲溶液为洗脱液洗脱除去。(二)显微形态鉴定环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体样品用磷钨酸溶液ω(P20524(WO3)44(H2O)=染色，用JEM-1200EX透射电镜拍照。附图2显示，脂质体颗粒呈球型。(三)包封率的测定按表1用浓度为40mg/mL的环胞苷二肉豆蔻酸酯甲醇溶液配制标准系列，于289nm处分别测定标准溶液的一阶导数吸收光谱峰值，通过光谱峰值与浓度线性回归得标准曲线，-H=1.877C+2.733X10_3，r=0.9994，见附图3。表1环胞苷二肉豆蔻酸酯(ATdM)—阶导数吸收光谱峰值与浓度的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>用S印hadexG_75柱层析、以PH值7.15的磷酸缓冲溶液为洗脱液、洗脱除去未包封的环胞苷二肉豆蔻酸酯。包封的环胞苷二肉豆蔻酸酯的量通过标准曲线求得。含量测定方法的线性范围为1696mg/L，含量测定的重现性为100.13%，SD士0.84,CV=0.91%,η=4。测得环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体的包封率为(82.5士3.2)%。(四)粒径测定用库尔特TA-II型计数器测定环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体及空白脂质体在室温及经72小时37°C温育后的粒度分布，并用Carstensen公式计算平均粒径及温育前后平均粒径的变化。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中Dn为数均粒径讽为一定粒径粒子的百分比讽为与Ni对应的粒径。附图4显示，环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体粒度分布均勻。经72小时37°C温育后，平均粒径从1.80μm增加到2.93μm,增加了1.13μm。附图5显示，空白脂质体的平均粒径从2.154!11增加到3.50，增加了1.35μm0说明环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体的聚结稳定性较好。(五)药效学实验通过比较环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体与环胞苷二肉豆蔻酸酯对小鼠腹水型肝癌的抑制率评估两者的抗癌活性。荷瘤小鼠由上海Biosis生物技术有限公司购买。首先将艾氏腹水用生理盐水稀释(13V/V)，瑞士雌性小鼠(22-25g)按8X106单位/鼠的量通过腹腔注射接种，接种后的小鼠随机分为4组，10只一组。接种1天后给药组和对照组通过腹腔注射给药，连续给药3次，每隔1天1次。记录每只小鼠在30天内的存活天数，计算每一组的平均存活天数。按下式计算抑制率IR%=100X(MSD1-MSD2)/(MSD2)式中IR为抑制率，MSD1为给药组的平均存活天数，MSD2为对照组的平均存活天数。实验结果见表2。表2.环胞苷二肉豆蔻酸酯与环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体的抗癌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*CMC:羧甲基纤维素钠表2数据显示，环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体与游离的环胞苷二肉豆蔻酸酯的抗癌活性有显著性差异。经成组t检验，t=6.5，P<0.01。环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体对小鼠腹水型肝癌的抑制率为92.22%，而游离环胞苷二肉豆蔻酸酯对小鼠腹水型肝癌的抑制率为38.27%，前者的抑制率比后者高1.41倍。权利要求环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体，其特征在于含有环胞苷二肉豆蔻酸酯、以及作为辅料的天然卵磷脂、胆固醇及稳定剂。2.根据权利要求1所述的环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体，其特征在于膜材卵磷脂与胆固醇的摩尔比为11。3.根据权利要求1所述的环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体，其特征在于膜材与药物的摩尔比为21。4.根据权利要求1所述的环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体，其特征在于稳定剂为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，与卵磷脂的摩尔比为0.51。5.环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体的制备方法，包括如下步骤①将蛋黄卵磷脂、胆固醇及二硬脂酰基磷脂酰胆碱按110.5的摩尔比溶于适量氯仿中，将环胞苷二肉豆蔻酸酯按膜材与药物摩尔比为21的量溶入上述氯仿混合液中，在45°C氮气气氛中减压旋转蒸发除去氯仿，在鸡心瓶内壁上形成脂膜。②用无水乙醚溶解步骤①制得的脂膜，再加入PH值为7.15的磷酸缓冲溶液，乙醚与缓冲溶液的体积比为31，超声分散20min，制得0/W型乳浊液。③将步骤②得到的0/W型乳浊液旋转蒸发成胶状，再加入所需量的PH值7.15的磷酸缓冲溶液，震荡5min，于25-30°C旋转蒸发lOmin，制得乳白色的环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体。④将步骤③制得的脂质体通过S印hadexG-75柱，以PH值7.15的磷酸缓冲溶液为洗脱液洗脱，除去未包封的环胞苷二肉豆蔻酸酯。6.根据权利要求5所述的环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体的制备方法，其特征在于采用反相蒸发法；运用S印hadexG-75柱层析、以PH值7.15的磷酸缓冲溶液为洗脱液、洗脱除去未包封药物，得到本发明的产品。全文摘要本发明是关于环胞苷二肉豆蔻酸酯脂质体及其制备方法，属于医药
技术领域：
。本发明克服了环胞苷二肉豆蔻酸酯因水溶性差造成的给药难和吸收难的缺点，提高了环胞苷二肉豆蔻酸酯的疗效。发明人采用反相蒸发法，由环胞苷的酯化衍生物3’，5’-环胞苷二肉豆蔻酸酯与作为辅料的天然卵磷脂、胆固醇、稳定剂二硬脂酰基磷脂酰胆碱制成脂质体。本发明制备的脂质体是一种独创的新型环胞苷衍生物缓释靶向制剂，它具有包封率高(82.5±3.2)％、粒度分布均匀及稳定性高的特点。本发明的制备工艺简单，主要工艺参数易于控制，操作条件较温和，便于工业化生产。本发明可用于治疗白血病、恶性淋巴瘤及某些实体瘤。文档编号A61P35/02GK101822639SQ20101001163公开日2010年9月8日申请日期2010年1月15日优先权日2010年1月15日发明者孙衍增,张丽,王继波,石振燕申请人:青岛大学