专利名称：白果蛋白超微粉的制备方法
技术领域：
本发明设计一种蛋白制备提取领域，尤其涉及一种白果蛋白超微粉的制备方法。
背景技术：
银杏白果，内含多种生物活性营养物质，每百克干果中含蛋白质134g，脂肪3g，碳 水化合物712g，钙196mg，胡萝卜素02mg，硫胺素044mg，尼克酸26mg，另外还含有少量的银 杏黄酮、白果黄素、白果内酯等生物药用活性物质。李时珍《本草纲目》中有载“白果熟食 温肺益气，定喘嗽，缩小便，止白浊。生食降痰，消毒杀虫。”白果具有明显的抑制结核杆菌生 长、抗癌、抗衰老、抗疲劳、耐缺氧的作用。食则补心养气，益肾润肺，涩精固元，延年益寿；入 药可止咳平喘，对老人哮喘、妇女白带、小儿遗尿等皆有一定的疗效。1992年被我国卫生部 确定为药食同源果品。白果不仅含有黄酮、萜内酯、蛋白质和微量元素，而且银杏油脂中主要含有两种必 需脂肪酸，即亚油酸和a-亚麻酸。在传统的加工工艺中，没有脱毒工艺，产品中残留氰氢 酸、白果酸、氢化白果酸和白果酚等银杏毒素，容易引起不良反应，影响人的神经系统、消化 系统、皮肤系统和造血系统。而且由于含有不饱和脂肪酸容易引起蚝败变质，采用常规的破 碎对白果有效成份的提取率很低，因此，制约了白果粉体产品的深加工。如何将传统的白果 干果的加工转向白果超微粉体及其高浓蛋白产品，国内外尚没有任何报道。近年来，超微细粉化技术在中药粉碎中的应用日趋增多，运用超声粉碎、超低温粉 碎等现代超细微加工技术，可将原生药从传统粉碎工艺得到的中心粒径150 200目的粉 末(75 ym以下)，提高到现在的中心粒径为5 10 ym以下，在该细度条件下，一般药材细 胞的破壁率>95%。这种新技术的采用，可使白果其中的有效成分直接暴露出来，从而使有 效营养成分的溶出更加迅速完全，最大程度地保留了银杏白果中生物活性物质及各种营养 成分，提高了药效。C02超临界萃取工艺在植物油及植物提取物中应用广泛，国内有文献报道利用C02 超临界萃取工艺萃取白果油，但如果将白果普通的机械粉碎，再进行co2超临界萃取，白果 油的提取率很低，大量的白果油及酚酸类成分仍残留于粉体中，影响白果进一步深加工。因 此，银杏白果超细粉体及其功能化食品的深加工藕合技术研究是银杏产业近期研究的热点 和亟待解决的问题。近年来，关于蛋白质以及多肽的研究进展迅速，尤其是一些具有生理和药物活性 的天然多肽和蛋白质，目前已有为数不少的新成分被发现，它们不仅在调节机体功能上发 挥重要的作用，而且在抗艾滋病、癌症、心脑血管等疾病上也具有活性。白果富含活性蛋白质，具有很好的药用价值。国外学者从白果槲寄生及同科植物 中分到Viscotoxin A2，A1，B及PhOrat oxin等同源多肽，有46个氨基酸残基组成。国内 华中农业大学的邓乾春采用(NH4)2S04盐溶盐析法得到了一种白果清蛋白(GAP)，经分离纯 化从中鉴定出一种在GAP中占主要级分的新蛋白，命名为GAP II a，分子量为29248U，氨 基酸组成为脂肪族氨基酸残基占33. 21 % (共90个)，芳香族氨基酸残基占7. 38 % (共20个)，羟基氨基酸残基与含硫氨基酸残基占26. 57 % (共72个)，酸性氨基酸残基及其 酰胺占23. 61% (共64个)，碱性氨基酸残基占6. 27% (共17个)。经证实GAP具有较 明显的生物活性，具有抗生物氧化活性，能显著增强小鼠的免疫调节作用，增强免疫功能低 下模型小鼠的免疫调节能力，刺激模型小鼠造血功能的恢复，并能提高模型小鼠的抗氧化 能力，且对Y射线辐射损伤小鼠的保护作用。黄文报道了 GAP对黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、小麦全烛病菌(Gaeumannomyces graminis)等真菌有很强的抑制作用，而且对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 大肠杆菌(Escherichia Coli)等细菌也有一定的作用。陈晓清等人从海水小球藻 (Chlorellapacifica)提取液中通过硫酸铵沉淀，DEAE-52离子交换层析和S印hadexG_200 凝胶过滤层析后分离纯化出1种抗菌蛋白，经测定，两个亚基的相对分子量分别为61kD和 70kD，且纯化的蛋白质对产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和中华根霉(Rhizopus chinensis)有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肠炎病病 原菌(Ameromonas punctata)也有抑制作用，其抗真菌活性比抗细菌强。在蛋白质的提取分离方法方面，BETTY A.EIPPER于1972年提取了小鼠微管蛋 白，采用了以下方法于0-4°C下粉碎并均勻化小鼠脑组织，室温下放入pH6. 5的0. 05mol/ L焦磷酸钠，2. 5mmol/L MgCl2溶液，0. 24mol/L蔗糖溶液和0. lmmol/L鸟苷酸溶液中，提取 可溶性蛋白(离心条件16，000Xg，30min)，上清液进行饱和硫酸铵分级沉淀，分级范围为 30 % 50 %。蛋白提取液上DEAE-纤维素树脂，用PPMg (0. 05mol/L焦磷酸钠，2. 5mmol/ LMgCl2)溶液平衡树脂，O.Olmol/L NaCl溶液淋洗，再用0. 26mol/L NaCl溶液洗脱微管蛋 白。Mary. C KENNEDY等人对牛肝脏的Cytosolic Aconitase蛋白进行了一系列纯化步骤。 制备过程都形成了一定的模式，即破碎勻质一超声盐提取一饱和盐析一透析除盐一上离子 交换层析柱一透析除盐一上凝胶层析柱一透析除盐一进行电泳制备或分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种高品质的白果高浓蛋白超微粉的加工方法。通过本发明 制备的白果高浓蛋白超微粉，破壁率大于98%，总蛋白大于90%、分子量分布17KD-20KD、 粒径为1_25μπι;同时制备原味高品质白果油。本专利制备的高浓蛋白超微粉无油脂和氰 氢酸、白果酸、白果酚等白果毒素残留，而且分子量分布易为人体吸收，能明显提高机体的 免疫功能。该方法具有资源利用率高、成本低，产品附加值高的特点，而且对环境友好。本发明的技术解决方案一种白果蛋白超微粉的制备方法，由以下步骤组成第一步，低温干燥将秋季收集的新鲜白果在-10°c至-50°c下冷冻干燥，再除去 外壳和内衣，将果仁粉碎，红外快速测定，得到含水重量百分比小于6%、粒度在10目-50目 的白果粗粉，第二步，低温破壁在温度低于10°C下，将所述白果粗粉采用喷式低温气流粉碎 机破壁粉碎得到白果超微粉，气流粉碎机分级轮频率20-60HZ，空气压力0. 8-1. 5MPa,加料 速度为lkg/h-3kg/h，粉碎时间5-50min，第三步，低温去脂将白果超微粉采用CO2超临界萃取，萃取压力10_30MPa，萃取 温度25-50°C，萃取时间l-4h，C(V流量10-30L/h，采用质量浓度为-15%石油醚作为夹带剂，第四步，低温盐溶解和盐析采用超声波在温度低于10°C下提取所述CO2超临界 萃取剩下的白果超微粉，提取剂为0. 15-0. 30mol/L NaCl盐溶液，所述白果超微粉与提取剂 比例为1 4-1 20(g/ml)，提取时间10-60min，提取次数2-6次，第五步，盐析采用质量浓度为10% -15%单宁酸、质量浓度为10% -15%的三氯 乙酸(TCA)、(MM)2SO4 (APS)、乙醇和丙酮等任一种溶剂或几种混合溶剂加入到超声波低温 提取液中，盐溶液与提取液的体积比为1 3-5，沉淀离心，分离得到白果蛋白，第六步，膜分离将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，采用分子量15KD-25KD 的超滤离心浓缩管分离，超滤膜为聚醚砜，离心力12000g-15000g，离心时间10-50min，得 到白果蛋白的浓缩液，第七步，色谱柱分离采用二乙氨基乙基纤维素(DEAE-cellulose)和葡聚糖凝胶 G50 (Sephadex G50)柱色谱依次分离白果蛋白的浓缩液，洗脱剂采用pH = 8. 0的0. I-Imol/ L不同浓度的NaCl溶液，第八步，冷冻干燥将色谱柱分离得到的高浓蛋白液采用-10°C至-50°C冷冻干燥 15-48h，再低温气流破壁，低温气流破壁的条件与第二步低温破壁的条件相同，使其粒度在 1-25 μ m0上述技术方案中，所述白果品种为泰兴龙眼、随州圆型果、泰兴大佛指、灵川梅型 果、兴安长柄果、灵川马玲果中的一种。第二步低温破壁的温度为o-io°c。超声波提取的温 度为0-10°C。所述超临界萃取温度为40°C、压力为20MPa、流速为15L/h、时间为3h。第五 步所述溶剂为(MM)2SO4或质量浓度为10% -15%的单宁酸。每年秋天收集的新鲜白果除去外种皮后，白果的水份含量高于50%，在自身酶的 作用下发生化学成分的代谢，酶降解，容易发霉变质，蛋白质和油脂等营养成分破坏。因此， 传统的保存方法是将白果在太阳下晒干、或热烘干，白果的水分仍在10%左右，由于高温容 易引起蛋白质的化学变性，因此，本专利的加工方法为了保证白果的品质和蛋白质不发生 降解，采用冷冻干燥的方法，将含水量在50% -65%新鲜白果脱壳后在-10°c至-50°c冷冻 干燥，冷冻时间6-50小时，优选-15°C -25°C，冷冻时间10-28小时，含水量< 6%。如果不 采用本专利技术处理，由于水份高(一般高于15%或达到50%以上)白果蛋白易酶解，产 生异味，也容易霉变，影响到白果的风味。如果采用热干燥或日晒处理，白果原有的挥发性 成分容易损失，同时油脂容易产生酸败。本专利低温冷冻的白果含水率低于6%，不仅易于 保存，比传统的方法可延长货架期半年，而且保持了白果的原质和原风味。传统的白果蛋白粉的制备是先将新鲜白果高温蒸煮，使壳变脆，用机械辊筒轧壳 分离，再用直接蒸气冲去内衣膜等预处理，果仁用去离子水喷淋后凉干，用磨浆机打成固体 粒度在200μπι以上的浆液，50°C -80°C真空浓缩，制成固含量25% -35%的悬浮液，再在进 风温度190°C -220°C下喷雾干燥得含水量在10%左右的粉体；冷冻干燥白果粉末中蛋白质 含量11. 78%大于喷雾干燥白果粉末中蛋白质含量9. 76%。这是由于经过高温处理，白果 蛋白、多肽、酶等活性物已变性，不能保持原有蛋白和多肽的结构。不同干燥方式对白果粉末颗粒度产生影响，冷冻干燥的白果粉末颗粒呈现长形、 针形、扁片形、椭圆形等，形状多样，且不规则(图la)；而喷雾干燥的白果粉末颗粒大多接 近球形(图lb)。这是由于喷雾干燥经过了雾化器的造粒过程，使颗粒均勻且形状基本相
5同；冷冻干燥干燥过程中物料静止在平面上，没有造粒过程，料液随意结合，形成的颗粒形 状多样化。本发明将新鲜白果在-10°C至-50°C冷冻干燥，冷冻干燥后的白果经机械辊筒破 壳分离，风机分级去除囊衣、胚芽后，采用喷式低温气流粉碎机破壁粉碎，气流粉碎机分级 轮频率20-60HZ，温度< 10°C，空气压力0. 8-1.5MPa，加料速度为lkg/h_3kg/h，粉碎时间 5-50min,白果超微粉的粒径为1_25 μ m，破壁率大于98 %，不仅有效地保持了白果蛋白质 的活性组分未变性，而且破壁可以大大提高超临界对油脂的萃取率，比传统的方法可延长 货架期半年，而且保持了白果的原质和原风味，有利于提高盐溶性蛋白质的提取率。白果粗粉中含有3-10%油脂，容易引起蚝败变质，因此将白果粉中的油脂分离可 延长白果粉的保存期。传统的办法采用压榨制油和非极性溶剂提取制油。本发明收集江苏泰兴大佛指，扁佛指，七星果，龙眼等七个品种的白果，对比超声 波萃取法、索氏提取法和二氧化碳超临界萃取白果油的工艺，分别考察对白果油收率的影 响。如表1。表1不同萃取方式对白果油脂萃取率比较
油脂收率马铃大佛子龙眼东台东乡西乡蝙蝠指七星 (% )
权利要求
一种白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于由以下步骤组成第一步，低温干燥将秋季收集的新鲜白果在 10℃至 50℃下冷冻干燥，再除去外壳和内衣，将果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6％、粒度在10目 50目的白果粗粉，第二步，低温破壁在温度低于10℃下，将所述白果粗粉采用喷式低温气流粉碎机破壁粉碎得到白果超微粉，气流粉碎机分级轮频率20 60Hz，空气压力0.8 1.5MPa，加料速度为1kg/h 3kg/h，粉碎时间5 50min，第三步，低温去脂将白果超微粉采用CO2超临界萃取，萃取压力10 30MPa，萃取温度25 50℃，萃取时间1 4h，CO2流量10 30L/h，采用质量浓度为1％ 15％石油醚作为夹带剂，第四步，低温盐溶解和盐析采用超声波在温度低于10℃下提取所述CO2超临界萃取剩下的白果超微粉，提取剂为0.15 0.30mol/L NaCl盐溶液，所述白果超微粉与提取剂比例为1∶4 1∶20(g/ml)，提取时间10 60min，提取次数2 6次，第五步，盐析采用质量浓度为10％ 15％单宁酸、质量浓度为10％ 15％的三氯乙酸(TCA)、(NH4)2SO4(APS)、乙醇和丙酮等任一种溶剂或几种混合溶剂加入到超声波低温提取液中，盐溶液与提取液的体积比为1∶3 5，沉淀离心，分离得到白果蛋白，第六步，膜分离将盐析得到的白果蛋白溶于去离子水中，采用分子量15KD 25KD的超滤离心浓缩管分离，超滤膜为聚醚砜，离心力12000g 15000g，离心时间10 50min，得到白果蛋白的浓缩液，第七步，色谱柱分离采用二乙氨基乙基纤维素(DEAE cellulose)和葡聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱色谱依次分离白果蛋白的浓缩液，洗脱剂采用pH＝8.0的0.1 1mol/L不同浓度的NaCl溶液，第八步，冷冻干燥将色谱柱分离得到的高浓蛋白液采用 10℃至 50℃冷冻干燥15 48h，再低温气流破壁使其粒度在1 25μm。
2.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于白果品种为泰兴龙 眼、随州圆型果、泰兴大佛指、灵川梅型果、兴安长柄果、灵川马玲果中的一种。
3.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于第二步低温破壁的 温度为o-io°c。
4.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于超声波提取的温度 为 O-IO0Co
5.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于第三步所述超临界 萃取温度为40°C、压力为20MPa、流速为15L/h、时间为3h。
6.根据权利要求1所述的白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于第五步所述溶剂为 (MM)2SO4或质量浓度为10% -15%的单宁酸。
全文摘要
本发明公开一种白果蛋白超微粉的制备方法，其特征在于低温干燥新鲜白果、低温气流破壁，低温去脂、通过盐溶解和盐析、10KD-30KD超滤膜分离、DEAE-cellulose柱分离、冷冻干燥、低温气流粉碎等工艺，制备的白果蛋白超微粉分子量在17KD-20KD，含水量＜5％，总蛋白大于90％，粒径为1-25μm，破壁率大于98％。制备的白果油收率明显提高，相对于普通白果粉超临界萃取的白果油收率提高20％-35％。
文档编号A61P37/04GK101983969SQ201010112088
公开日2011年3月9日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者叶建中, 周彬, 王成章, 程耀波, 陈虹霞, 陈西娟, 马维新 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所;邳州鑫源生物制品有限公司