专利名称：一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体片段及其单克隆抗体与应用。
背景技术：
促性腺激素释放激素(GnRH)起初定义为十肽激素。它的功能是刺激促性腺激素 的释放。通过与特定细胞膜外有GnRH受体的垂体前叶细胞特异性地结合，释放出如LH和 FSH等促性腺激素。后续研究表明，GnRH与其受体还在垂体以外许多正常以及恶性细胞或 组织中担当角色，可是在垂体以外细胞或组织的角色尚未被完全了解。然而，GnRH或其类 似物对不同人体组织器官的癌细胞的抗增殖功效已经被报道。许多GnRH类似物连接细胞 毒药物作为抗癌药的临床研究已经报道。事实上一部分抗癌药物就是制成GnRH或其类似 物与抗癌细胞毒素成分，如AN-152或AN-207的共价连接。另一部分则是用GnRH类似物 及其拮抗性类似物作为抑制肿瘤生长的药物。与一般化疗药物相比，这些方法已经显现其 治疗癌症的有效和低毒性。与GnRH相类似，特异性针对细胞表面GnRH受体的单克隆抗体具有屏蔽受体 功能，阻止体内外癌细胞的增殖活动或改变生殖功能。近年来以抗体为基础的抗癌 药物的发展已经成为一种选择性的人体癌症治疗方法(Pawson，A.J.，Mauds ley, S.， Morgan, K. , Davidson, L. , Naor, Ζ. , and Millar, R. P. Inhibition of human Type I Gonadotropin-releasing hormonereceptor(GnRHR) function by expression of a human Type II GnRHRgene fragment. Endocrinol. 2005 ； 146 (6) :2639_2649)。然而癌细胞表面的药物靶点应当明确且非常丰富，作用机理应当说明清晰。这种 方法的优点是减少副作用，并保持治疗用抗体药物在循环中的相对长半衰期(5-20天)。 综合这些因素，抗GnRH受体单克隆抗体具有靶向的特异性和抑制癌症细胞生长的确实功 效，将成为中和或杀死癌症细胞的理想选择。抗GnRH受体单克隆抗体细胞株的制备一般而言Kohler and Milstein的方法就足以完成制备所需适用的抗体；当然也 有其他方法，如(J. L.，and Herzenberg. L. Α. (1982) J. Immunlo. Meth. 52 1.)经过骨髓瘤细胞与血蓝蛋白结合GnRH受体肽(附_29)免疫的哺乳动物脾细胞或 外周血淋巴细胞融合，制造出能够分泌理想单克隆抗体的杂交瘤传代细胞株。特别需要指 出的是骨髓瘤细胞株的来源必须与抗体分泌细胞同种。已经有成熟的骨髓瘤细胞株来源于 小白鼠和大白鼠，这些哺乳动物可以产生高质量的多克隆抗血清和免疫球蛋白分泌细胞。 任何成功的传代细胞株都可以用作同种来源的分泌细胞。另外某些被感染的抗体分泌细胞 也可以传代，如EB病毒。这些技术都可以用做发明分泌免疫球蛋白传代细胞株。在聚乙二醇等活化剂存在条件下，骨髓瘤细胞与抗体分泌细胞融合成为杂交瘤细 胞。现在已经有公开发表的具体标准和方法，在此不做陈述。决定成败的关键更主要的是 传代细胞株的选择与传代方法，以及选择抗体分泌细胞的种群。后续则依赖于应用正确的致敏源促使哺乳动物产生这些细胞。首选的杂交瘤制备方法，分离免疫小鼠的脾细胞并与同种骨髓瘤细胞株进行融 合，如NS-1骨髓瘤细胞加入50% PEG，细胞融合后使其在特定的培养基中生长。其他一些 成熟的骨髓瘤细胞株有HAT或AT敏感细胞株，他们不能够在含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷 的HAT培养基生长，或者不能在含有重氮丝氨酸和次黄嘌呤的AH培养基生长。因此，只有与正常细胞融合的传代细胞才能够在选定的培养基中生存；未融合的 HAT或AH敏感细胞将凋亡，(不能传代的正常细胞即便融合最终还是会凋亡)。只有培养 融合的传代细胞才能够经过筛选而得到理想的抗体。培养在选定培养基中的融合细胞或其他方法的细胞传代需经过筛选。 而筛选细胞 的理想特征就是可以分泌抗体。有许多针对GnRH受体识别抗体的筛选方法可以采用，如基 于免疫反应的试验检测培养基，包括免疫蛋白印迹试验，酶联免疫吸附试验和放射免疫试 验等等。确定了一个可以分泌正确抗体的细胞株，此抗体便可以通过标准的纯化技术分离 出来。另外抗体的标记也有另外的标准技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆 抗体或其片段。本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述抗促性腺激素释放激素受体的单 克隆抗体或其片段的应用。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种鼠源杂交瘤细胞系，其保藏号为ATCC GHR-106PTA-10252(保藏单位美国弗 吉尼亚洲马纳萨斯镇大学大道10801号美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection (ATCC )、地址美国弗吉尼亚洲马纳萨斯镇大学大道10801号，Virginia 20110-2209USA)、保藏日期 2009 年 8 月 5 日、保藏编号 GHR-106PTA-10252)。一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，被命名为GHR-106，是由上述鼠源 杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。优选的，上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链 可变区、重链可变区基因及其编码的氨基酸序列为序列表中<400>1、<400>2、<400>3和 <400>4所示的序列，即所述单克隆抗体的轻链可变区的蛋白质序列为MDSQAQVLILLLLffVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYffASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIK其重链可变区的蛋白质序列为QVQLKESGPGLVAPSQSLSI
TCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEffLGMIffGGGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARGNDGYYSFAYffGQGTLVTVSS其中轻链三个CDR区的氨基酸序列为CDR1为KSSQSLLNSRTRKNY LA, CDR2为WASTRE S，CDR3为KQSYNLYT ；重链三个CDR区的氨基酸序列为 CDRl 为 R Y S V H，CDR2 为 MIWGGGSTDYNSALKS，CDR3 为 GNDGYYSF A Y。优选的，上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，对其氨基酸序列进行改 变、缺失或添加一个或几个氨基酸，仍保留相同的功能。优选的，上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，与细胞表面GnRH受体的 N1-29氨基酸片段发生特异性反应，与GnRH受体反应的分离常数介于ICT7M和ICT9M之间。优选的，上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，与GnRH受体的结合被 GnRH竞争，使培养的肿瘤细胞因调低选择性核糖体蛋白而凋亡。优选的，上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其人源化形式能够与细 胞表面表达GnRH受体的任何癌细胞或人体组织反应，抑制肿瘤生长。上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体作为制备抗肿瘤药物的应用。上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，可视为一种GnRH的衍生物，具有 调节生殖生理机能的作用。上述抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体的制备方法根据背景技术中记述的抗促性腺激素释放激素受体单克隆抗体的制备方法，将纯 化分离的细胞株进行传代与选择在人体细胞，GnRH受体是一种G蛋白样的膜转移蛋白，单克隆抗体只会与GnRH受 体在细胞外区域的功能区氨基酸连接，在这种情况下，在人体细胞外区域GnRH受体的棕榈 酰寡肽所对应的N基端氨基酸残基(1-29，182-193，195-206和293-306)被分别与血蓝蛋
H 纟口口。这些与血蓝蛋白结合的合成肽分别作为抗原物质免疫小鼠，制成分泌特异性单 克隆抗体杂交瘤，经过多次细胞融合并筛选许多单克隆抗体，最终产生一株单克隆抗体， GHR-106，即通过血蓝蛋白结合肽(N1-29)免疫并选择其对人体GnRH受体具有高度特异性 和亲和性的特性。本发明的有益效果是本发明提供了鼠源杂交瘤细胞系(保藏号为ATCC GHR-106PTA-10252)及其分泌 的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106，所述抗体能够通过与肿瘤细胞表面 受体结合从而对肿瘤细胞起到有效的抑制作用，继而有望用于肿瘤的诊断和治疗过程以及 制备抗肿瘤药物的应用。
图1 (A)为酶标免疫法证实GHR106单克隆抗体与人工合成的含GnRH受体N端1-29氨基酸序列的多肽的结合，随GHR106单克隆抗体量的增加而增加；图1 (B)为酶标免疫法证实GHR106单克隆抗体与0C_3_VGH肿瘤细胞的结合随 GHR106量的增加而增加；图2 (A)为GnRH I对GHR106单克隆抗体与0C-3-VGH肿瘤细胞结合的抑制作用；图2 (B)为人工合成的含GnRH受体N-端1_29氨基酸序列的多肽对GHR106单克 隆抗体与0C-3-VGH肿瘤细胞结合的抑制作用；图3为所培养的0C-3-VGH肿瘤细胞经GHR-106处理后所发生的细胞程序性凋 亡；图4为所培养的0C-3-VGH肿瘤细胞经GHR-106单克隆抗体处理，能够调低四种 所选的核糖体蛋白的信使RNA的表达；图5为经免疫组织化学染色检测出在不同病程分期卵巢癌所表达的GnRH受体；图6为GHR106单克隆抗体的核苷酸序列及氨基酸序列。保藏信息分类名词鼠源杂交瘤细胞系(Murine hybridoma)保藏单位名称美国标准生物品收藏中心(ATCC)保藏单位地址美国弗吉尼亚洲马纳萨斯镇大学大道10801号(Licensingand Services 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209USA)保藏日期2009年8月5日保藏号GHR-106PTA-1025具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。实施例1如图6所示，一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其轻链可变区的蛋 白质序列为MDSQAQVLILLLLffVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYffASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIK其重链可变区的蛋白质序列为QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEffLGMIffGGGSTDYN
SALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARGNDGYYSFAYffGQGTLVTVSS
所述杂交瘤细胞系及其分泌的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体的具体 制备方法如下对应于人类GnRH受体N-端氨基酸序列1-29，182-193，195-206或293-306的人 工合成的多肽按常规方法分别与KLH(血蓝蛋白)结合制成免疫原物质(四种新抗原)， 200微升含100微克合成肽-KLH抗原的磷酸缓冲液、与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，混 合物皮下注射到三只BALB/C小鼠体内.2星期及4星期后，分别再次注射同样计量的合成 肽-KLH抗原，不过换用弗氏不完全佐剂.免疫小鼠的抗体活性由ELISA方法测定，微孔板 分别包被以上四种合成肽.碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体，用p-NPP显 色，在405nm读取数据.免疫活性较高的小鼠脾细胞与SP-2脊髓瘤细胞融合以制备杂交 瘤，用ELISA方法筛选和鉴定所制备的单克隆抗体，共筛选并建立了 15株杂交瘤，其产生的 抗体能分别与GnRH受体结合.其中免疫活性最高的抗体是用GnRH受体N-端氨基酸序列 1-29的合成肽为免疫原产生的，命名为GHR106单克隆抗体，GHR-106的亚型为IgGl。实施例2 GHR-106单克隆抗体的特性 用GnRH受体N端1_29氨基酸片段包被微孔板进行ELISA试验，GnRH受体与抗促 性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106之间的分离常数介于10_7M和10_9M之间。将 100微升不同浓度的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106加入反应微孔，在 37°C反应1小时后倒掉未反应的抗体，反应微孔清洗一次后再加入100微升碱性磷酸酶标 记的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体，37°C反应1小时.反应微孔清洗五次后再用p-NPP显 色，在405nm读取数据。如图I(A)所示，ELISA实验显示抗促性腺激素释放激素受体的单 克隆抗体GHR-106与包被的合成肽(对应人GnRH受体N端1_29氨基酸片断)呈剂量依赖 性结合。用0C-3-VGH卵巢癌细胞包被微孔板进行ELISA试验，其余步骤同上，如图1 (B)所 示，ELISA实验显示抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106与包被的0C-3-VGH 癌细胞呈剂量依赖性结合。可见，GHR-106单克隆抗体既可以与GnRH受体结合，也可以与肿瘤细胞结合。实施例3GnRH I或GnRH受体N端1_29氨基酸片段对GHR106单克隆抗体与0C-3-VGH肿瘤 细胞结合的抑制作用.将100微升2 μ g/ml抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106加入包被 0C-3-VGH卵巢癌细胞的微孔，实验条件同实施例2。如图2(A)所示，其结合能力受不同浓 度的GnRH I的抑制，相对百分比信号与GnRH浓度成反比。将100微升2 μ g/ml抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106加入包被 合成肽(符合人GnRH受体N端1-29氨基酸片段)的微孔，实验条件同实施例2。如图2(B) 所示，其结合能力受不同浓度的合成肽(人GnRH受体N基端1-29氨基酸片段)的抑制，相 对百分比信号与合成肽的浓度成反比。通过用0C-3-VGH卵巢癌细胞提取物进行免疫印迹 实验，显示与抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106结合形成的蛋白带分子量 为60KDa，与人GnRH受体相符合。试验显示，包被在微孔板的癌细胞，抗促性腺激素释放激 素受体的单克隆抗体GHR-106与GnRH受体结合，并依不同含量抑制了 GnRH I与GnRH受体的结合。这个结果证实了抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106对人体GnRH 受体具有高度特异性，即GHR-106单克隆抗体通过竞争性和GnRH受体结合从而抑制了 GnRH 与其受体的结合。实施例4GHR-106单克隆抗体抑制肿瘤细胞生长的治疗效果GHR-106单克隆抗体在体外对癌细胞的抗增殖效果用1 μ g/ml GHR-106 ( ■)禾口 0. 1 μ g/ml GnRH ( □)处理 0C-3-VGH 卵巢癌细胞， 凋亡的百分比增加，其中癌细胞培养条件RPMI_1640培养液，37°C，5%C02。所谓癌细胞凋 亡百分比增加的判断，在同时加入正常小鼠IgG，通过TUNEL试验予以证实。如图3所示，当 抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106浓度达到10 μ g/ml时，经过24-72小时 培养，癌细胞出现凋亡。用抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106 (lug/ml)(灰色)及 GnRH(0. 1 μ g/ml)(黑色)一起培养24小时的0C-3-VGH卵巢癌细胞，如图4所示，选择性 核糖体蛋白(P0、P1、P2和L37)的mRNA的表达下降，GAPDH的mRNA 的表达被100%用作内 部控制。PCR产物用1. 5%琼酯胶电泳检测，观察到与抗促性腺激素释放激素受体的单克隆 抗体GHR-106及GnRH —起培养24小时的癌细胞，表达mRNA的选择性核糖体蛋白包括P0、 P1、P2和L37出现下降。其中用于PCR的引物分别为PO :5，-TTGTGTTCACCAAGGAGG-3，和 5，-GTAGCCAATCTGCAGACAG-3，Pl :5，-CAAGGTGCTCGGTCCTTC-3，和 5，-GAACATGTTATAAAAGAGG-3，P2 5' -TCCGCCGCAGACGCCGC-3‘和 5’ -TGCAGGGGAGCAGGAATT-3’L37 :5，-CAGAAGCGAGATGACGAAGG-3，和 5，-CCAGAACATTTATTGCATGAC-3，GAPDH :5’ -GAAATCCCATCACCATCTTCC-3’ 和 5’ -CCAGGGGTCTTACTCCTTGG-3’PCR -MV 40s, 50°C 40s, 72°CImin (20-35 循环)从所得到的结果看，抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106与GnRH受 体在癌细胞表面发生特异性结合会引发癌细胞的凋亡。此外，对于生殖组织或器官，被特异性人源化抗体封闭的GnRH受体也会出现影响 生殖功能的结果，包括人体排卵，精子生成等生育调节功能；另一方面，人源化抗体药物能 够表现为长效GnRH类比物，可以改变人体的生殖功能。实施例5免疫组织化学染色发现用抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106针对GnRH受体，对39例确 诊为不同分期卵巢癌病人的卵巢组织实施的特异性免疫组织化学染色，该实验由英属哥伦 比亚大学医院进行。如图5所示，阳性染色率明显与卵巢癌的病程分期相关，I期病例约 40%为阳性，晚期(III期和IV期)病例的阳性率则高达73%至100% ；而正常卵巢组织 (13例)均未见阳性染色。通过实验证实了癌组织所表达的GnRH受体伴随癌症病程的延续 和发展，会不断增加。上述结果显示在确诊卵巢癌不同分期病人(39例)的卵巢组织呈高比例阳性，且 随病程阳性率明显增高，以相同的方式检测无卵巢癌病人的卵巢组织全部呈染色阴性。故GHR-106单克隆抗体有望用于与抗体结合的标识物的识别以及病理切片的肿瘤诊断。实施例6GnRH受体在人体癌细胞的表达如下表所示，通过RT-PCR试验证明GnRH受体的mRNA在超过90%的人体癌细胞株 中都有表达。这个结论清楚地说明在所有癌细胞，不论是发生于哪种组织器官，实际上都会 表达GnRH受体。 其中用于PCR的引物为GnRHRl 5，-CAGAAGAAAGAGAAAGGGAAAAAGC—3，禾口5' -GATGAAAAGAGGGATGATGAAGAGG-3’ ；用RT-PCR检测表达GnRHRl的癌细胞株 * 信号的强弱显示为，+(强)，士(弱)，_(看不见)。** 正常增生和增殖的纤维母细胞来源与胚胎肺组织。通过上述实施例可以清楚知道，GHR-106单克隆抗体能够有效的竞争性结合GnRH 受体，从而进一步证实了 GHR-106单克隆抗体对于肿瘤细胞的抑制作用。上述参照实施例对该一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体片段及其单
克隆抗体与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出
10若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之 内。
权利要求
一种鼠源杂交瘤细胞系，其保藏号为ATCC GHR-106PTA-10252。
2.一种抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其特征在于是由上述鼠源杂交瘤 细胞系分泌的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其特征在于所 述单克隆抗体的轻链可变区、重链可变区基因及其编码的氨基酸序列为序列表中<400>1、 <400>2、<400>3和<400>4所示的序列，其中轻链三个⑶R区的氨基酸序列为⑶Rl为K S SQSLLNSRTRKNYLA, CDR2 为 WASTRE S，CDR3 为 KQSYNLYT;重 链三个CDR区的氨基酸序列为CDR1为R YSV H，CDR2为M IffGGGSTDYNSAL K S, CDR3 为 GNDGYYSFAY。
4.根据权利要求2所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其特征在于对 其氨基酸序列进行改变、缺失或添加一个或几个氨基酸，仍保留相同的功能。
5.根据权利要求2所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其特征在于与 细胞表面GnRH受体的N1-29氨基酸片段发生特异性反应，与GnRH受体反应的分离常数介 于10_7M和10_9M之间。
6.根据权利要求2所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其特征在于与 GnRH受体的结合被GnRH竞争，使培养的肿瘤细胞因调低选择性核糖体蛋白而凋亡。
7.根据权利要求2所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体，其特征在于其 人源化形式能够与细胞表面表达GnRH受体的任何癌细胞或人体组织反应，抑制肿瘤生长。
8.权利要求2-7之一所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体或其片段作为 制备抗肿瘤药物的应用。
9.根据权利要求8所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体或其片段作为制 备抗卵巢癌药物的应用。
10.权利要求2-7之一所述的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体或其片段，可 视为一种GnRH的衍生物，具有调节生殖生理机能的作用。
全文摘要
本发明提供了一种鼠源杂交瘤细胞系(保藏号为ATCC GHR-106PTA-10252)及其分泌的抗促性腺激素释放激素受体的单克隆抗体GHR-106，所述抗体能够通过与肿瘤细胞表面受体结合从而对肿瘤细胞起到有效的抑制作用，继而有望用于肿瘤的诊断和治疗过程以及制备抗肿瘤药物的应用。
文档编号A61P15/00GK101864398SQ20101015903
公开日2010年10月20日 申请日期2010年3月24日 优先权日2009年9月3日
发明者李吉祐 申请人:李吉祐