专利名称：一种复方免疫佐剂及疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复方免疫佐剂及含有该免疫佐剂的疫苗。
背景技术：
抗原单独免疫时，不足以产生免疫原性，特别是高纯度的抗原(如多肽)。因此，需 要用不同种类的佐剂来增强抗原所诱导的免疫应答。加入了佐剂，能够减少疫苗中抗原的 数量或强化次数或延长疫苗的保护时间。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是近年来发现的一类新的细胞表面的 天然免疫受体，它能够特异性地识别侵入的病原微生物，通过偶联信号转导途径，激活天然 免疫细胞，最终引起一系列的炎症反应。TLRs不仅能激活天然免疫系统，而且也为激活获得 性免疫提供共刺激信号。TLRs受体激动剂可以最大化的活化树突状细胞，提高抗原识别和 递呈的能力，显著提高机体细胞免疫水平。现有技术中，咪喹莫特、CpG均能够刺激Thl免疫反应的活性，而白油具有刺激Th2 免疫反应的活性。咪喹莫特为Toll样受体7/8激动剂，CpG为Toll样受体9激动剂，它们 具有刺激机体免疫的活性，尤其是提高细胞免疫反应的性能。咪喹莫特或CpG单独使用，可 以增强某些抗原的细胞免疫反应，刺激细胞因子的分泌，在以细胞免疫为主的疾病的预防 方面已有研究，如用于艾滋病疫苗。咪喹莫特与R_848(Toll样受体4激动剂)的配伍使用， 显著提高Thl免疫反应。CpG可以与蛋白质抗原、多肽抗原制备疫苗，显著提高疫苗的细胞 免疫活性，CpG佐剂目前仅为单独使用，应用于癌症疫苗的研究。白油佐剂一方面可以作为 抗原库，保护抗原不会被机体迅速降解，让抗原缓慢释放，达到持续刺激的目的，另一方面 也具有刺激Th2免疫反应的活性，提高抗体的产生。然而，目前现有技术中的佐剂往往只单 独刺激Thl或Th2免疫反应，综合佐剂效应还不够理想，特进行此发明的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种复方免疫佐剂，以通过复方组分的协同作用，同时提高 Thl和Th2免疫反应的活性。本发明还提供一种含有该免疫佐剂的疫苗。本发明提供一种复方免疫佐剂，包括分别配制的水相溶液和油相溶液，所说的水 相溶液是浓度为0. 5 2. 0mg/m L的CpG水溶液(即每mL水中加入0. 5 2. Omg的CpG)； 所说的油相溶液是浓度为0. 25 1. 0mg/mL的咪喹莫特白油溶液(即每mL白油中加入 0. 25 1. Omg的咪喹莫特)；水相溶液与油相溶液的体积比为1:6。所说的油相溶液含有Span-80，Span-80在油相溶液中的体积百分含量为6%。所说的油相溶液含有硬脂酸铝，硬脂酸铝在油相溶液中的体积百分含量为2%。所说的水相溶液含有吐温-80，吐温-80在水相溶液中的体积百分含量为4%。其中，咪喹莫特是咪唑并喹啉胺衍生物，其化学名为1-(2_甲基丙基)_4_氨 基-1H-咪唑并[4，5-C]喹啉或1-异丁基-1H-咪唑[4. 5-C]喹啉-4-胺基。其化学结构 式如下
3 分子式C14H16N4，分子量240. 31。可通过纯化学合成获得，因此保证了制药应用所 必须的再现性和安全性。CpG 的序列如下5，-GTTCCTGAC TTGGTGCATCGATG CAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTG TCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGGCTAGA CGTTAGCGT-3’，共137bp。可通过纯化学合成获得或者生物表达获得，因此保证了制药应用 所必须的再现性和安全性。白油已商品化多年，来源和安全性均可得到保证。本发明还提供一种的疫苗，包含有抗原和上述复方免疫佐剂，所说的抗原选自减 毒的活的全微生物、灭活微生物、重组肽和蛋白、合成肽、裂解微生物中的一种或一种以上； 抗原与所说的复方免疫佐剂中的水相溶液和油相溶液的体积比依次为抗原水相溶液 油相溶液=1:1:6。本发明提供的复方免疫佐剂同时包含咪喹莫特、CpG和白油，这些组份复配后，使 佐剂刺激免疫细胞的活性显著提高，增强Thl和Th2免疫活性反应，并加快抗体的产生、增 加抗体效价高水平的维持期，具有显著的协同效应。该佐剂制成的疫苗，不仅可以显著提高 体液免疫反应，也能提高细胞免疫反应，佐剂效应明显、确实。
具体实施例方式下面用本发明的复方免疫佐剂并分别以促性腺激素释放激素(GnRH)合成肽和鸡 新城疫IV作为免疫原制备疫苗，通过对照试验来证明本发明复方佐剂同时含有咪喹莫特、 CpG和白油，具有显著的协同效应，并同时具有Thl和Th2免疫反应。实施例1以促性腺激素释放激素(简称GnRH)合成肽作为免疫原的疫苗的制备抗原为GnRH合成肽(用于动物去势)，由吉尔生化(上海)有限公司合成。该合 成肽序列为Th-GG-Q冊SYGLRPGQ冊SYGLRPGQ冊SYG RPGQHWSYGLRPG。咪喹莫特购自武汉日升科技发展有限公司。复方免疫佐剂及疫苗的制备过程如下(1)配制CpG水相溶液用双蒸水将CpG配制成浓度为2. Omg/mL的溶液，加入吐 温-80，至体积浓度达4%，0. 22 y m滤膜过滤除菌，得水相溶液；(2)配制咪喹莫特油相溶液以每mL白油中加入咪喹莫特l.Omg，配制成浓度为 1. Omg/mL的咪喹莫特白油溶液，加入Span-80和硬脂酸铝，至二者的体积浓度分别达6%和 2%，116°C、30min高压灭菌，得油相溶液；(3)配制疫苗按抗原、水相溶液、油相溶液为1 1 6的体积比，将抗原GnRH 合成肽加入步骤⑴配制的水相溶液中，再加入步骤⑵配制的油相溶液，三者混合成组合 物，12000rpm乳化3 5min，制成W/0乳剂疫苗。以上步骤(3)制得的疫苗按每头份50 yg的剂量分装，冷藏。同时，在抗原剂量不变、体积不变(不足部分用生理盐水补充)的条件下，分别制备以咪喹莫特+白油、CpG+白油、单一白油为佐剂的3个疫苗对照组。实施例2以GnRH合成肽作为免疫原的疫苗对小鼠进行免疫测试参照实施例1，同时，在抗原剂量不变、体积不变(不足部分用生理盐水补充)的条 件下，分别制备以咪喹莫特+白油、CpG+白油、单一白油为佐剂的三个疫苗对照组。分别用实施例1制得的疫苗与对三个照组疫苗进行分组免疫。免疫方法3_4周龄雄性小鼠(18_20g)随机分成4组，每组10只。免疫剂量为 200iil/只。免疫方法为28日龄时首免，56日龄同剂量再加强免疫一次。采样及处理于免疫后每周采血一次，血样先在37°C放置2小时，然后4°C过夜，次 日3000rpm离心5min，分离血清，置_20°C保存备用。用多肽ELISA方法检测血清抗体水平，具体方法如下以0.05M碳酸盐缓冲液 (pH9. 6)将Th-4GnRH合成肽稀释至终浓度为5. 0 y g/ml，50 u L/孔，4°C包被过夜；用PBST 缓冲液洗3次，每次5min ；加入含牛血清白蛋白(BSA)的PBST，200 y L/孔，37°C封闭 2h ；PBST洗3次，每次5min ；加入PBS稀释100倍的试验小鼠血清，100 y L/孔，37°C作用lh ； PBST洗3次，每次5min ；加入稀释20000倍的羊抗鼠酶标二抗(北京博奥森生物技术有限 公司)，50iiL/孔，37°C作用lh ；PBST洗5次，每次5min ；洗涤后加入新鲜配制的3，3 ‘，5， 5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，lOOiiL/孔，37°C显色15min;加入浓度为2M&H2S04 溶液50PL/孔终止反应，于酶标仪读0D45(i值。每个血清样本做一个重复，取其平均值。上 述 PBST 缓冲液为含 0. 05% (v/v) Tween-20 的 PBS 缓冲液(0. 02mol/L)，pH 为 7. 2。抗体的变化如表1和表2所示，对于每组小鼠而言，表中标示的值是每组小鼠所获 得值的几何平均滴度。结果显示Toll样受体7/8激动剂咪喹莫特、Toll样受体9激动剂 CpG和白油配伍使用，一方面，可以显著加快抗体的产生，比其它3个对照组缩短1周；另一 方面，抗体的高峰水平的几何平均滴度也高于其它3个对照组；本发明复方佐剂的抗体效 价高水平的维持期也较长。以上都表明本发明有助于抗原的体液免疫应答，展现显著的Th2 免疫反应。表1 一免后4周小鼠的抗体水平(OD450) 表2 二免后4周小鼠的抗体水平(OD450) 实施例3以鸡新城疫IV灭活抗原作为免疫原的疫苗的免疫测试用实施例1相同的方法，制备以鸡新城疫IV灭活抗原的疫苗，所不同的是，水相溶 液中的配制的CpG浓度为1. Omg/mL、油相溶液中的咪喹莫特浓度为0. 5mg/mL，抗原采用鸡 新城疫IV灭活抗原(灭活前病毒效价为108 5EID5°/0. lmL)。以鸡新城疫IV灭活抗原为免疫 原，制备佐剂分别为咪喹莫特+CpG+白油、咪喹莫特+白油、CpG+白油、白油的四组疫苗。 用四组疫苗免疫28日龄雏鸡(新城疫母源抗体的效价<2.0 Log 2)，于免疫后2周、3周 和4周采血，分离血清，用血凝抑制(HI)方法(该方法是本领域内公知的常识吗)测定鸡新 城疫IV灭活抗原的抗体的效价；于免疫后5周采血分离淋巴细胞，用干扰素(Y-INF) 和白介素-4(IL-4)的ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定Y-INF和IL-4两 种细胞因子的分泌量。结果由表3和表4显示，以本发明咪喹莫特+CpG+白油复配佐剂制备得到的疫苗 在免疫后2周、3周、4周的抗体滴度最高，显著高于其它组(P< 0.05)；同时该组y-INF和 IL-4的分泌量也最高，显著高于其它3个对照组(P<0.05)。表明本发明佐剂具有显著的 刺激免疫效应细胞的活性，对Thl和Th2免疫活性反应均有较强的增强。表3免疫后各组新城疫抗体效价(Log2)
注同列不含相同字母者差异显著，P < 0. 05 (SPSS 11. 5软件方差分析)。
表'4各组、-INF和IL-4的分泌量(pg/mL)
以上实施例以两种不同免疫原分别与本发明复方免疫佐剂制备疫苗，通过免疫实 验结果表明，本发明以咪喹莫特、CpG和白油配伍的免疫佐剂所获得的协同作用是显著的。本文中如果没有特殊说明，“ ％ ”表示为体积浓度。
权利要求
一种复方免疫佐剂，其特征在于包括分别配制的水相溶液和油相溶液，所说的水相溶液是浓度为0.5～2.0mg/m L的CpG水溶液；所说的油相溶液是浓度为0.25～1.0mg/mL的咪喹莫特白油溶液；水相溶液与油相溶液的体积比为1∶6。
2.根据权利要求1所述的复方免疫佐剂，其特征在于油相溶液含有Span-80，Span-80 在油相溶液中的体积百分含量为6%。
3.根据权利要求2所述的复方免疫佐剂，其特征在于油相溶液含有硬脂酸铝，硬脂酸 铝在油相溶液中的体积百分含量为2%。
4.根据权利要求3所述的复方免疫佐剂，其特征在于水相溶液含有吐温-80，吐温-80 在水相溶液中的体积百分含量为4%。
5.一种含有权利要求1、2、3、4中任意一项所述的复方免疫佐剂的疫苗，包含抗原和所 说的免疫佐剂，其特征在于其中的抗原选自减毒的活的全微生物、灭活微生物、重组肽和蛋 白、合成肽、裂解微生物中的一种或一种以上；抗原与所说的复方免疫佐剂中的水相溶液和 油相溶液的体积比依次为1:1:6。
全文摘要
本发明涉及一种复方免疫佐剂，包括分别配制的水相溶液和油相溶液，水相溶液是浓度为0.5～2.0mg/mL的CpG水溶液；油相溶液是浓度为0.25～1.0mg/mL的咪喹莫特白油溶液；水相溶液与油相溶液的体积比为1∶6。本发明还涉及用选自减毒的活的全微生物、灭活微生物、重组肽和蛋白、合成肽、裂解微生物中的一种或一种以上的抗原与本复方免疫佐剂中的水相溶液和油相溶液按1∶1∶6的体积比制成疫苗。本复方免疫佐剂的通过咪喹莫特、CpG和白油组份的复配，具有显著的协同效应，增强Th1和Th2免疫活性反应，使刺激免疫细胞的活性显著提高。
文档编号A61K39/17GK101850117SQ20101019080
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者侯继波, 卢宇, 张金秋, 邓碧华 申请人:国家兽用生物制品工程技术研究中心