专利名称：蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及降血压肽的制备方法。
背景技术：
降血压肽是血管紧张素转化酶抑制肽，血管紧张素转化酶 (angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制剂是指具有抑制ACE活性的一类多肽物质， 虽然组成这些多肽氨基酸的种类和数量不同，但这类多肽都具有抑制ACE活性、辅助治疗 高血压病的潜在特性功能，是当今应对高血压疾病的有效药物。从天然食品原料，如酪蛋 白、乳清蛋白、鱼蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、鸡蛋蛋白等的蛋白水解 物中分离出的血管紧张素转化酶抑制肽，因为安全、无副作用而广受人们的关注。现有的 从卵白蛋白中分离出血管紧张素转化酶抑制肽的方法有以胃蛋白酶水解分离法和以糜蛋 白酶水解分离法二种，胃蛋白酶水解分离法是Fujita(Fujita H，Sasaki R, Yoshikawa Μ. 1995.Potentiation of the antihypertensive activity of orally administered ovokinin,a vasorelaxing peptide derived from ovalbumin,by emulsification in egg phosphatidylcholine. Biosci Biotechnol Biochem, 59 (12) :2344_2345)等以胃蛋白酶将 卵白蛋白在强酸条件(PH= 1.6)下水解，调至中性后，以乙腈为洗脱剂，采用十八烷基硅 烷键合硅胶填料的液相色谱(ODS)柱梯度洗脱脱盐，再利用反相高效液相色谱(RP-HPLC) 纯化，得到一种对犬肠系膜动脉具有松弛作用的缓激肽B1抑制肽(ovokinin)，其氨基酸序 列为FRADHPFL，该法在强盐条件下水解，水解之后的中和要加入大量的碱，因此产盐量大， 增加了脱盐处理的工作量；以糜蛋白酶水解分离法是Matoba (Matoba N, Usui H, Fujita H. 1999. A novel anti-hypertensive peptide derived from ovalbumin induces nitric oxide-mediated vasorelaxation in an isolated SHR mesenteric artery. Fed Eur Biochem Soc Lett, 452 (3) 181-184)等以卵白蛋白为底物，利用糜蛋白酶在pH值为7. 8、 温度为37°C的条件下水解12h后，沸水浴终止反应，离心后水解物经以十八烷基硅烷键 合硅胶(ODS)为填料的反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱及苯乙基硅酸柱分离得到的肽段 RADHPF，该方法处理周期长达16 20小时，反应终止温度高。
发明内容
本发明是为了解决现有的从卵白蛋白中分离出血管紧张素转化酶抑制肽的胃蛋 白酶水解分离法制备过程中脱盐处理的工作量大、洗脱剂乙腈有毒及糜蛋白酶水解分离法 处理周期长、反应终止温度高的问题，而提供蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法。本发明的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法按以下步骤进行一、蛋白质水解 按蛋清与蛋白酶的质量比为100 1 3称取蛋清和蛋白酶，将蛋清配制成浓度为3% 10% (质量)的蛋白水溶液并置于反应器中，升温至30°C 50°C，并调节蛋白水溶液的pH 值至5 8，然后加入蛋白酶，在温度为30°C 50°C的条件下，搅拌2h 5h，得到蛋白水解 液；二、脱盐处理将经步骤一得到的蛋白水解液以每小时7倍 9倍柱体积的流速，先通过强酸性阳离子交换树脂柱，然后再通过强碱性阴离子交换树脂柱，收集流出液；三、分级 纯化处理将经步骤二得到的流出液在温度为20°C 35°C、压力为0. 5bar 1. 5bar条件 下通过3kD IOkD的超滤膜，得到滤出液，最后再将滤出液经过凝胶过滤预装柱Superdex Peptide 10/300GL，收集流出液，得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。本发明的方法，在温度为30°C 50°C、pH值为5 8的条件下水解反应，得到蛋白 水解物，然后再经脱盐和和纯化得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。采用S印hadex 7510/30GL 凝胶色谱柱测得经步骤一水解后得到的蛋白水解物的分子量分布在2040Da 107150Da ； 采用Superdex Peptide 10-300GL凝胶色谱柱测出蛋清蛋白源辅助降血压肽的分子量主要 分布在200Da 2282Da。本发明的蛋清蛋白源辅助降血压肽对血管紧张素转化酶的抑制率 为88% 92%，具有羟自由基、具有清除超氧阴离子的能力和抑制脂质过氧化的能力，只 对高血压患者起作用而对正常人无副作用，且易吸收，可以直接添加到食品中并兼具营养 与降血压功效；在0°C 7°C和50°C 90°C的温度下稳定性良好，在碱性条件下的稳定性优 于酸性环境；具备较好的溶解性、乳化性及乳化稳定性和起泡性及气泡稳定性。本发明的方法制备的蛋清蛋白源辅助降血压肽在温度范围为30°C 50°C、pH值 为5 8的条件下水解，再经脱盐和纯化后制得，整个的制备过程仅需7 10小时，制备的 周期短，同时，在30°C 50°C的温度下水解，最大限度地保护了蛋清蛋白水解物中苏氨酸、 谷氨酸和亮氨酸不被破坏，蛋清蛋白源辅助降血压肽中甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯 丙氨酸和组氨酸的含量高达44. 7% 48. 5%，疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的含量较水 解物中有所提升，使蛋清蛋白源辅助降血压肽兼具良好的功能特性和抗氧化性，而且水解 时的PH值为5 8，作用条件接近中性，后续处理工艺的产盐量低，因而脱除盐工作量小。本方法制备温度低，周期短，制备过程中不使用任何对人体有毒害的物质，是一种 绿色方法，而且方法简单，易操作。
图1是具体实施方式
十八的源辅助降血压肽的分子量分布标准曲线图；图2是具 体实施方式十八制备的蛋清蛋白源辅助降血压肽的凝胶层析色谱图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法按以下步骤 进行一、蛋白质水解按蛋清与蛋白酶的质量比为100 1 3称取蛋清和蛋白酶，将蛋清 配制成浓度为3% 10% (质量)的蛋白水溶液并置于反应器中，升温至30°C 50°C，并 调节蛋白水溶液的PH值至5 8，然后加入蛋白酶，在温度为30°C 50°C的条件下，搅拌 2h 5h，得到蛋白水解液；二、脱盐处理将经步骤一得到的蛋白水解液以每小时7倍 9 倍柱体积的流速，先通过强酸性阳离子交换树脂柱，然后再通过强碱性阴离子交换树脂柱， 收集流出液；三、分级纯化处理将经步骤二得到的流出液在温度为20°C 35°C、压力为 0. 5bar 1. 5bar条件下通过3kD IOkD的超滤膜，得到滤出液，最后再将滤出液经过凝胶 过滤预装柱Superdex Peptide 10/300GL，收集流出液，得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。本实施方式的方法，在温度为30°C 50°C、pH值为5 8的条件下水解反应， 得到蛋白水解物，然后再经脱盐和和纯化得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。采用S印hadex7510/30GL凝胶色谱柱测得经步骤一水解后得到的蛋白水解物的分子量分布在2040Da 107150Da;采用Superdex Peptide 10-300GL凝胶色谱柱测出蛋清蛋白源辅助降血压肽的 分子量主要分布在200Da 2282Da。本实施方式的蛋清蛋白源辅助降血压肽对血管紧张素 转化酶的抑制率为88% 92%，具有羟自由基、具有清除超氧阴离子的能力和抑制脂质过 氧化的能力，只对高血压患者起作用而对正常人无副作用，可以直接添加到食品中并兼具 营养与降血压功效；在0°C 7°C和50°C 90°C的温度下稳定性良好，在碱性条件下的稳定 性优于酸性环境；具备较好的溶解性、乳化性及乳化稳定性和起泡性及气泡稳定性。本实施 方式的方法制备的蛋清蛋白源辅助降血压肽在温度范围为30°C 50°C、pH值为5 8的 条件下水解，再经脱盐和纯化后制得，整个的制备过程仅需7 10小时，制备的周期短，同 时，在30°C 50°C的温度下水解，最大限度地保护了蛋清蛋白水解物中苏氨酸、谷氨酸和 亮氨酸不被破坏，蛋清蛋白源辅助降血压肽中甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和 组氨酸的含量高达44. 7% 48. 5%，疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的含量较水解物中有 所提升，使蛋清蛋白源辅助降血压肽兼具良好的功能特性和抗氧化性，而且水解时的PH值 为5 8，作用条件接近中性，后续处理工艺的产盐量低，因而脱除盐工作量小。本方法制备 温度低，周期短，制备过程中不使用任何对人体有毒害的物质，是一种绿色方法，而且方法 简单，易操作。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述的蛋 白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶 (Alcalase)和霉菌蛋白酶中的一种或其中几种的组合。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式中蛋白酶为组合物时，各种蛋白酶以任意比组合。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中蛋清与 蛋白酶的质量比为100 1.2 2. 8。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中蛋 清与蛋白酶的质量比为100 2。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤一中蛋 白水溶液的浓度为4% 9% (质量)。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中蛋 白水溶液的浓度为6% (质量)。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤一中调 节蛋白水溶液的PH值至5. 5 7. 5。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤一中调 节蛋白溶液的PH值至6. 5。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤一中蛋 白水溶液在温度为32°C 46°C的条件下，搅拌2. 5h 4. 5h。其它与具体实施方式
一至八 之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤一中蛋 白水溶液在温度为40°C的条件下，搅拌3. 5h。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至十之一不同的是步骤二中 所述的强酸性阳离子交换树脂是指其交换基团为磺酸基(-SO3H)的阳离子交换树脂。其它与具体实施方式
一至十之一相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至十一之一不同的是步骤二 中所述的强碱性阴离子交换树脂是指其交换基团为季胺基的阴离子交换树脂。其它与具体 实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二 中蛋白水解液的流速为每小时7. 3倍 9. 8倍柱体积。其它与具体实施方式
一至十二之一 相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一至十三之一不同的是步骤二 中蛋白水解液的流速为每小时8倍柱体积。其它与具体实施方式
一至十三之一相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
一至十四之一不同的是步骤三 中流出液在温度为22°C 33°C、压力为0. 7bar 1. 3bar的条件下通过5kD的超滤膜。其 它与具体实施方式
一至十四之一相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一至十五之一不同的是步骤三 中流出液在温度为30°C、压力为1. Obar的条件下通过6kD的超滤膜。其它与
具体实施例方式
一至十五之一相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
一至十六之一不同的是步骤三 中所述的超滤膜的为Ultracel-PL再生纤维素超滤膜、聚砜超滤膜、聚丙烯腈超滤膜。其它 与具体实施方式
一至十六之一相同。
具体实施方式
十八本实施方式的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法按以下步 骤进行一、蛋白质水解按蛋清与胰蛋白酶的质量比为100 2称取蛋清和胰蛋白酶，将 蛋清配制成浓度为8% (质量)的蛋白水溶液并置于反应器中，升温至35°C，并调节蛋白 水溶液的PH值至6. 5，然后加入胰蛋白酶，在温度为35°C的条件下，搅拌5h，得到蛋白水解 液；二、脱盐处理将经步骤一得到的蛋白水解液以每小时8倍柱体积的流速，先通过强酸 性阳离子交换树脂柱，然后再通过强碱性阴离子交换树脂柱，收集流出液；三、分级纯化处 理将经步骤二得到的流出液在温度为30°C、压力为1. Obar条件下通过3kD的超滤膜，得 到滤出液，最后再将滤出液经过凝胶过滤预装柱Superdex Peptidel0-300GL处理，收集流 出液，得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。本实施方式所述的强酸性阳离子交换树脂的交换基团为磺酸基(-SO3H)。本实施方式所述的强碱性阴离子交换树脂的交换基团为季胺基。本实施方式所述的超滤膜的Ultracel-PL再生纤维素超滤膜。本实施方式经步骤一水解后采用S印hadex 7510/30GL凝胶色谱柱对蛋白水解物 的分子量分布进行测定，其中测定水解物分子量所用的标准品为2.5mg/mL卵白蛋白(Mr =44287Da)、5mg/mL 溶菌酶(Mr = 14400Da)、0· lmg/mL 维生素 B12 (Mr = 1355Da)和 0. lmg/ mL还原型谷胱甘肽(Mr = 307. 33Da)，用0. 05mol/L的pH值为7. 0的磷酸盐缓冲溶液冲洗 至基线平稳后，将被测样品和标准品进样，上样量2mL、流速为0. 5mL/min,在254nm波长处 检测。以各标准品洗脱体积为横坐标，标准品分子量对数值为纵坐标绘制标准曲线，其中标 准品分子量的单位为Da。根据标准曲线及样品的洗脱体积计算出蛋清蛋白水解物的分子量 主要分布在2040Da 107150Da范围内；本实施方式制备的蛋清蛋白源辅助降血压肽采用Superdex P印tidel0-300GL凝胶色谱柱对蛋清蛋白源辅助降血压肽的分子量分布进行测定，所用的标准品为lmg/mL溶 菌酶(Mr = 14400Da)、0· lmg/mL 维生素 B12 (Mr = 1355Da)、0· 2mg/mL 氧化型谷胱甘肽(Mr =612. 66)和 0. lmg/mL 还原型谷胱甘肽(Mr = 307. 33Da)。用 0. 05mol/L pH 值为 7. 0 的 磷酸盐缓冲溶液冲洗至基线平稳后，分别将标准品和本实施方式的蛋清蛋白源辅助降血压 肽进样，上样量2mL、流速为0. 5mL/min，在254nm波长处检测。以各标准品洗脱体积为横坐 标，标准品分子量对数值为纵坐标绘制标准曲线，得到蛋清蛋白源辅助降血压肽的分子量 分布标准曲线如图1所示，从图1可以看出洗脱体积与分子量对数值呈直线关系。本实施 方式的蛋清蛋白源辅助降血压肽的凝胶层析色谱图如图2所示，从图2可以看出，图中有 四个较强的色谱峰，其洗脱体积分别对应着17mL、18. 8mL、20mL和25. 2mL，而洗脱体积大于 20mL的组分的分子量比较小，主要分布在200Da以下，这部分小分子量组分是游离的氨基 酸和蛋清中原有的碳水化合物等物质。从图1中的标准曲线及样品的洗脱体积可以计算出 蛋清蛋白源辅助降血压肽的分子量主要分布在200Da 2282Da。本实施方式中Mr表示分子量。本实施方式的蛋清蛋白源辅助降血压肽对血管紧张素转化酶的抑制率为 89. 06%，具有羟自由基、具有清除超氧阴离子的能力和抑制脂质过氧化的能力，只对高血 压患者起作用而对正常人无副作用，可以直接添加到食品中并兼具营养与降血压功效；在 0°C 7°C和50°C 90°C的温度下稳定性良好，在碱性条件下的稳定性优于酸性环境；具备 较好的溶解性、乳化性及乳化稳定性和起泡性及气泡稳定性。本实施方式的方法制备的蛋 清蛋白源辅助降血压肽在温度范围为35°C的条件下，经7 10小时制得，在此温度下水解， 最大限度地保护了蛋清蛋白水解物中苏氨酸、谷氨酸和亮氨酸不被破坏，蛋清蛋白源辅助 降血压肽中甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和组氨酸的含量高达45.2%，疏水性 氨基酸和芳香族氨基酸的含量较水解物中有所提升，使蛋清蛋白源辅助降血压肽兼具良好 的功能特性和抗氧化性。本方法制备温度低，周期短，制备过程中不使用任何对人体有毒害 的物质，是一种绿色方法，而且方法简单，易操作。
权利要求
蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法按以下步骤进行一、蛋白质水解按蛋清与蛋白酶的质量比为100∶1～3分别称取蛋清和蛋白酶，先将蛋清配制成浓度为3％～10％(质量)的蛋白水溶液并置于反应器中，升温至30℃～50℃，并调节蛋白水溶液的pH值至5～8，然后加入蛋白酶，在温度为30℃～50℃的条件下，搅拌2h～5h，得到蛋白水解液；二、脱盐处理将经步骤一得到的蛋白水解液以每小时7倍～9倍柱体积的流速，先通过强酸性阳离子交换树脂柱，然后再通过强碱性阴离子交换树脂柱，收集流出液；三、分级纯化处理将经步骤二得到的流出液在温度为20℃～35℃、压力为0.5bar～1.5bar条件下通过3kD～10kD的超滤膜，得到滤出液，最后再将滤出液经过凝胶过滤预装柱Superdex Peptide 10/300GL，收集流出液，得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。
2.根据权利要求1所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于步骤一中 所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性丝氨酸蛋 白酶和霉菌蛋白酶中的一种或其中几种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于步骤 一中蛋清与蛋白酶的质量比为100 1.2 2. 8。
4.根据权利要求3所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于步骤一中 蛋白水溶液的浓度为4% 9% (质量)。
5.根据权利要求1、2或4所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于步 骤一中调节蛋白水溶液的pH值至5. 5 7. 5。
6.根据权利要求5所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于步骤一中 蛋白水溶液在温度为32°C 46°C的条件下，搅拌2. 5h 4. 5h。
7.根据权利要求1、2、4或6所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于 步骤二中蛋白水解液的流速为每小时7. 3倍 9. 8倍柱体积。
8.根据权利要求7所述的蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，其特征在于步骤三中 流出液在温度为22°C 33°C、压力为0. 7bar 1. 3bar的条件下通过5kD的超滤膜。
全文摘要
蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法，它涉及降血压肽的制备方法，本发明解决了现有的胃蛋白酶水解分离法制备过程中脱盐处理的工作量大、洗脱剂乙腈有毒及糜蛋白酶水解分离法处理周期长、反应终止温度高的问题。本方法将蛋清和蛋白酶在pH值为5～8、温度为30℃～50℃的条件下搅拌水解，然后将水解液依次经强酸性阳离子交换树脂柱和强碱性阴离子交换树脂柱脱盐，流出液经超滤膜过滤后经凝胶过滤预装柱Superdex Peptide 10-300GL纯化得到蛋清蛋白源辅助降血压肽。降血压肽的分子量分布在200Da～2282Da，兼具营养与降血压功效，制备条件温和，简单，脱盐的工作量小，可作为高血压患者的保健食品。
文档编号A61K38/17GK101906455SQ20101023310
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者夏宁, 张华江, 王喜波, 迟玉杰 申请人:东北农业大学