一种保护噬菌体活性的给药方法及其应用的制作方法

专利名称：一种保护噬菌体活性的给药方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种保护噬菌体活性的给药方法及其应用。
背景技术：
噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒，对宿主菌具有高度的专一性。根据其侵染宿主菌后的状态和结果，噬菌体分为两种类型，其中一种能在宿主菌细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌，称为烈性或毒性噬菌体。毒性噬菌体侵染细菌后，能在细菌中增殖并杀死细菌，而对动植物没有毒性。因此，毒性噬菌体以其特有的自然特征，被期待成为较好的抗菌药。早在上世纪30年代，就有噬菌体治疗霍乱成功的报告，至今有文献报道的噬菌体人体治疗的临床病例已累计达数千例。虽然许多早期噬菌体治疗的研究似乎都适于临床应用，但噬菌体并没有广泛地用于临床预防或治疗细菌感染，究其原因主要是噬菌体抗菌谱狭窄，抗菌针对性太强，以及噬菌体的抗菌活性容易被机体的抵抗力削弱，导致噬菌体的临床应用受到限制。但是，有关噬菌体预防和治疗细菌感染的研究历久弥新，以噬菌体防治动物和人的细菌感染屡见报道。涉及的病原体主要有假单胞菌、葡萄球菌、克雷伯菌、大肠埃希菌、变形杆菌、沙门菌、志贺菌、链球菌、肠球菌、艰难梭杆菌、分枝杆菌、幽门螺杆菌等； 有关的感染性疾病包括皮肤粘膜感染、肠道感染、败血症、脑膜炎、关节炎、膈下脓肿、肺部感染等；使用的方法有局部用药、口服、滴入、注射等单用噬菌体治疗，或者将纯化的噬菌体与制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂等赋形剂复配使用(张辉，王冉，魏瑞成，陈明.一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株及其应用.专利申请号=200910029306. 9 ；公开号CN101519651A)；也有人采用噬菌体宿主菌破碎制成的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为分枝杆菌噬菌体的保护剂，保存效果理想，且有利于分枝杆菌噬菌体对结核病的治疗(王国治，彭丽，陈保文，等.一种分枝杆菌噬菌体菌的保存方法.专利申请号200710097800. X;公开号CN101302498A)。但尚未见利用噬菌体宿主菌活细胞保护噬菌体的给药方法。目前，随着微生物耐药性的日趋严峻，耐药菌及其耐药谱的快速递增，多重耐药菌及超级耐药菌成为现代医学中的一个棘手问题，寻找新的有效且无毒副作用的抗菌制剂成为治疗微生物感染性疾病迫切需要解决的问题。由于毒性噬菌体具有独特的特异性递增放大裂菌效能，噬菌体疗法又引起新的关注，噬菌体可能会成为抵御难治性病菌感染的一个有力武器。寻找新的野生型宽噬噬菌体，以及利用分子生物学技术拓宽噬菌体的噬菌谱， 成为噬菌体疗法研究的热点；帮助噬菌体突破机体免疫屏障发挥溶菌效能，则是噬菌体临床应用的关键。裸露的噬菌体很容易被胃液等机体抗性因子灭活，而被宿主菌保护的噬菌体，因为噬菌体已经侵入宿主菌，必需首先破坏细菌，方能进一步破坏噬菌体。因此，受宿主菌保护的噬菌体比单纯噬菌体抵抗力更强。只有有效的保持噬菌体的抗菌活性，减少机体抵抗力对噬菌体抗菌效力的削减，才能使噬菌体真正走向临床应用。本发明涉及的一种保护噬菌体活性的给药方法，就是帮助噬菌体突破机体免疫屏障的一种特异的噬菌体保护方法，随着噬菌体疗法从实验室研究走向临床应用，本发明具有十分重要的实际意义和广阔的应用前景。

发明内容
本发明的目的是提供一种保护噬菌体活性的给药方法，适用于采用噬菌体预防和治疗机体内各种原核和真核细胞型微生物所致的感染性疾病。本发明的目的是通过如下方案予以实现的该方法首先使毒性噬菌体预感染相应的宿主菌，然后根据细菌的感染部位，采用相对应的给药途径，比如口服、含漱、栓塞、注射、 喷雾、涂抹等，使带有活性噬菌体的宿主菌进入体内，噬菌体在宿主菌的保护下突破机体抵抗力，释放子代噬菌体，侵染并裂解相应细菌，达到治疗细菌感染的目的。本发明的方法具体操作步骤如下(1)感染菌的分离和纯培养；(2)感染菌的噬菌体分离和纯化；(3)噬菌体应用液的配制和模拟体内抗菌效果检测。上述步骤(1)中，感染菌包括导致人和动物不同部位感染的各种细菌、支原体、螺旋体、真菌等细胞型微生物。分离和纯培养所使用的培养基、培养方法、培养时间，分别对应于感染菌的分离培养所需。上述步骤(2)中，感染菌的噬菌体分离和纯化，详见“具体实施方式
”。上述步骤(3)中，噬菌体应用液的配制要求噬菌体过量，即所有的宿主菌内均含有噬菌体。配制的噬菌体药用液经过模拟体内抗菌效果检测的体外验证实验，应该同时具备“体外培养检测无相应细菌生长、模拟消化液等抗性处理噬菌斑依然阳性、未保护的对照噬菌体模拟抗性处理后噬菌斑消失”等特征。该发明利用噬菌体进入宿主菌后，对外界的抵抗力增强的特征，以噬菌体的宿主菌帮助噬菌体突破机体的免疫屏障，避免了噬菌体易受理化因素破坏失活的弱点。使噬菌体在宿主菌中保持活性、并释放子代噬菌体、特异性裂解更多的细菌，达到治疗相应细菌引起的感染性疾病。


图1噬菌体单层平板验证实验
噬菌体单层平板检测是噬菌体定性检测，结果有噬菌斑，说明有对应的噬菌体存在； 图2噬菌体双层平板检测
噬菌体双层平板检测是噬菌体定量检测，每单个噬菌斑都是1个噬菌体增殖的结
果；
图3噬菌体应用液双层平板抗菌试验(左实验组；右对照组) 噬菌体应用液双层平板抗菌试验，即噬菌体模拟治疗体外验证实验，实验组是模拟消化液等抗性处理后，其噬菌斑依然阳性；对照组为未保护的噬菌体经模拟抗性处理后噬菌斑消失。
具体实施例方式实施例1、噬菌体的分离(1)制备目的菌悬液取感染部位的标本分离并纯培养为目的菌斜面一支，加无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。所用培养基和培养方法，均以培养出目的菌为准(下同)。(2)样本中噬菌体的增殖培养于三倍浓缩的液体培养基中，1 2加入过滤除菌的污水样品，并接种目的菌悬液，使样本中的噬菌体与目的菌一起培养。具体培养时间根据不同的细菌确定，如大肠杆菌等一股细菌培养12_24h ；幽门螺杆菌培养5-7d (下同)。(3)制备噬菌体裂解液将以上混合培养液2500r/min离心15min后，将离心上清液过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角烧瓶内，37°C培养过夜，以作无菌检查。(4)确证噬菌体存在经无菌检查无细菌生长的滤液作确证试验，进一步证实噬菌体的存在。将目的菌液涂布接种至固体培养基平板上，待平板菌液干后，分散滴加3小滴滤液于平板菌层上面，37°C培养一定时间。若在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有目的菌的噬菌体存在(图1)。实施例2、噬菌体的纯化(1)明确有噬菌体存在后，做噬菌体双层平板定量纯化试验。第一管用接种环取滤液2环加入0. 2ml悬液，第二管滤液5环加入0. 2ml菌悬液，第三管滤液10环加入0. 2ml菌悬液，第四管单用0. 2ml滤液做滤液对照，第五管单用0. 2ml菌悬液做菌对照。各管混勻，37°C静止15-30min。(2)取上层0. 8%琼脂培养基，溶化并冷却至48°C，分别加4ml于以上噬菌体与细菌的混合液0. 2ml中，立即混勻。(3)并立即倒入底层培养基上，铺勻。置37°C培养一定时间。(4)此时长出的单个噬菌斑，其形态、大小和数量常不一致，在数量少、单个噬菌斑清晰的平板中(图2)，挑选形态圆整、直径大的噬菌斑，用接种针在单个噬菌斑中刺一下， 小心采取噬菌体，接入含有宿主菌的液体培养基内，37°C培养。(5)待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。以上⑴⑵(3)三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，若平板上的噬菌斑连成一片，则需减少滤液接种量或增加宿主菌的量；若噬菌斑太少，则增加滤液接种量。实施例3、高效价噬菌体的制备刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按1 10的比例混合，再加入宿主菌悬液适量(可与噬菌体滤液等量或1/2的量)，培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。实施例4、噬菌体与宿主菌混合液(噬菌体应用液)的配制取实施例3制备的高效价噬菌体制品，重复实施例2(1) (2) (3)三步骤，目的是得到在平板上噬菌斑连成一片(无细菌生长)的最小滤液接种量，按大于/等于此时滤液与宿主菌液的混合比例配制噬菌体与宿主菌混合液，即噬菌体应用液，应用液配成之后，4-8°C保存，1-2天内使用，或者_25°C 保存，1年内使用。实施例5、噬菌体应用液的检测噬菌体应用液配制完成后和使用之前均应做双层平板抗菌试验检测。噬菌体应用液及纯化噬菌体液对模拟消化液的抗性检测参照孟祥晨等试验方法 (孟祥晨，霍贵成.双歧杆菌抗消化道逆环境特性的研究.食品与发酵工业，2003，29 (10) 6-10.)。以噬菌体应用液(噬菌体预感染宿主菌)为实验组、纯化噬菌体(滤液)为对照组，37°C处理1.5h。采用实施例2(1) (2) (3)中的双层平板试验，检测实验组和对照组中噬菌体的溶菌效果。结果实验组噬菌斑依然阳性，对照组噬菌斑消失，说明噬菌体可以在宿主菌的保护下，通过机体抵抗力，发挥溶菌作用(图3)。
权利要求
1.一种保护噬菌体活性的给药方法，其特征在于该方法是采用噬菌体的宿主菌来保护相对应的毒性噬菌体。
2.根据权力要求1所述的噬菌体保护方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)分离纯化机体某部位细胞型感染性微生物的毒性噬菌体；(2)以双层琼脂平板法确定噬菌体的滴度，即噬菌体的空斑形成单位(pfu)；(3)以“噬菌体宿主菌>1”的滴度使噬菌体预感染宿主菌，配制成受宿主菌保护的噬菌体药用液体，即噬菌体的感染复度MOI (multiplicity of infection)值远大于等于1时 (即噬菌体过量)；(4)所配制的噬菌体药用液经过体外验证实验，应该同时具备“体外培养检测无相应细菌生长、模拟消化液等抗性处理噬菌斑依然阳性、未保护的对照噬菌体模拟抗性处理后噬菌斑消失”等特征。
3.根据权力要求2所述噬菌体保护方法，其特征在于步骤(1)中所述机体为人和猪、 牛、鸡、鸭、鹅、羊、马、狗等动物。
4.根据权力要求2所述噬菌体保护方法，其特征在于步骤(1)中所述机体某部位为人和动物的口腔、胃、肠道、泌尿生殖道、呼吸道、眼结膜等机体的粘膜表面和腹膜腔、胸腔、血管腔、硬膜下腔、蛛网膜下腔等无菌的腔道，以及其它组织器官。
5.根据权力要求2所述噬菌体保护方法，其特征在于步骤(1)中所述细胞型感染性微生物为细菌、支原体、衣原体、螺旋体、真菌等细胞型微生物中的具体种和型。
6.根据权力要求2所述噬菌体保护方法，其特征在于步骤(1)中所述毒性噬菌体为用于治疗微生物感染的野生型毒性噬菌体和基因工程改造的具有裂菌作用的噬菌体。
全文摘要
本发明公开一种保护噬菌体活性的给药方法及其应用，该方法以噬菌体的宿主菌保护噬菌体，从而增强了噬菌体的抵抗力，目的是帮助噬菌体突破机体免疫屏障，使噬菌体在宿主菌的保护下完成初次增殖，并释放众多的子代噬菌体，进而特异性侵染并裂解感染菌。本发明的方法可用于机体内所有部位和脏器的原核和真核细胞型微生物所致感染的噬菌体疗法。本发明减少了机体抵抗力对噬菌体疗法的干扰，扩增和放大了噬菌体的治疗剂量和治疗效果，为临床实施噬菌体治疗微生物感染性疾病，提供了一种实用有效的给药新方法。
文档编号A61P31/04GK102370669SQ201010253208
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月14日 优先权日2010年8月14日
发明者万学勤, 唐冬生, 崔志新, 李宏鸣 申请人:万学勤