专利名称：IL-1Ra的新用途及其肿瘤治疗药物组合药盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及IL-IRa的新用途及其肿瘤治疗药物组
合药盒。
背景技术：
近年来，随着医学的进步，现代人类的平均寿命增长至80岁，肿瘤的发病率明显增高。肿瘤与心脑血管病成为人类健康的两大杀手，肿瘤的高发病率和高致死率成为威胁人类健康的重要因素。随着对肿瘤发病机制的研究，人们对肿瘤有了进一步的认识。研究表明，肿瘤细胞为生长失控的异常细胞，会由肿瘤原发部位迁移至其它部位，如果不能够控制肿瘤的这种扩散作用，肿瘤将侵犯人体的重要器官，引起器官衰竭，最终导致死亡。目前临床上治疗肿瘤的常用方法有外科手术切除肿瘤、放射治疗、化学治疗和中医治疗等。鉴于肿瘤是一种全身性的疾病，单纯依靠切除肿瘤的治疗效果往往不够理想。据有关资料表明，肿瘤病人确诊时，仅有三分之一左右的病人适宜通过手术而治愈。绝大多数病人确诊时已处于癌症中晚期，需要辅以放射治疗和(或)化学药物治疗，因此放化疗是当前恶性肿瘤治疗和预防复发的重要手段。但是放化疗“敌我不分”，对细胞缺乏选择性，在杀死肿瘤细胞的同时，同样杀伤正常细胞，因而放化疗虽然是肿瘤治疗的重要方法，但仍具有严重的毒副作用[4]。放射治疗和(或)化学药物治疗的主要副作用是免疫功能抑制和骨髓造血抑制，大部分化疗药物，如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷(5-azacytidine or5-azacitidine,5-Aza)等化疗药物会引起胸腺免疫器官的急性损伤以及外周免疫功能的下降，这直接限制了化疗的应用，并且化疗后病人处于免疫功能缺失的状态下，导致感染几率增加。若病人在化疗后无法恢复正常水平的免疫功能，那么病人罹患各种免疫性疾病、 病毒与细菌的感染、以及癌症复发的几率会大大增加。胸腺为机体的重要免疫器官，是T细胞发育的场所。胸腺T祖细胞来源于骨髓， 其表面标志为⑶3TD4TD8_(triple negative, TN)，具有分化为T细胞、树突状细胞或自然杀伤细胞的能力，它在胸腺中经历了从皮质到髓质的复杂分化过程。TN细胞在胸腺中与微环境复杂的细胞组分相作用，获取⑶3分子，成为⑶4TD8_双阴性(double-negative, DN)细胞。TN细胞与DN细胞都属于早期的pre-T细胞。随后，DN细胞在依次经过DN I(CD44+CD25)、DN II (CD44+CD25+)、DN III (CD44XD25+)、DN IV(CD44XD25-)四个阶段发育为CD4、CD8双阳性细胞(CD4+CD8+double-positive，DP)。皮质中的DP细胞经过T细胞受体(T-cell antigen receptor)基因重排，完成阳性选择(positive selection, PS)和阴性选择(negative selection, NS)，发育为 CD4 单阳性或 CD8 单阳性(single-positive， SP)naive T细胞，被输送到外周，作为辅助T细胞或杀伤性T细胞发挥免疫功能。“白细胞介素-1 受体拮抗剂”(interleukin-1 receptor antagonist，IL-lRa)，与 IL-Ia ,IL-I β三者共同属于IL-I家族成员。IL-IRa是IL_1 a、IL-1 β共同的拮抗剂，它可竞争性的抑制IL-I与其受体IL-IRI结合，阻滞在多个组织和器官中表达IL-I的生物活性。IL-IRa临床上用于类风湿性关节炎、败血症等疾病。人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的IL-IRa分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实，糖基化对IL-IRa生物学活性无影响(R Daig,G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut2000(46) :350-358)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决肿瘤放射治疗和/或化学治疗过程中免疫功能抑制副作用问题。为此，本发明公开了一种如下(a)或(b)的蛋白在制备用于治疗或保护放疗和 (或)化疗药物导致的胸腺急性损伤、胸腺淋巴细胞损伤和(或)外周T淋巴细胞减少的药物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列70%同源性且具有放疗和(或)化疗药物导致的胸腺急性损伤、胸腺淋巴细胞损伤和(或)外周T淋巴细胞减少活性的蛋白。在一些实施例中，所述胸腺淋巴细胞为胸腺T细胞，胸腺T细胞可为DN T细胞、 DP T细胞、⑶4 SP T细胞或⑶8 SP T细胞。所述外周T淋巴细胞为⑶4+CD45RA+T细胞和 CD8+CD45RA+T 细胞。在一实施例中，所述(b)的蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述的蛋白。在一些实施方式中，所述化疗药物可选自烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、植物类药物、激素类药物、金属络合物、或蛋白药物，其中优选为抗代谢类药物。另一方面，本发明公开了一种药物组合物，其含有作为活性成分的上述蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述药物组合物的制剂为肠外给药制剂，所述肠外给药制剂可为注射剂或注射用无菌粉末。另一方面，本发明公开了一种肿瘤治疗药物组合药盒，其包括肿瘤化疗药物制剂和本发明所述药物组合物的制剂。另一方面，本发明公开了上述蛋白作为活性成分可治疗或预防放疗或/和化疗药物导致的胸腺急性损伤和/或免疫功能抑制副作用的方法，该方法包括给予个体有效剂量的上述蛋白。另一方面，本发明还公开了一种治疗肿瘤的方法，该方法包括在放疗或/和化疗药物前，给予个体有效剂量的上述蛋白。本发明所述蛋白的新用途可有效地降低治疗或预防放疗或/和化疗药物导致的胸腺急性损伤和/或免疫功能抑制副作用，将可能为今后临床肿瘤的治疗提供新的选择。
图1 胸腺中T细胞的发育过程示意图；图2 重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptorantagonist, rHuIL-lRa)对5_Aza化疗导致的胸腺损伤的保护作用；图3 :5-Aza化疗后不同时间小鼠胸腺的H&E染色图(低倍镜)；
图4 :5-Aza化疗后第7天小鼠胸腺切片H&E染色图(高倍镜)；图5 :rHuIL-lRa对5_Aza化疗导致的胸腺指数损伤的保护作用；图6 :rHuIL-lRa对5_Aza化疗导致的胸腺细胞总数损伤的保护作用；图7 胸腺细胞增殖的检测；
具体实施例方式在本文，术语所述“白细胞介素-1受体拮抗剂”(interleukin-1 receptor antagonist，IL-IRa)，与 IL-Ia、IL-I β 三者共同属于 IL-1 家族成员。IL-IRa 是 IL-1 a、 IL-I β共同的拮抗剂，能拮抗IL-I与其受体interleukin-1 receptor I(IL-IRI)的结合， 并抑制IL-I的生物学活性。人成熟形式的IL-IRa(hIL-IRa)的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1 所述，人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物学作用没有种属特异性。不同细胞产生的IL-IRa分子量的差异主要由糖基化程度不同所致。已证实，糖基化对IL-IRa生物学活性无影响(R Daig, G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut 2000 (46) :350-358)。本发明的所述蛋白质优选该物质是hIL-IRa蛋白质及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ ID NO. 1描述的氨基酸序列的蛋白质的载体例如DNA载体(质粒或病毒)。功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、 修饰、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。术语“类似物”也包括嵌合蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体、上述化合物的前体和其它功能等效物或模拟物。也包括模拟IL-IRa结合蛋白活性的合成体。术语“突变体”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述hIL_lRa的突变体。相比于天然的IL-IRa蛋白，该突变体与它们野生型相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、 或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)确定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^ 的·歹lHii 至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。本发明涉及的方面还包括IL-IRa蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明IL-IRA蛋白的稳定性和/或生物活性。药物组合物用于本发明或者含有本发明所述蛋白的药物组合物。通常，当本发明药物组合物用于上述用途时，所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。本发明的蛋白可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。上述剂型中可经口服给药的剂型为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、 等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是冻干粉针剂。本发明的药物组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。药物组合物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体，并适宜为单位剂量形式。本发明的药物组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质，该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本发明物的活性形式。本发明公开了一种肿瘤治疗药物组合药盒，其包括肿瘤化疗药物制剂和本发明所述药物组合物的制剂。用途公开了所述蛋白作为活性成分可以治疗或预防放疗或/和化疗药物导致的胸腺急性损伤和/或免疫功能抑制副作用的方法，该方法包括给予患者有效剂量的上述(a)或 (b)所述的蛋白。在一些实施方式中，所述方法可通过化疗药物给药前给药方式、放疗给药方式，给予患者有效剂量的上述(a)或(b)所述的蛋白。“有效剂量”或“治疗量”均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量约为0. Ol-IOOOmgo通常，成人临床给药量的范围为0. 01-200mg/日，优选为0. 05-100mg/日。
在一些实施方式中，所述化疗药物可选自烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、植物类药物、激素类药物、金属络合物、或蛋白药物，其中优选为抗代谢类药物。抗代谢类药物选自脱氧氟尿苷、5-脱氧氟尿苷、氟脲苷、丙硫氧嘧啶、丁基氟尿嘧啶、双喃氟啶、 5-氟嘧啶醇、磺巯嘌呤钠、巯咪嘌呤、6-巯基嘌呤、6-氨基嘌呤盐酸盐、甘氨硫嘌呤、硫乌嘌呤、溶癌呤、硫酸胼、卫康醇、亚丝醌、芬可洛宁、异优散酮、抑素、氯屈磷酸、氯屈磷酸二钠、 环亮氨酸、地查枸林、甲黄酸地查枸林、白瑞夸尔、奥昔嘌醇、澳马利特、溴巴酸(钠)、百利德定、溴脲苷、氟脲己胺、10-乙基去氮氨蝶呤、氟甲氨蝶呤、二氧甲氨蝶呤、5，10-双去氮四氢叶酸、甲满蝶呤、丁巯嘌呤、丁克他酰胺、胱氮杂乌苷、卡莫氟、尿嘧啶替加氟、戊稀吲哚、 硫若星、优福定、甲氧檗因、甲酰溶肉瘤素、氨(基)蝶呤、氨蝶呤钠、8-氮鸟嘌呤、二甲胺腺苷、(硝基)咪唑硫嘌呤、尿嘧啶、巯甲脲嘧啶、重氮丝氨酸、雷替曲塞、雷替曲占、盐酸洛拉曲克、槐定碱、甲酰四氢叶酸、甲基四氢高叶酸、唑来磷酸、替莫唑胺、比卡鲁胺、门冬酰胺酶、左亚叶酸钙、亚叶酸钙、坤来斯巴、三嗪苯酰胺、曲麦克特、曲马多、氯巴比酸、5-重氮脲嘧啶、吡拉西坦、托泊替康、盐酸拓扑替康、阿糖胞苷、环胞苷、羟基胍、5-氟尿嘧啶核苷、 5-氟尿嘧啶脱氧核苷、氟脲嘧啶脱氧核苷、甘油柑碱、阿垒可散、异恶唑醋酸、氨格鲁米特、 氨萘非特、氯胞苷、阿他美坦、氮杂胞苷、抗瘤氨酸、脱氧氮杂胞苷、右雷佐生、克雷斯托、克尼斯他酸、克拉利平、克拉利宾、加洛他滨、吉西他滨、伊巴他滨、依诺他滨、安西他滨、地西他滨、氟西他滨、卡培他滨、依诺他滨、咪唑他滨、克兰非鲁、卡拉酰胺、卡唑酰胺、卡巴萘醌、 偶氮苯溴丙胺、姜黄素、姜黄素二酮、酮曲沙、三甲曲沙、斯泼古宁、去氧斯泼古宁、萘脲磷酸胺、氯化地特卡里、磷酸氟达那苷、氟苄噻酮、藤黄酸、戈舍瑞林、氮枸岭、海尼白瑞宁、肌苷二醛、氯苯氨啶、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、柯替波斯地、益若蓝精、多潘、美洛格瑞、丙米腙、 迷托醌、米托坦、法扎拉滨、氟达拉滨、克拉屈滨、戊糖苷、苯来宁、苯来美特、磷嘧阿泽胺、匹毛尼唑、聚烯瑞尼酸、蝶酰天冬氨酸、蝶酰三谷氨酸、嘌米舌泊、利波腺苷、双曲秦、裂裥多糖、溴茴丙烯酸钠、氨偶氮苄、曲丁磺酯、三乙密胺、三亚胺醌、曲西瑞宾、磷酸曲西瑞宾、雷藤素甲、曲普瑞林、九布洛唑、优福定、维他命B-17、威麦宁、ζ-氮杂腺苷、扎西胞苷、依匹哌啶、阿莫诺期、阿多来新、阿克罗宁、阿拉诺新、阿美蒽醌、阿那曲唑、阿那西戎、阿那昔酮、 阿斯吲醒、阿西维辛、阿替韦啶、艾多昔芬、癌可萘、昂究吉宁、个鲁达卜辛、抗瘤酮、抗瘤酮 A-10、阿沙芳、芦笋精、芥吲酸、白瑞夸尔(钠)、(盐酸)必桑郡、格拉司琼、托烷司琼、氮烯咪胺、恩丹西酮、胸腺素、曲马多、甲磺酸伊马替尼、双氯芬酸、沙利度胺、托氟杀星、托瑞米芬、安溴索、高乌甲素、耐普等因、胸腺肽、氟他胺、乙亚胺、胺苯、氧化新喹、N-甲基甲酰胺、 牢可达唑、蒽甲硫脲、奥昔舒仑、氧化石蒜碱、泊芬撒尔、泊泽尼普定、戊必罗尔、螺氯丙醇、 原白头翁素、佳代胞、雷替尼卜定、生索拉德、素道霉素、茄软酯碱、亚胺醌、斯替苯嘧啶、泰莫佐罗、台多西隆、硫奥里发新、硝氨丫啶或安丫啶中的一种或多种，其中最优选为5-氮杂胞苷。化疗药物给药剂量按照公知有效剂量给药，如5-氮杂胞苷临床一般为静脉注射， 每次l-2mg/kg, 1次/日。另一方面，本发明还公开了一种治疗肿瘤的方法，该方法包括在放疗或/和化疗药物前，给予个体有效剂量的上述蛋白。本发明的药物组合物还可与其它肿瘤疗法联合应用，如同时、序贯或分别应用。本发明的药物组合物可包含有其它活性作用物。以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中，“rHuIL-lRa”、“IL-lRa”为同一物质，均为上文所指“hIL-IRa”。材料与方法主要试剂5-氮杂胞苷(5-Aza，Sigma公司)、福尔马林溶液多聚甲醛)、细胞膜通透剂 (0. 1 % Triton χ-100/0. 1 %柠檬酸钠 /PBS ρΗ 值 7. 2 7. 4)、BrdU (Sigma 公司)实验动物SPF级BALB/c小鼠，4周，雄性，上海斯菜克实验动物中心。实验方法1、5-氮杂胞苷(5-Aza)腹腔注射1)小鼠腹腔注射使用无菌一次性ImL注射器。2)腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。进针时从腹部一侧进针，向腹中线方向进针约Icm 后注射完药物，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。3) 5-Aza 注射剂量为 10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg，给药容积为 0. 1-0. 2mL02、小鼠胸腺的获取与称重1)胸腺位于胸腔前纵隔，紧靠心脏，呈灰白色，分左、右两叶。2)断颈处死小鼠，投入盛有IOOmL的75%酒精中浸透，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒医用托盘内的消毒纱布上引颈处死小鼠。3)用眼科镊小心捏起小鼠胸腔部的皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离皮肤与肌肉组织。在小鼠胸腔隔膜下向上剪断胸骨，打开胸腔。4)轻轻拨开心脏，注意不要刺破心脏或血管，露出胸腺，将胸腺及周围的组织剪下，置于干净的玻璃培养皿中。5)用无菌PBS轻轻冲洗胸腺组织，在卫生纸上轻轻吸去胸腺表面的血液及其他液体，尽量吸净。6)用眼科剪小心去除胸腺表面的结缔组织与淋巴组织，尽量去除干净后，用精密分析天平称重。3、胸腺指数胸腺指数=胸腺重(mg) /体重(g)4、胸腺细胞总数1)将胸腺置于干净的200目筛网上。筛网下置一干净的培养皿。2)加入 l-2mL 10% FBS/RPMI 1640 培养基至筛网上3)用玻璃注射器的针栓在筛网上轻轻研磨胸腺，直至无可见的块状胸腺组织。4)用3-5mL含10% FBS/RPMI 1640培养基冲洗筛网，尽量冲洗干净，避免筛网上有残留的胸腺细胞。10% FBS/RPMI 1640培养基流入筛网下方的培养皿中。5)收集培养皿中的胸腺细胞研磨液，加入15mL无菌离心管中。6) 1600rpm 离心 5 分钟。7)用预冷的0. 5% FBS/PBS洗涤一次。
8)将细胞重悬于2mL 5mM EDTA/PBS中，如有块状悬浮物，尽量用枪头吹打均勻， 如若不能，则弃去。9)取10 μ L胸腺细胞重悬液，加入事先准备好的血细胞计数仪稀释液中，上下颠倒混勻。用血细胞计数仪进行检测。5、胸腺组织固定用预冷的PBS冲洗胸腺；将冲洗后的胸腺放入新鲜配制的4%多聚甲醛固定液中， 其中固定液体积应大于10倍的胸腺体积；常温固定，至少固定M小时；每1-2星期更换固定液，可常温长时间保存。6、胸腺T细胞亚群增殖检验方法如上4制备胸腺细胞重悬液，加入PE-⑶4和PE-Cy5_⑶8抗体进行表面抗原标记后，用2%多聚甲醛固定细胞，0. Triton X-100/0. 1 %柠檬酸钠透化细胞膜，适宜浓度 DNase I解开DNA双链；胸腺细胞FITC-BrdU抗体染色后先经过前向角(FSC)和测向角散射光(SSC)分析，去除细胞粘连和细胞碎片，分析选中的细胞群。FITC-BrdU抗体染色可见细胞未增殖细胞(BrdU阴性，BrdU_)和增殖细胞(BrdU阳性，BrdU+)区分明显，选择BrdU+/SSC设门划定增殖细胞，通过同时分析FL2-H和FL3-H双通道，检测胸腺细胞⑶4和⑶8表面抗原的分布。下列实施例中，对照组(NS或control)为腹腔注射生理盐水的小鼠组，给药组 (rHuIL-IRa或IL-IRa)为腹腔注射rHuIL-IRa的小鼠组。实施例1. 5-Aza化疗对胸腺的损伤以及rHuIL_lRa预防性给药对胸腺的保护在化疗前5天连续注射:3mg/kg/天rHuIL_lRa，在最后一次蛋白给药M小时内腹腔注射100mg/kg 5-Aza(记为第0天)，在第0天(注射5-Aza前)、1. 5天、3天、7天、11 天、14天分别取对照组与给药组小鼠胸腺，观察胸腺指数与胸腺病理切片H&E染色的变化。实验结果表明，5-Aza对小鼠胸腺的毒副作用明显，并引起化疗导致的胸腺损伤及修复的过程。化疗后第1.5天、3天、7天，对照组(NS)小鼠与给药组(rHuIL-IRa)小鼠胸腺指数急剧下降。在第3天对照组小鼠胸腺指数为化疗前水平的13. 20%;给药组为化疗前水平的22. 86%，比对照组胸腺指数高82. 22%，显著高于对照组，具有统计学意义(双尾T 检验，η = 4-6)。在第7天，对照组与给药组小鼠胸腺指数降低至最低点，表明第7天为化疗导致最严重的毒副作用时间点，对照组小鼠胸腺指数为化疗前水平的8. 94%，给药组为 20. 09%，比对照组高136. 1%，显著高于对照组(双尾T检验，η = 4-6)。在第7天后小鼠胸腺开始迅速恢复。在第14天，对照组小鼠胸腺指数上升至化疗前水平的70. 43%，给药组恢复至化疗前水平的64. 93%，给药组与对照组间胸腺指数无显著差异(图2)。对化疗后第0天、1. 5天、7天、11天和14天的胸腺HE染色切片进行分析，结果表明(1)在化疗前，胸腺组织皮质、髓质完整，皮质厚且与髓质有清晰的分界线。对照组与给药组无显著差异(图3)。(2)在化疗第1.5天及第7天，胸腺体积，皮质、髓质面积减小，对照组(赂)胸腺皮质髓质界限模糊，给药组(rHuIL-IRa)胸腺皮质髓质界限清晰。这表明胸腺皮质髓质在 5-Aza注射后受损，且rHuIL-IRa对化疗中的胸腺起到了保护作用(图3，图4)。(3)在化疗后第11天和第14天，通过切片观察胸腺组织皮髓质完整，面积与厚度
10逐渐恢复至化疗前水平，且胸腺皮髓质界限清晰，表明胸腺逐渐恢复(图3)。通过5-Aza注射后小鼠胸腺指数与胸腺切片H&E染色图，可知5_Aza化疗后的0 至7天为小鼠胸腺的急性损伤期，在损伤期胸腺重量急剧减小，胸腺指数下降，其中第7天为胸腺损伤最为严重的时间点。rHuIL-IRa预防性给药能够在小鼠胸腺的损伤期第3天、第 7天减少化疗对小鼠胸腺指数的减少，并且在第7天能够减轻小鼠胸腺组织病理学的损伤， 表明rHuIL-IRa能够减轻5_Aza化疗导致的小鼠胸腺损伤。实施例2. rHuIL-IRa预防性给药保护了胸腺损伤并促进其修复实验动物为4周龄BALB/c雄性小鼠，实验设生理盐水对照组与rHuIL-IRa蛋白给药组。rHuIL-IRa的给药剂量为:3mg/kg，在化疗前5天每12小时注射一次，注射方式为皮下注射，并以注射同体积无热源生理盐水(赂)的小鼠为对照组。在最后一次注射蛋白24h 内，腹腔一次性注射5-Aza 100mg/kgo在第0天(注射5_Aza前)、第7天、第11天分别处死一批小鼠，检测小鼠胸腺指数、胸腺细胞总数、胸腺细胞亚群比例、胸腺细胞增殖、以及外周血初始T细胞的变化。2.1 rHuIL-IRa对胸腺指数与胸腺细胞总数的作用实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例2描述。在化疗后的第0天、7天、11天分别取对照组、给药组小鼠5 6只，处死后分离胸腺，制备胸腺细胞悬液，rHuIL-IRa对胸腺指数与胸腺细胞总数的保护作用与实施例1的实验结果相符合(1)化疗后第7天，给药组小鼠胸腺指数显著高于对照组(图5) ； (2)化疗后第7天，rHuIL-IRa给药组小鼠胸腺细胞总数显著高于对照组，比对照组高131. 11%。第11天胸腺恢复期，rHuIL-IRa给药组胸腺细胞总数显著高于对照组，比对照组高28. 03% (图6)。2. 2 rHuIL-IRa对胸腺T细胞亚群的作用试验方法1)实验设计及小鼠的给药方法见上述实施例2描述。在化疗后的第0天、7天、11 天分别取对照组、给药组小鼠5 6只，处死后分离胸腺，制备胸腺细胞悬液，计数细胞浓度。按照下表准备细胞表.1胸腺T细胞亚群表面抗原⑶4、⑶8比例检测样品
权利要求
1.一种如下(a)或(b)的蛋白在制备用于治疗或保护放疗和(或)化疗药物导致的胸腺急性损伤、胸腺淋巴细胞损伤和(或)外周T淋巴细胞减少的药物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQID NO. 1所述的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列70%同源性且具有预防或治疗放疗和(或)化疗药物导致的胸腺急性损伤、胸腺淋巴细胞损伤和(或)外周T淋巴细胞减少活性的蛋白。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述胸腺淋巴细胞为胸腺T细胞。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述外周T淋巴细胞为CD4+CD45RA+T细胞和 (或)CD8+CD45RA+T 细胞。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述胸腺T细胞可为DNT细胞、DPT细胞、 CD4SPT细胞和(或)CD8SPT细胞。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述所述(b)的蛋白为氨基酸序列如SEQID NO. 2所述的蛋白。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述化疗药物可选自烷化剂类药物、抗代谢类药物、抗生素类药物、植物类药物、激素类药物、金属络合物、或蛋白药物。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述化疗药物为抗代谢类药物。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗代谢类药物选自脱氧氟尿苷、5-脱氧氟尿苷、氟脲苷、丙硫氧嘧啶、丁基氟尿嘧啶、双喃氟啶、5-氟嘧啶醇、磺巯嘌呤钠、巯咪嘌呤、6-巯基嘌呤、6-氨基嘌呤盐酸盐、甘氨硫嘌呤、硫乌嘌呤、溶癌呤、硫酸胼、卫康醇、亚丝醌、芬可洛宁、异优散酮、抑素、氯屈磷酸、氯屈磷酸二钠、环亮氨酸、地查枸林、甲黄酸地查枸林、白瑞夸尔、奥昔嘌醇、澳马利特、溴巴酸(钠)、百利德定、溴脲苷、氟脲己胺、10-乙基去氮氨蝶呤、氟甲氨蝶呤、二氧甲氨蝶呤、5，10-双去氮四氢叶酸、甲满蝶呤、丁巯嘌呤、丁克他酰胺、胱氮杂乌苷、卡莫氟、尿嘧啶替加氟、戊稀吲哚、硫若星、优福定、甲氧檗因、甲酰溶肉瘤素、氨(基)蝶呤、氨蝶呤钠、8-氮鸟嘌呤、二甲胺腺苷、(硝基)咪唑硫嘌呤、尿嘧啶、巯甲脲嘧啶、重氮丝氨酸、雷替曲塞、雷替曲占、盐酸洛拉曲克、槐定碱、甲酰四氢叶酸、甲基四氢高叶酸、唑来磷酸、替莫唑胺、比卡鲁胺、门冬酰胺酶、左亚叶酸钙、亚叶酸钙、坤来斯巴、 三嗪苯酰胺、曲麦克特、曲马多、氯巴比酸、5-重氮脲嘧啶、吡拉西坦、托泊替康、盐酸拓扑替康、阿糖胞苷、环胞苷、羟基胍、5-氟尿嘧啶核苷、5-氟尿嘧啶脱氧核苷、氟脲嘧啶脱氧核苷、甘油柑碱、阿垒可散、异恶唑醋酸、氨格鲁米特、氨萘非特、氯胞苷、阿他美坦、氮杂胞苷、 抗瘤氨酸、脱氧氮杂胞苷、右雷佐生、克雷斯托、克尼斯他酸、克拉利平、克拉利宾、加洛他滨、吉西他滨、伊巴他滨、依诺他滨、安西他滨、地西他滨、氟西他滨、卡培他滨、依诺他滨、咪唑他滨、克兰非鲁、卡拉酰胺、卡唑酰胺、卡巴萘醌、偶氮苯溴丙胺、姜黄素、姜黄素二酮、酮曲沙、三甲曲沙、斯泼古宁、去氧斯泼古宁、萘脲磷酸胺、氯化地特卡里、磷酸氟达那苷、氟苄噻酮、藤黄酸、戈舍瑞林、氮枸岭、海尼白瑞宁、肌苷二醛、氯苯氨啶、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、柯替波斯地、益若蓝精、多潘、美洛格瑞、丙米腙、迷托醌、米托坦、法扎拉滨、氟达拉滨、 克拉屈滨、戊糖苷、苯来宁、苯来美特、磷嘧阿泽胺、匹毛尼唑、聚烯瑞尼酸、蝶酰天冬氨酸、 蝶酰三谷氨酸、嘌米舌泊、利波腺苷、双曲秦、裂裥多糖、溴茴丙烯酸钠、氨偶氮苄、曲丁磺酯、三乙密胺、三亚胺醌、曲西瑞宾、磷酸曲西瑞宾、雷藤素甲、曲普瑞林、九布洛唑、优福定、 维他命B-17、威麦宁、ζ-氮杂腺苷、扎西胞苷、依匹哌啶、阿莫诺期、阿多来新、阿克罗宁、阿拉诺新、阿美蒽醌、阿那曲唑、阿那西戎、阿那昔酮、阿斯吲醒、阿西维辛、阿替韦啶、艾多昔芬、癌可萘、昂究吉宁、个鲁达卜辛、抗瘤酮、抗瘤酮A-10、阿沙芳、芦笋精、芥吲酸、白瑞夸尔 (钠)、(盐酸)必桑郡、格拉司琼、托烷司琼、氮烯咪胺、恩丹西酮、胸腺素、曲马多、甲磺酸伊马替尼、双氯芬酸、沙利度胺、托氟杀星、托瑞米芬、安溴索、高乌甲素、耐普等因、胸腺肽、氟他胺、乙亚胺、胺苯、氧化新喹、N-甲基甲酰胺、牢可达唑、蒽甲硫脲、奥昔舒仑、氧化石蒜碱、 泊芬撒尔、泊泽尼普定、戊必罗尔、螺氯丙醇、原白头翁素、佳代胞、雷替尼卜定、生索拉德、 素道霉素、茄软酯碱、亚胺醌、斯替苯嘧啶、泰莫佐罗、台多西隆、硫奥里发新、硝氨丫啶或安丫啶中的一种或多种。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗代谢类药物为5-氮杂胞苷。
10.一种肿瘤治疗药物组合药盒，其包括肿瘤化疗药物制剂和活性成分为权利要求1 所述蛋白的药物组合物的制剂。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及IL-1Ra的新用途。本发明公开了一种如下IL-1Ra类蛋白在制备用于治疗或保护放疗和/或化疗药物导致的胸腺淋巴细胞损伤或或外周T淋巴细胞减少的药物中的用途。本发明所述蛋白可有效地降低治疗或预防放疗或/和化疗药物导致的胸腺急性损伤和/或免疫功能抑制副作用，将可能为今后临床肿瘤的治疗提供新的选择。
文档编号A61P35/00GK102370967SQ201010253070
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者于鸿晶, 俞雁, 韩伟 申请人:上海交通大学, 上海伍洋生物医药技术有限公司