一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法

专利名称：一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种穿梭质粒，特别是一种双启动子可诱导 可分泌型穿梭质粒及其构建方法。
背景技术：
生物工程领域中，为了有效表达克隆基因，常常需要进行表达载体的构建。大肠杆 菌表达系统是基因工程研究中最常用的一种。它虽然不能如真核系统那样进行翻译后加 工，但大肠杆菌其遗传背景相对清楚，操作简便、生长周期短、经济安全，因此仍然是使用最 广泛、也是不可被替代的系统，在基因工程基础研究和实际应用中成为不可缺少的重要工 具。一些重要的外源基因在大肠杆菌中获得了占菌体总蛋白30%甚至40%多的高效表达 量。通常大肠杆菌表达载体应满足以下要求1、适用范围要广；2、基因表达量高；3、表达的 产物容易纯化；4、质粒稳定性要好。可是迄今为止还没有一个表达载体能完全满足上述要 求。就表达基因的质粒载体来说，一般最好要符合下面的条件1、表达载体要具有多拷贝 或高拷贝性；2、最好具有可诱导的强启动子；3、有强的转录终止序列；4、有最佳最有效的 翻译起始序列。而要是具有分泌表达则更具优越性，这样表达蛋白可正确折叠，更具生物 活性且产物可溶；而且表达的蛋白分泌到胞外，能方便分离纯化。在这些系统中，枯草杆菌 就具有这种功能，枯草杆菌还是一种非致病性微生物，对人畜无害，所以常被许多研究者作 为表达系统加以应用。但是在实际应用过程中，枯草杆菌质粒的提取与转化效率明显不如 常用的大肠杆菌。如果在大肠杆菌中进行DNA分子操作，显得简便易行，完成了基因操作 后，再在枯草杆菌中进行外源蛋白的高效表达，表达产物分泌于胞外，可以较好的解决和克 服大肠杆菌表达产生包涵体，需要变性复性的烦琐操作。所以构建大肠杆菌_枯草杆菌穿 梭表达分泌载体成为一个重要选择[工业微生物，1989，19(1) :1_6 ；生物工程学报，2002， 18(4) =438-4411 ；遗传学报，2000，27 (7) =647-6531] 0上个世纪后期，许多科学工作者构建 各类表达载体，以期能够在大肠杆菌、或者在枯草杆菌、或者在大肠杆菌-枯草杆菌等不同 的载体中同时高效表达基因。有的构建多功能启动子同时启动表达以提高表达水平等等。 所有的研究目的只有一个，那就是千方百计以最小成本换取最大表达产量，以降低表达产 物如生物医药产品的生产成本；或者大大减少研究开发的时间和成本。所以，公开发表有许 多不同表达载体构建成功的报导，以满足不同研究和生产目的的需要。这些表达载体进行 融合表达、有的非融合表达、有的进行分泌型表达、有的带纯化标签的表达等等。本发明构建的表达载体符合上述条件。本发明以杀菌肽牛乳铁蛋白、人源LL-37、 溶菌酶等这些对宿主产生毒杀作用的蛋白作为报告基因进行操作，更有优越性。能够克服 其对宿主的毒杀作用，进行在原核生物中表达重要目的蛋白更具有实际意义。溶菌酶是广泛存在于生物体内各器官、组织、血清或唾液的水解酶，在动植物、噬 菌体等生物体内都有发现。迄今相关的报道如鸟类溶菌酶、T4溶菌酶、P22溶菌酶、蛋清 溶菌酶等，有数十种之多。其中蛋清中的溶菌酶含量尤为丰富，占蛋清总蛋白的3. 4% 3.5%，使用也最广。溶菌酶是一种非特异性免疫分子，能够提高机体的免疫功能，同时还具有抗肿瘤、抗病毒、改善和增强巨噬细胞吞噬、消化功能。目前溶菌酶更多的是杀菌功能 的应用。溶菌酶是以裂解细菌细胞壁的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酸葡萄糖酸(NAG) 间的(1-4)糖苷键而使细菌裂解杀灭细菌的。然而溶菌酶只能对部分革兰氏阳性菌起作 用，在作用于一类人、畜易感疾病的金葡菌时却难以凑效，对一些易致病的阴性菌(如大肠 杆菌)难有强的杀灭作用，表现出杀菌谱不广、效率有限的局限性。此后，研究者对溶菌酶 进行定点突变，开展对溶菌酶的基因改造研究，情况虽有改善但效果不显著。为解决杀菌 谱问题，实际应用中常需要与其他杀菌物质配伍使用，如添加抗生素，或添加生物碱、聚磷 酸、甘氨酸等其他物质，以此来增加杀菌效果和扩大杀菌谱，这些物质对于溶菌酶来说起到 了增效使用。人源溶菌酶是溶菌酶的一种来源，DNA序列与蛋清溶菌酶十分相似，仅多了 一个氨基酸，分子中同样含有八个半胱氨酸，八个半胱氨酸两两折叠形成四对二硫键，活性 位点也相同。除若干个别氨基酸有变化外，酶的作用方式和功能相同，人源溶菌酶作用溶 壁微球菌的活性要高出蛋清溶菌酶3倍。由于人源溶菌酶获得极其困难，不少研究者开 始利用基因工程技术克隆人源溶菌酶基因[动物医学进展，2009，30 (4) :5-7;科学通报， 48(20) 2149-2153 ；Agric Biol Chem,1986,50(3) :713 723 ；Gene,1987,56 53-59 ；Appl Microbiol Biotechnol, 1992,38 109-114 J. FEBSLetters, 2001, 506 (1) :27_32]。人溶菌 酶与蛋清溶菌酶一样存在杀菌谱问题。寻找生物活性肽与之联合应用可以解决上述缺陷。如抗菌肽(Antibacterial peptides, ABP)就是一类功能肽，或称抗微生物肽或肽抗生素，是生物体内先天免疫的重 要组成成分。杀菌肽杀菌谱广，能杀灭抗生素耐药菌株，能抑杀真菌、病毒、寄生虫，甚至肿 瘤细胞和实体瘤等特点，重要的是杀菌肽使用不易产生耐药性突变，理化性质稳定、抗菌 机理独特，又容易溶于水，对高等动物正常细胞少有毒害等许多优点。因此专家预言经过 努力，有朝一日有望开发成为新一代抗细菌、真菌、病毒甚至是抗癌的药物。在美、日等发 达国家，用这些功能肽制成健康食品，如多肽饮料、多肽儿童餐、老人餐、多肽保健食品、抗 辐射含片等。可预见的将来活性多肽的应用将充满希望，成为最具绿色安全的一类杀菌 剂，充满活力。现在被发现并研究的杀菌肽有上百种之多，如天蚕素(cecropins)、蛙皮素 (Magainins)、蜂毒素(melittins)、蝉、蚕抗菌肽及鸡、奶牛和人的杀菌/通透性增加蛋白 (BPI)、人源抗菌肽LL-37等等。在生物体内这些杀菌多肽分泌量极少，获取十分困难，现在 以化学合成这些杀菌多肽在国内还基本局限在研究领域，有规模的应用其趋势并没形成， 原因就是成本成了扩大应用的最大问题。应用基因工程方法克隆并表达杀菌肽成为首选[Biochimica et Biophysica Actal758(2006) 1351-1358 ；微生物通报，1997，24 (6) 350-353 ；中国卫生检验杂志， 2009，19(6) :1202-1205 ；中国兽医学报，2009，29(8) =1041-1044] 克隆和表达杀菌肽都需 要克服几个障碍。1，由于杀菌肽分子量都比较小，一般都在几十个氨基酸左右，所以表达时 表达量并不高；2，适合于表达抗菌肽的表达系统十分有限，一般只能在真核生物如酵母或 奶牛乳腺或昆虫等进行表达，如果用原核生物作为宿主来表达存在表达产物毒害或杀灭宿 主自身的问题，所以一般并不能直接在原核生物中表达，高表达或分泌型表达更为困难；3， 正因为杀菌肽分子量小，一旦表达过量非常容易被宿主菌蛋白酶识别降解。因此表达杀菌 肽常与其他大分子蛋白融合表达，但融合表达会使杀菌肽失去杀菌功能；4，为使表达的融 合蛋白具有生物学活性，需要对表达产物进行有效切割，从融合状态释放出杀菌肽恢复杀菌功能。目前常用切割方法有使用肠激酶、凝血酶、Xa因子或BrCN等。BrCN是有毒化学 品；使用凝血酶等酶类则价格昂贵而制约了融合杀菌多肽规模化生产和应用。只有解决了 上述这些问题才能真正进行规模化生产。本发明以杀菌肽、溶菌酶为报告基因，比较构建的 双启动子诱导分泌型穿梭质粒表达杀菌肽、溶菌酶情况。效果显著。不同的基因克隆到表达 载体后同时能够在不同表达系统中获得分泌型表达，方便地找到最佳表达杀菌肽的表达系 统，减少研究时间和成本。通过本发明的穿梭质粒载体表达更具重要药用价值的酶、蛋白、 激素等将更具现实意义。

发明内容
本发明的目的在于提供一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法，所 述的这种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法要解决现有技术中的载体表达 杀菌肽的量小，或成本过大而不能大规模生产的技术问题。本发明提供了一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，所述的穿梭质粒由一个酶 切的大肠杆菌pET-28a质粒和一个酶切的枯草杆菌pE194质粒构成，所述的酶切的大肠杆 菌pET-28a质粒上插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段和牛乳铁蛋白。进一步的，所述的抗菌肽基因为一种、或者任意两种或者两种以上的杀菌功能肽 氨基酸片段的组合，或者任意一个功能片段的重复串联融合。进一步的，所述的抗菌肽基因为牛乳铁蛋白肽基因、或人源杀菌肽基因、或人源溶 菌酶基因、或天蚕素基因、或蛙皮素基因、或蜂毒素基因、或其他来源抗菌肽基因。进一步的，所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段中的溶葡球菌酶的酶切识别位点氨基 酸序列为GGG。本发明还提供了上述的这种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，包 括一个在NdeI和XhoI位点酶切大肠杆菌pET-28a质粒的步骤，在所述的酶切大肠杆菌 pET-28a质粒NdeI和XhoI酶切位点之间插入至少一个抗菌肽功能片段，还包括一个构建 启动子信号肽片段的步骤，在所述的启动子信号肽片段上依次设置有Bglll、PstI, NheI, KpnI和BglII酶切位点，所述的启动子信号肽片段的序列如SEQ ID NO :2所示，然后分别用 BGlII酶切启动子信号肽片段和大肠杆菌pET-28a质粒，采用连接酶连接，形成一个插入有 启动子信号肽片段的大肠杆菌pET-28a质粒，还包括一个构建溶菌酶_抗菌肽功能片段的 步骤，在溶菌酶_抗菌肽功能片段的两端分别设置有NheI和KpnI酶切位点，然后在插入有 启动子信号肽片段的大肠杆菌pET-28a质粒的NheI和KpnI位点酶切，插入溶菌酶-抗菌肽 功能片段，采用连接酶连接，形成一个插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a 质粒，还包括一个在插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a质粒的PstI位点 酶切的步骤，在PstI位点酶切的枯草杆菌pE194质粒，然后插入有溶菌酶-抗菌肽功能片 段的大肠杆菌pET-28a质粒，构成本发明的双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒。进一步的，在一个构建启动子信号肽片段的步骤中，PCR扩增启动子信号肽功能片 段的引物序列为Pl 5-AAGATCTCTGCAGCCGGAACTCTTGAATG (BglII 和 PstI)，P2 5-AAGATCTGCTTCAACTTTAGGAA(BglII)，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有效的终止子片段，
采用人工合成三段DNA片段，通过重叠PCR扩增获得终止子片段，引物序列为P3 5-CATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGC,P4 5-ACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA,P5 5-CGCCATGCCGGCAAGCTTCAACTTTAGGAATGAGAAAAAATTTTTATTTGCTCTAA,再通过启动子信号肽片段和终止子片段的重叠PCR，获得完整的启动子信号肽功 能片段，正向P7 5-AAAATGAAACACATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCC (NheI、KpnI)反向P8 :5~GGCCGCCGCCGCCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTG (NheI、KpnI)合成出启动子信号肽功能片段后，以此片段为模板，以引物Pl与引物P8，引物P7 与引物P5，分别合成出二个片段，电泳回收后，混合回收的二片段，再以P1、P5 二引物进行 重叠PCR，获得含有BglII、PstI, NheI, KpnI和Bgl11酶切位点的启动子信号肽功能片段。进一步的，所述的启动子信号肽功能片段上克隆有启动子序列、信号肽序列、终止 子序列、六个组氨酸，所述的启动子包括-35区、-10区和核糖体结合位点AGGAGGT。所述的 信号月太序列为TTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCT TAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGC,所述的终止子序列为 TGAGCGCGCT TTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAAATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGCCGGCATGGCG,所述的 启动子信号肽片段上还克隆有BglII、PstI、NheI、KpnI和BglII酶切位点。进一步的，在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点 GGC(3Gly)和 6His。进一步的，在一个构建溶菌酶_抗菌肽功能片段的步骤中，所述的抗菌肽基因为 一种、或者任意两种或者两种以上的杀菌功能肽氨基酸片段的组合，或者任意一个功能片 段的重复串联融合。进一步的，所述的抗菌肽基因为牛乳铁蛋白肽基因、或人源杀菌肽基因、或人源溶 菌酶基因、或天蚕素基因、或蛙皮素基因、或蜂毒素基因、或其他抗菌肽基因。进一步的，在融合蛋白的抗菌肽之间插入有溶葡球菌酶切割位点。进一步的，在大肠杆菌pET_28a质粒的NheI和KpnI位点之间插入有溶葡球菌酶 切割位点。进一步的，在牛乳铁蛋白基因C端有溶葡球菌酶的切割识别位点GGG，所述的牛乳 铁蛋白基因的碱基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的牛乳铁蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO 3所示。进一步的，所述的抗菌肽基因中含有二分子串连的人源杀菌肽基因LL-37，所述的 人源杀菌肽基因LL-37，其N端氨基酸改变为Gly，第4、30位氨基酸变为Asn，第11、16、36 位氨基酸改变为Gln，第13、20、24、33氨基酸改变为Pro，C端增加Gln和Gly 二个氨基酸， 所述的人源溶菌酶与二分子人源LL-37融合蛋白基因的碱基序列为SEQ ID NO :4所示，所 述的人源溶菌酶与二分子人源LL-37融合蛋白基因的氨基酸序如SEQ ID NO :5所示。本发明还提供了上述的双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒在制备治疗抗菌药物 中的应用。本发明提供了一种双功能诱导分泌型穿梭表达载体，同一表达载体克隆的目的蛋 白基因可在不同表达系统中高效表达，特别是表达一类对原核生物有毒杀作用的如杀菌
7肽、溶菌酶、毒蛋白等基因。本发明的构建过程是在pET_28a质粒上克隆有牛乳铁蛋白基 因于多克隆位点的NdeI和XhoI位点之间，成功删除NheI位点的步骤，本发明包括了一个 在克隆的启动子信号肽功能片段上引入BglII和PstI酶切位点步骤，不改变pET-28a结 构，把启动子信号肽功能片段克隆到pET-28a上，还包括了 BglII单酶切pET_28a和PCR扩 增的启动子信号肽功能片段，将BglII酶切后的pET-28a与PCR扩增的功能片段采用连接 酶连接步骤，包括一个将连接后的质粒转化的步骤；包括Bgl11单酶切插入pET-28a后鉴定 功能片段插入方向的步骤；包括含分泌型表达启动子信号肽功能片段的pET-28a与pE194 穿梭的步骤，将PstI酶切pET-28a与pE194，纯化后采用连接酶连接的步骤，包括一个将连 接后的质粒转化的步骤，得到能在大肠杆菌、枯草杆菌和球形芽孢杆菌中穿梭表达克隆基 因的穿梭质粒转化子。本发明扩增的启动子信号肽片段引入BglII和PstI，BglII位点在pET_28a载体 上是唯一的酶切点，可以在不改变pET-28a功能的情况下把启动子信号肽功能片段克隆到 pET-28a上；pET-28a载体上没有PstI，通过PCR引物扩增引入PstI位点，方便与枯草杆菌 PE194质粒穿梭，构建能在大肠杆菌、枯草杆菌、球形芽孢杆菌中均能表达基因的穿梭质粒。 引入的NheI和KpnI位点可以使表达的目的蛋白基因以正确方向插入表达。NheI位点还是 信号肽酶的识别切割位点，有利于表达蛋白分泌于胞外。本发明的双启动子诱导分泌型表达穿梭质粒中的抗菌肽基因可以通过诱导表达， 也可以分泌型胞外表达，也可以抗菌肽部分氨基酸片段中任意一个功能片段的重复串联融 合表达，也可以同一基因重复串联表达，其间引入溶(葡球)菌酶切割位点，表达后经溶 (葡球)菌酶酶切恢复杀菌功能。本发明提供了一种可以诱导表达，也可以外分泌表达目的蛋白的穿梭质粒，以及 高效表达溶菌酶或杀菌肽或毒蛋白等基因的方法。本发明构建的表达载体适合于在原核生 物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌)中表达。该穿梭质粒转入原核生物以融合 方式表达毒蛋白、杀菌肽等蛋白对宿主不表现毒杀作用。通过本发明的穿梭质粒表达人源 LL-37、牛乳铁蛋白、溶菌酶等多肽蛋白或融合蛋白获得成功。本发明构建的表达载体质粒 引入6His，方便通过M柱纯化。纯化后的融合蛋白经溶(葡球)菌酶对各融合肽段间酶切 位点的识别(GGG)，并正确切割，释放各功能肽使其恢复原有活性，而用于切割的溶(葡球) 菌酶免去分离而被直接使用，溶(葡球)菌酶本身就是专一杀灭金黄色葡萄球菌的酶。该 方法对于表达一类对宿主有毒杀作用的蛋白特别有效，方法简便，易于操作，构建一个表达 的目的蛋白表达载体可以同时在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌中进行表达，从中 方便地找到最适合高产的表达系统，具有一定的共用性。省时省力，事半功倍。本发明构建 的穿梭表达载体质粒也可以经IPTG或者乳糖诱导，以提高基因表达水平；也适合于外分泌 表达，外分泌表达的目的蛋白处理方便又没有内毒素污染。由于具有双功能启动子，不同基 因都可在合适的正确方向插入基因进行表达。本发明构建的穿梭质粒设计考虑以下特点pET-28a是Novagen公司商业化表达 载体，质粒载体上含有单一 BglII酶切位点，BglII酶切不改变原质粒载体功能，利用BglII 酶切点把PCR扩增的分泌型启动子信号肽功能片段插入于pET-28a ；pET-28a载体上没有 PstI，在PCR扩增分泌型启动子信号肽功能片段时引入PstI，扩增后用PstI酶切含分泌型 启动子信号肽功能片段的pET-28a和pE194 二质粒，T4连接酶连接，CaC12法转化感受态大肠杆菌DE3，得到能在大肠杆菌和枯草杆菌中穿梭表达克隆基因的穿梭质粒转化子。在此穿 梭质粒表达基因时所克隆的启动子有较广的共用性，克隆一个表达载体质粒就能够在大肠 杆菌、枯草杆菌和球形芽孢杆菌中启动表达；质粒上克隆有信号肽序列，能够使表达的目的 蛋白分泌于胞外，方便分离纯化；设计了有效的终止子和终止子序列，能够使蛋白翻译有效 终止；信号肽酶切割位点设计有利酶切后克隆基因的正确方向的连接；穿梭质粒载体上克 隆有6His，能够方便地通过M柱进行分离纯化；穿梭质粒载体克隆有溶葡球菌酶的酶切识 别点(GGG)，当M柱纯化的目的蛋白有多个功能肽融合表达时，通过溶葡球菌酶酶切，方便 地释放出融合肽蛋白，对表达如抗菌肽、毒蛋白这样一类对宿主有毒害或杀灭作用的蛋白 更有意义。总之，本发明设计的穿梭质粒具有一定的共用性，可以将不同的基因克隆于载体 进行表达。本发明和已有技术相比，其效果明显，主动性、针对性强。发明在各融合功能肽 之间引入连接小肽，该连接小肽能被溶葡球菌酶专一性切割[Recsei，PNAS，1987，Vol84, PP1127-1131]，通过溶葡球菌酶专一性切割恢复原有肽的杀菌功能。在工程菌的培养过程 中，融合的杀菌肽表达对宿主菌自身不再产生毒害，融合表达又使分子量增大不再被宿主 菌降解，表达量随之增加，尤其表达象人溶菌酶这样的一类酶，该酶本身就是一个抑杀细菌 的酶。同时，考虑到表达产物的分离纯化，在融合蛋白C端融合了 6His，当发酵结束，利用 Ni柱方便地将融合蛋白纯化，再用溶葡球菌酶对融合蛋白进行专一性切割，释放出多肽使 其恢复原有杀菌功能。本发明特征表现在，表达的溶菌酶和杀菌多肽及用于切割融合多肽 的溶葡球菌酶均具杀菌功能，本发明是用基因工程方法提高大量生产高活性杀菌多肽为目 的，因而不需要对切割用溶葡球菌酶进行分离和纯化被直接使用。本发明是一种应用基因 工程技术生产各种杀菌多肽、人溶菌酶或它们之间的融合蛋白的一种技术方法。


图1为双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建示意图。图2是抗菌肽的杀菌效果图。
具体实施例方式实施例1双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建双启动子可诱导分泌型大肠杆菌和枯草杆菌穿梭质粒的构建如图1所示。大肠 杆菌pET-28a为Novagen商品化表达质粒。NdeI和XhoI双酶切pET_28a，插入含NdeI和 XhoI酶切位点的牛乳铁蛋白的二段功能肽，以此删除多克隆位点中的Nhel。删除NheI是 为随后构建的启动子信号肽功能片段中引入有信号肽酶的切割位点Nhel，NheI也是基因 以正确方向插入的位点；插入的0. 3kb牛乳铁蛋白基因可以在IPTG或乳糖的诱导下进行诱 导表达。克隆的牛乳铁蛋白的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQID N0:3所 示。CATATGGGCGGCGGCTTCAAATGCTGGCGCTGGCAGTGGCGCTGGAAGAAACTGGGCGCGCCGAGCATTACCTG CGTGCGCCGCGCGTTTGGCGGCGGCTTCAAATGCTGGCGCTGGCAGTGGCGCTGGAAGAAACTGGGCGCGCCGAGCA TTACCTGCGTGCGCCGCGCGTTTGCGGGCCGCCGCCTCGAG克隆分泌型的启动子信号肽片段可以使表达的目的蛋白分泌于胞外。设计的启动子信号肽片段PCR扩增引物。Pl5-AGCCGGCATGGCCTGCAGCCGGAACTCTTGAATG,P2 5-CCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTGA,在扩增的启动子和信号肽功能片段中引入BglII和PstI，BglII位点在pET_28a 载体上是唯一的酶切点，可以在不改变pET-28a功能的情况下能把启动子信号肽功能片段 克隆到pET-28a上；pET-28a载体上没有PstI，通过PCR引物扩增引入PstI位点，方便与枯 草杆菌pE194质粒穿梭，构建能在大肠杆菌、枯草杆菌、球形芽孢杆菌中都能表达基因的穿 梭质粒。引入的NheI位点既是信号肽酶切割位点，也是表达基因以正确方向插入的位点。 用PCR方法扩增出启动子信号肽功能片段。启动子信号肽功能片段的PCR扩增条件，94°C 变性3分钟后，94°C变性30s，55°C退火40s，72 °C延伸30s。30循环后72°C延伸3分钟。用 纯化kit纯化PCR扩增产物。在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有有效的终止子区，以及6His以方便纯 化，所含的三个Gly密码子可以在表达纯化后由溶(葡球)菌酶酶切除6His，使表达产物更 接近于原始序列。采用人工合成三段DNA片段，通过重叠PCR扩增获得终止子片段，引物序列为
P3 5-CATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGC,P4 5-ACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA,P5 :5~CGCCATGCCGGCAAGCTTCAACTTTAGGAATGAGAAAAAATTTTTATTTGCTCTAA,用引物P2和P3重叠PCR扩增出9Ibp片段，再以此片段为模板，用Pl和P3引物 PCR扩增出终止子引物序列132bp。终止序列PCR扩增条件，94°C变性3分钟后，94°C变性 30s，55°C退火40s，72°C延伸30s，30循环。完成二次PCR后用纯化kit纯化PCR扩增产物。得到启动子信号肽片段和终止子片段后，再以扩增启动子信号肽片段的Pl引物 和扩增终止子片段的P3引物进行重叠PCR，扩增出含有启动子信号肽和终止子区的功能片 段。PCR扩增体系50uL，启动子信号肽片段和终止子片段各2uL为模板，启动子信号肽片 段Pl引物luL，终止子片段P3引物IuL, Taq酶缓冲液5uL，10mmol/L dNTP 1. 5uL，Taq酶 0. 3uL，水 37. 2uL。PCR 扩增条件94°C变性 3 分钟后，94°C变性 30s，54°C退火 40s, 72°CM 伸45s，30循环，再72°C延伸2分钟。再通过启动子信号肽片段和终止子片段的重叠PCR，获得完整的启动子信号肽功 能片段，ιΗ向 P7 :5~AAAATGAAACACATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCC (NheI、KpnI)反向P8 :5~GGCCGCCGCCGCCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTG (NheI、KpnI)合成出启动子信号肽功能片段后，以此片段为模板，以引物Pl与引物P8，引物P7 与引物P5，分别合成出二个片段，电泳回收后，混合回收的二片段，再以P1、P5 二引物进行 重叠PCR，获得含有BglII、PStI、NheI、KpnI和BglII酶切位点的整个启动子信号肽功能片 段。完成重叠PCR后用纯化kit纯化PCR扩增产物。纯化的启动子信号肽功能片段，在PCR仪上16°C与pMD 18-T连接过夜，CaCl2法转 化感受态大肠杆菌DE3，待转化液被固体培养基吸收后于37°C培养箱倒置培养过夜，Amp+ 平皿上长出的转化子转接保存，并送测序列。测定结果与设计预期相同。结果如下(SEQID NO 2)。
分泌型启动子信号肽功能片段测序序列AGCCGGCATGGCCTGCAGCCGGAACTCTTGAATGTTTAGTTTTGAAAATTCCAAAAAAAAACCTACTTT CTTAATATTGATTCATATTATTTTAACACAATCAGTTAGAATTTCAAAAATCTTAAAGTCAATTTTTGAGTGTGTTT GTATATTTCATCAAAATCAATCAATATTATTTTACTTTCTTCATCGTTAAAAAATGTAATATTTATAAAAATATGCT ATTCTCATAAATGTAATAATAAATTAGGAGGTATTAAGGTTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTT AGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGCGGTA CCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAA AATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGAAGCTTGCCGGCATGGCG,下划线斜体字母依次分别为BglII、PStI、NheI、KpnI和BglII ；其他下划线依次分 别为-35区AGAATTT、-10区TCAATTTTTG、核糖体结合位点AGGAGGT、起始密码子TTG、3Gly、 6His、终止密码子TGA。BglII单酶切含启动子信号肽功能片段的pMD 18-T和含杀菌肽的pET_28a，37°C 酶切3h，1 %琼脂糖电泳，并对BglII单酶切的pET-28a用碱性磷酸酯酶脱磷防止自身环 化(脱磷缓冲溶液5uL，碱性磷酸酯酶2. 5uL, BglII酶切回收的pET 28a片段5uL，补水到 50uL)65°C作用30min，补水到lOOuL，分别用苯酚/氯仿/异戊醇与氯仿/异戊醇处理各一 次，水相加2. 5倍-20°C无水乙醇，沉淀DNA，并高速离心回收pET_28a。然后和用纯化kit 纯化的启动子信号肽功能片段适量混合，用T4连接酶连接。连接体系10uL，启动子信号肽 功能片段5uL，含溶菌酶的pET-28a载体2uL，连接缓冲液luL，T4连接酶0. 2uL，水1. 8uL。 PCR仪16°C连接过夜。CaCl2法转化感受态大肠杆菌DE3，待转化液被固体培养基吸收后于 37 0C培养箱倒置培养过夜，Kan+平皿上长出的转化子转接保存。同时扩大培养，用小提质粒 kit提取质粒，进行酶切方法鉴定插入片段方向。用PstI和NdeI双酶切，琼脂糖胶电泳， 与标准分子量比对。不管以什么方向插入，结果总有二种可能的酶切组成。一组是1. 9kb和 4. 2kb 二个片段，另一组是2. 4kb和3. 7kb 二组片段。电泳结果显示，二条带分别为1. 9kb 和4.2kb。所以，实际酶切连接后得到如图1所示结果。所克隆的启动子序列AGGAGGT与 mRNA和16S核糖体RNA的连接位点完全互补，启动子的_35区和-10区与枯草杆菌的σ 37 启动子完全同源[Recsei，PNAS，1987，Vol84，ppllll_1127]。因此构建的穿梭质粒适合于在 枯草杆菌中克隆基因表达，也适合于在球形芽孢杆菌中表达。当在大肠杆菌表达时以Kan+ 作为筛选标记，可以通过IPTG和乳糖诱导的高效表达克隆基因；在枯草芽孢杆菌和球形芽 孢杆菌中表达克隆基因表达时，以Em+作为筛选标记，并进行分泌型高效表达克隆基因。以人溶菌酶、人杀菌肽LL-37作为报告基因，克隆后进行不同表达系统的表达比 较。同时对个别氨基酸进行密码子突变，进行二分子LL-37的PCR扩增串连表达，引入溶 (葡球)菌酶切割位点GGG，人源溶菌酶与人源LL-37融合蛋白基因的DNA序列如SEQ ID NO :4所示，人源溶菌酶与人源LL-37融合蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。GCTAGCAAAGTGTTCGAACGTTGCGAACTGGCGCGTACCCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTACCGT GGTATCAGCCTGGCCAACTGGATGTGCCTGGCGAAATGGGAATCTGGCTACAACACCCGCGCCACCAACTATAACGC CGGCGATCGCTCGACCGACTACGGTATTTTTCAGATTAACAGCCGCTATTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCGGGTG CGGTGAACGCGTGTCATCTGTCGTGCTCGGCGCTGCTGCAGGATAACATTGCGGATGCGGTTGCGTGCGCGAAACGT GTGGTTCGCGATCCGCAGGGTATTCGTGCGTGGGTGGCGTGGCGTAACCGCTGCCAGAACCGTGACGTGCGTCAGTA CGTGCAGGGTTGCGGTGTGGGCGGCGGCCTGCTGAACTTCTTTCGCAAGAGCAAGCAGAAGCCGGGCAAGCAGTTCAAACGCCCGGTGCAGCGCCCGAAGAACTTCTTACGCAACCTGCCGCCGCGCACCCAGAGCCAGGGCGGTGGCCTGCTG AACTTCTTTCGCAAGAGCAAGCAGAAGCCGGGCAAGCAGTTCAAACGCCCGGTGCAGCGCCCGAAGAACTTCTTACG CAACCTGCCGCCGCGCACCCAGAGCCAGGGCGGCGGTACC用PstI酶切含启动子信号肽功能片段的pET_28a和pE194，37°C酶切3h，琼脂 糖电泳，分别回收含启动子信号肽功能片段的pET-28a和pE194，用纯化kit纯化，用T4连 接酶连接。连接体系10uL，含启动子信号肽功能片段的pET-28a 4uL，pE194质粒4uL，连接 缓冲液luL，连接酶0. 3uL，水0. 7uL。PCR仪16°C连接过夜。CaCl2法转化感受态大肠杆菌 DE3，待转化液被固体培养基吸收后于37°C培养箱倒置培养过夜，Kan+平皿上长出的转化 子转接保存。由此构建的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒可以作为共用表达载体，在该穿梭质粒 上克隆有启动子、信号肽和终止子序列。该启动子适合于基因在原核生物中的表达。实施 例2穿梭质粒在球形芽孢杆菌中的转化在球形芽孢杆菌中质粒的转化基本采用原生质体方法[Chang S S, Cohen S N. MolGen Genet，1979，168 :111_115]。普通培养基采用VY培养基(2. 5%小牛肉膏粉， 酵母粉)，原生质体转化培养基有DM3、PAB、SMM, SMMP培养基。把枯草芽孢杆菌活化，其单 菌落接入3mL VY液体培养基，37°C振荡培养过夜。转接1 %到新鲜培养液，37°C振荡培养 2. 5h，即菌生长至对数生长中后期。丁二酸钠浓度改为0. 3mol/L，用甘油代替葡萄糖，转化 培养基和试剂中均加牛血清白蛋白，在PEG 6000中同时加入5xl0_5mOl/LCaCl2。原生质制 备中采用溶菌酶作用后在不同时间取样，然后加稀释培养液SMMP稀释离心除去溶菌酶。用 实施例1的保存质粒对TE透析过夜后用于转化。接一环球形芽孢杆菌于5mL的VY培养液，37°C振荡培养过夜。第二天转接2%到 新鲜30mL培养液，37°C振荡培养2. 5h，即菌生长至对数生长中后期。然后离心，用2XSMM ImL悬浮，加等体积新鲜配的溶菌酶，溶菌酶的终浓度为200u/mL，37°C振荡培养20min，这 时菌体基本呈现球状。用IOmL的SMMP溶液稀释，3000rpm/min离心。离心的原生质体加 0. 5mL SMM悬浮，然后加实施例1保存的质粒5ug混勻，立即加1. 5mL PEG6000，滴管吹吸两 次，37°C作用2min，立即加IOmL的SMMP稀释。3000rpm/min离心，用ImL的SMMP悬浮原生 质体，然后30°C慢摇90min，分别吸取0. 15mL涂布于加有终浓度Eml0ug/mL培养基的平皿 上，室温下实验台放置lh。后再倒置于37°C培养箱培养至转化子长出。长出的转化子点种 保存。并进行发酵培养，测定并比较其表达水平和杀菌效率。杀菌效率测定按实施例4进 行。实施例3穿梭质粒在枯草芽孢杆菌中的转化枯草杆菌的转化采用感受态法。在新枯草杆菌生孢子培养基(0. 蛋白胨， 0. 07% 酵母粉，0. 1% KH2PO4,0. 葡萄糖，0.02% MgSO4,0.02% (NH4)2SO4)的平板上挑 单菌落接种在 SPI (1. 4 % K2HPO4,0.6% KH2PO4,0. 028 % MgSO4,0.2% (NH4) SO4,0.1% B 母粉，0.5% 葡萄糖，0.6% Na3Citrate,0.02% casamino acid)培养液中，30 °C 11 Orpm/ min振荡培养过夜，以1/25体积的种量接到新鲜的SPI，37°C 250rpm/min振荡培养4_5h， OD600 ^ 2.0，然后以培养液体积的1/10接种量转接到SPII (即在SPI中加0. 0005mol/L CaCl2,0. 0025mol/L MgCl2)培养液中，37°C 110rpm/min振荡培养 1. 5h，以 5000rpm/min离心 收集菌体，菌体留下1/10体积的上清液进行悬浮，以此菌体进行感受态细胞的质粒转化。
取250uL上述感受态细胞加终浓度为lmmol/L的EDTA，然后在37 °C条件下 110rpm/min振荡培养lOmin，加实施例1中构建的纯化质粒DNA 2ug，继续在37°C摇床上 110rpm/min振荡培养，约Ih左右，再以250rpm/min继续振荡培养30min，然后以每皿IOOuL 体积涂布在含10ug/mL培养基的Em+固体培养基平皿上，室温放置Ih左右，待培养液被吸 收后倒置放于37°C培养箱培养，直至单菌落长出。挑取单菌落点种保存。并进行发酵培养， 检测其生物学活性。实施例4溶菌酶测定溶壁微球菌溶菌试验本发明对于溶菌酶的活性测定采用二种方法。方法一将活化的溶壁微球菌单菌 落接入LB培养液，37°C摇床培养过夜，将固体LB培养基加热熔化，缓慢冷却至50°C左右， 吸0. 2mL培养过夜的溶壁微球菌到此熔化的LB培养基中，轻摇混合均勻，不允许产生气泡， 迅速倒皿，大约20m/皿，放于水平台面上(培养基水平有利于相互比较杀菌斑大小，以减少 误差)，然后在凝固了的培养基上用灭菌的5mm大小不锈钢管打孔，挑出胶块，滴加上述实 施例中不同融合蛋白的溶葡球菌酶酶切液或M柱纯化的酶切过夜的酶切液，并在培养。在 样品孔附近滴加已知浓度的标准溶菌酶溶液。第二天观察杀菌斑，与已知浓度溶菌酶比对 杀菌斑的大小，预估表达的酶活相对大小。方法二 基本上按Sigma公司所附测定方法和 [工具酶的活力测定，P82，上海科学技术出版社，1982]稍作修改的方法进行。配制pH6. 2 的 0. lmol/L 磷酸缓冲液，称取 NaH2P042H20 1. 17 克，Na2HPO412H20 0. 786 克，EDTA 0. 0392 克，溶于煮沸灭菌的去离水中并稀释至IOOmL,较正pH在6. 15 6. 25之间。溶菌酶对特 定溶壁微球菌胞壁有溶解作用，在一定浓度的溶壁微球菌、温度和作用时间条件下，溶壁微 球菌浊度的下降与酶的浓度和活性呈正相关。利用这一原理进行浊度法测定酶活性。称取 溶壁微球菌干菌粉[中国药品生物制品检定所产品]于容量瓶，加PH6. 2的0. lmol/L磷酸 缓冲液，轻摇溶解，置25°C水浴预保温。准确量取25°C水浴预保温底物悬液3mL，置Icm光 径比色皿，测定OD45tlnm吸光度0. 70左右，作空白调零，读数为&。同时精确称取溶菌酶标准 品20mg，用pH6. 2的0. lmol/L磷酸缓冲液溶解，定容至250mL，相当于80ug/mL酶标准液。 精确吸取25°C预保温酶标准液0. ImL(即8. Oug溶菌酶)，加到已校零比色皿，迅速混勻，秒 表计时，至180s时记下此时吸收度为A ；精确吸取预保温磷酸缓冲液(pH6. 2)0. ImL,同上操 作做空白样试验，测得零秒时读数为A0’，180s时读数为A’。每样品做2次重复以减少误 差。用已预热的分光光度计校正450nm处空白比色皿读数为零。通过加样量的加或减调节 浊度法测定酶活性即读数在一个合适范围内。浊毒法测定溶菌酶的活力单位定义为25°C， pH6. 2，波长450nm下，酶作用引起吸光度OD45tlnm每下降0. 001为一个酶活力单位。
(A0-A)-(A0' -A')
权利要求
一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于由一个PstI酶切的大肠杆菌pET 28a质粒和一个PstI酶切的枯草杆菌pE194质粒构成，所述的酶切的大肠杆菌pET 28a质粒上插入有溶菌酶 抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，所述的溶菌酶 抗菌肽功能片段由溶菌酶和抗菌肽基因融合而成。
2.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于所述的 抗菌肽基因的两端设置有NdeI和XhoI酶切位点。
3.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于所述的 溶菌酶_抗菌肽功能片段的两端设置有KpnI和NheI酶切位点。
4.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于所述的 抗菌肽基因为一种、或者任意两种、或者两种以上的杀菌功能肽氨基酸片段的组合，或者任 意一个功能片段的重复串联融合。
5.如权利要求4所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于所述的 抗菌肽基因为牛乳铁蛋白肽基因、或者人源杀菌肽基因、或者人源溶菌酶基因、或者天蚕素 基因、或者蛙皮素基因、或者蜂毒素基因、或者人源抗菌肽LL-37基因。
6.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于所述的 溶菌酶_抗菌肽功能片段中的溶葡球菌酶的酶切识别位点氨基酸序列为GGG。
7.权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征在 于包括一个在NdeI和XhoI位点酶切大肠杆菌pET-28a质粒的步骤，在所述的酶切大肠杆 菌pET-28a质粒NdeI和XhoI酶切位点之间插入至少一个抗菌肽功能片段，还包括一个构 建启动子信号肽片段的步骤，在所述的启动子信号肽片段上依次设置有BglII、PStI、NheI、 KpnI和BglII酶切位点，所述的启动子信号肽片段的序列如SEQID NO 2所示，然后分别用 BglII酶切启动子信号肽片段和大肠杆菌pET-28a质粒，采用连接酶连接，形成一个插入有 启动子信号肽片段的大肠杆菌pET-28a质粒，还包括一个构建溶菌酶_抗菌肽功能片段的 步骤，在溶菌酶_抗菌肽功能片段的两端分别设置有NheI和KpnI酶切位点，然后在插入有 启动子信号肽片段的大肠杆菌pET-28a质粒的NheI和KpnI位点酶切，插入溶菌酶-抗菌肽 功能片段，采用连接酶连接，形成一个插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a 质粒，还包括一个在插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a质粒的PstI位点 酶切的步骤，在PstI位点酶切的枯草杆菌pE194质粒，然后插入有溶菌酶-抗菌肽功能片 段的大肠杆菌pET-28a质粒，构成本发明的双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒。
8.如权利要求7所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征在 于在一个构建启动子信号肽片段的步骤中，PCR扩增启动子信号肽功能片段的引物序列 为Pl :5-AAGATCTCTGCAGCCGGAACTCTTGAATG(Bgl11 和 PstI)，P2 5-AAGATCTGCTTCAACTTTAGGAA(BglII)，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有效的终止子片段，采用人工合成三段DNA片段，通过重叠PCR扩增获得终止子片段，引物序列为P3 5-CATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGC，P4 :5-ACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA,P5 :5~CGCCATGCCGGCAAGCTTCAACTTTAGGAATGAGAAAAAATTTTTATTTGCTCTAA,再通过启动子信号肽片段和终止子片段的重叠PCR，获得完整的启动子信号肽功能片段，正向引物 P7 5-AAAATGAAACACATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCC (Nhe I、KpnI) 反向引物 P8 :5~GGCCGCCGCCGCCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTG (NheI、KpnI) 合成出启动子信号肽功能片段后，以此片段为模板，以引物Pl与引物P8，引物P7与引 物P5，分别合成出二个片段，电泳回收后，混合回收的二片段，再以PI、P5 二引物进行重叠 PCR,获得含有BglII、PstI, NheI, KpnI和Bgl11酶切位点的启动子信号肽功能片段。
9.如权利要求7所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征在 于所述的启动子信号肽功能片段上克隆有启动子序列、信号肽序列、终止子序列、六个组 氨酸，所述的启动子包括-35区、-10区和核糖体结合位点AGGAGGT，所述的信号肽序列为 TTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGT TTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGC，所述的终止子序列为 TGAGCGCGCTTTTTATAAACTTAT ATGATAATTAGAGCAAATAAAAATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGCCGGCATGGCG,所述的启动子信号肽片 段上还克隆有BglII、PstI、NheI、KpnI和Bgl II酶切位点。
10.如权利要求7所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点GGG和6His。
11.如权利要求7所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于在一个构建溶菌酶-抗菌肽功能片段的步骤中，所述的抗菌肽基因为一种、或者任意 两种或者两种以上的杀菌功能肽氨基酸片段的组合，或者任意一个功能片段的重复串联融I=I ο
12.如权利要求11所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于所述的抗菌肽基因为牛乳铁蛋白肽基因、或人源杀菌肽基因、或者人源溶菌酶基因、 或天蚕素基因、或蛙皮素基因、或蜂毒素基因、或其他来源抗菌肽基因。
13.如权利要求11所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于在融合蛋白的抗菌肽之间插入有溶葡球菌酶切割位点。
14.如权利要求7所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于在大肠杆菌pET-28a质粒的NheI和KpnI位点之间插入有溶葡球菌酶切割位点。
15.如权利要求12所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于在牛乳铁蛋白基因C端有溶葡球菌酶的切割识别位点GGG，所述的牛乳铁蛋白基因的 碱基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的牛乳铁蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO :3所示。
16.如权利要求11所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征 在于所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段中的抗菌肽基因中含有二分子串连的人源杀菌肽基 因LL-37，所述的人源杀菌肽基因LL-37，其N端氨基酸改变为Gly，第4、30位氨基酸变为 Asn, H 11、16、36位氨基酸改变为Gin, H 13、20、24、33氨基酸改变为Pro，C端增加Gln和 Gly 二个氨基酸，二分子LL-37之间引入溶葡球菌酶切割位点GGG，所述的人源溶菌酶与二 分子人源LL-37融合蛋白基因的碱基序列为SEQ IDNO :4所示，所述的人源溶菌酶与二分子 人源LL-37融合蛋白基因的氨基酸序如SEQID NO :5所示。
17.权利要求1所述的双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒在制备治疗抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物基因工程领域，提供了一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，由一个酶切的大肠杆菌pET-28a质粒和一个酶切的枯草杆菌pE194质粒构成，所述的酶切的大肠杆菌pET-28a质粒上插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，本发明还提供了一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，该穿梭质粒转入原核生物以融合方式表达毒蛋白、杀菌肽等蛋白对宿主不表现毒杀作用，本发明构建的穿梭质粒可以经IPTG或者乳糖诱导，以提高基因表达水平；也适合于外分泌表达，外分泌表达的目的蛋白处理方便又没有内毒素污染，由于具有双功能启动子，不同基因都可在合适的正确方向插入基因进行表达。
文档编号A61P31/10GK101948865SQ201010255590
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者乐科易, 张培德 申请人:复旦大学