专利名称：一种乙型脑炎疫苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种乙型脑炎疫苗的生产方法，具体涉及一种利用生物反应器生产灭活病毒乙型脑炎疫苗的方法。
背景技术：
传统的灭活病毒疫苗，例如乙型脑炎疫苗的生产工艺多采用转瓶、固定床和多台小型反应器并联工艺来培养细胞和病毒，该工艺存在着生产能力不足、产品质量不稳定等诸多缺陷，限制了病毒疫苗的工业化生产和临床应用。目前，采用生物反应器技术进行细胞和病毒的培养已经成为国际上病毒疫苗研发的热点，法国巴斯德研究所应用500L生物反应器已经成功地工业化生产出Vero细胞狂犬疫苗和小儿麻痹疫苗，取得了显著的经济效益和社会效益。因此，对利用生物反应器生产乙脑疫苗的工艺进行深入的研究，进而实现工业化生产具有广阔的前景和积极的意义。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种利用生物反应器生产灭活病毒乙型脑炎疫苗的方法，该方法的生产能力显著提高且产品质量更加稳定均一。用于实现上述目的的技术方案如下一种乙型脑炎疫苗的生产方法，该生产方法包括以下步骤(1)将Vero种子细胞加入300升生物反应器中，与微载体一起进行灌流培养，其中培养基包含9. 55g/L的M199 (M199干粉培养基组成成分见GIBCO培养基手册)、2. 2g/L的 NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括搅拌速度为35 40转/分，pH为7. 2 7. 4，溶解氧为40 50%饱和度，温度为 36. 5 37. 5°C，培养基的灌流速度为315升/天；(2)灌流培养5 6天后，沉降微载体和细胞，以维持液替换培养基，接种乙型脑炎病毒继续进行灌流培养，其中维持液包含9. 55g/L的M199培养基，2. 2g/L的NaHCO3,1. Og/L 的蔗糖以及0. lg/L的人血白蛋白；培养条件包括搅拌速度为35 40转/分，pH为7. 5 7. 6，溶解氧为40 50%饱和度，温度为33. 5 34. 5°C，维持液的灌流速度为315升/天；(3)收集病毒培养液，过滤、灭活并纯化。在上述生产方法中，优选地，乙型脑炎病毒按照感染复数(MOI)为0. 01接种。在上述生产方法中，Vero种子细胞的制备方法可以包括以下步骤将复苏的Vero 细胞依次在175cm2方瓶、2升转瓶、14升生物反应器以及75升生物反应器中培养。优选地，175cm2方瓶中的培养基为包含10% (体积/体积)的胎牛血清的M199 培养基；培养条件包括温度为37°C，通入5% (体积/体积)的C02。更优选地，175cm2方瓶中的培养方法为将液氮保存的细胞迅速融化后，按lX105/cm2的接种密度转入175cm2方瓶中，滴加培养基并在37°C和5% (体积/体积)的CO2下培养，长至致密单层后消化，再以1 4(体积/体积)的接种比例将经消化得到的细胞悬液加到新的培养基中，在37°C和5% (体积/体积)的CO2下培养3 4天后，再以1 4(体积/体积)接种比例加到新的培养基中，在37°C和5% (体积/体积)的CO2下培养3 4天。优选地，2升转瓶中的培养基包括9. 55g/L的M199培养基、1. 8g/L的NaHC03、1. 5g/ L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括温度为37V，转速为1/8转/分。更优选地，2升转瓶中培养的接种密度为1. 0 2. 0 X 105/cm2， 培养时间为3 4天。优选地，14升和75生物反应器中的培养基包括9. 55g/L的M199培养基、2. 2g/L 的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括搅拌速度为35 40转/分，pH为7. 2 7. 4，溶解氧为40 50%饱和度，温度为36. 5 37. 5°C，培养基的灌流速度为315升/天，并且加入微载体。在上述生产方法中，优选地，过滤包括依次经过孔径为1 μ m和0. 45 μ m的滤膜过滤，再经过截留分子量为300KD的滤膜超滤。在上述生产方法中，优选地，灭活的灭活剂为β-丙内酯。β-丙内酯(BPL)现已广泛地在多种人和动物疫苗的生产中作为灭活剂使用。它能在机体内完全分解为无毒的 β-羟丙酸，这是一种人体内脂肪代谢后的产物，对人体和动物无毒。BPL是一种无毒性的液体，在37°C下2小时后能自行水解为一种无毒的物质，也可以加入亚硫酸钠停止其反应。 BPL对病毒的灭活能力很强，同时还可以保持病毒良好的免疫原性，加上其水解产物丙酮酸对人体无害，故早在1984年就被选作狂犬灭活疫苗的灭活剂投入正式使用。在上述生产方法中，优选地，纯化的方法为分子筛层析和/或离子交换膜层析。在上述生产方法中，微载体的用量为每升培养基5. 0g。本发明的方法中的微载体优选为GE公司的Cytodex 1。目前，Cytodex 1已经广泛用于疫苗生产，如狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等都采用Cytodex 1进行大规模贴壁培养，其安全性已得到充分证明。该微载体使用前经磷酸缓冲溶液浸泡处理，详细使用方法参照微载体Cytodex 1的使用说明。与传统的生产工艺相比，本发明的生产方法因成功采用生物反应器大规模培养 VERO细胞和病毒而具有以下明显优势1、用于生产的细胞密度提高，大大提高了生产能力，实现了大规模、高密度培养。由于生物反应器中的条件完全可控，且采用低剪切力搅拌和无泡通气装置，有利于保证细胞生长和病毒繁殖一直处于最佳环境中。生物反应器培养VERO细胞，使用5g/L 的微载体(密度可以达到4X IO6个/ml)，IOL工作体积的生物反应器中的细胞总数可达到 4X 101(1，相当于400个2L转瓶培养的细胞总数。300L生物反应器中培养的细胞总数相当于300个15L转瓶培养的细胞数量。2、本发明的生产工艺消除了产品批次间差异和培养周期的不稳定性，保证产品质量的稳定均一，也提高了产品质量。转瓶、固定床和多台生物反应器并联生产病毒疫苗的工艺都不可避免的存在批次间差异大，稳定性差的问题，很难保证产品质量的均一性。本发明的研究结果表明，转瓶和生物反应器培养的乙脑P3株在补结抗原和病毒滴度都存在明显的差异，生物反应器培养的病毒滴度和补结抗原明显高于转瓶，转瓶培养的补结抗原仅为生物反应器培养的补结抗原量的1/2。
3、解决了生物反应器放大培养工艺的难题，实现了生物反应器高密度、大规模培养哺乳动物细胞。利用生物反应器高密度、大规模培养哺乳动物细胞历来都是疫苗研究和生产的瓶颈，尤其是转瓶和固定床培养方式无法实现工艺放大，近些年来国内外一直致力于这方面的研究。本发明经过已经从转瓶、14L、75L到300L生物反应器的逐级放大摸索，确定了大型生物反应器培养细胞和繁殖病毒的优化生产条件，真正实现了利用生物反应器高密度、大规模培养哺乳动物细胞。4、连续的灌流培养保证了病毒原液的均一性和稳定性。目前国外多采用分批培养病毒和分批收获的方式，国内多采用转瓶或多台小型生物反应器并联培养病毒，然后合并收获病毒液的方式，这很难解决批次间差异大、产品质量不稳定的问题。本研究采用连续灌流、连续收获的方式，既保证了产品的均一性，收获的病毒原液在4°C下保存又有利于保持抗原的稳定。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1 :300升生物反应器中不同培养时间的病毒滴度曲线；图2 2升转瓶中不同培养时间的病毒滴度曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例11、VERO细胞种子的复苏1. 1VER0细胞株的来源VERO细胞的原始来源为ATCC (编号为F-12313)，经传代扩增建立了主细胞库和工作细胞库，并保存于液氮中。主细胞为129代；工作细胞为133代，冻存密度为4X106/ml。1. 2VERO种子细胞的复苏取液氮罐内保存的工作库细胞一支，39 °C温水迅速融化后，将细胞悬液按约 IX 105/cm2接种密度转入175cm2方瓶中，逐步滴加培养基(含10% (体积/体积)胎牛血清的M199 (M199干粉培养基组成成分见GIBCO培养基手册)至60mL，37°C和5% CO2培养才苜中培养。2、在175cm2方瓶中培养一级种子细胞复苏的细胞培养3 4天生长至致密单层，使用0.25% (g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1 4(体积/体积)的接种比例将细胞悬液转到新培养瓶中，加入适当量的培养基(601111)，371、5(%0)2培养箱中培养3 4天后以1 4(体积/体积)的比例再放大培
养一次。3、在2L转瓶中培养二级种子细胞3. 1培养基M199 培养基 9. 55g/L,NaHCO3 1. 8g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (体积/体积)胎牛血清。3. 2转瓶培养选择2L转瓶和四层转瓶机，保持接种密度为1.0 2.0X105/cm2，加入500 600ml的培养基，设置温度为37°C，转速为1/8转/分钟，培养3 4天。4、在14L生物反应器中培养三级种子细胞4. 1培养基M199 培养基 9. 55g/L,NaHCO3 2. 2g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (体积/体积)胎牛血清。4. 2反应器的选择选择NBS或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为14L，工作体积10L。4. 3微载体选择Cytodex 1 微载体(GE 公司)，用量为 5. Og/L。4. 4上罐接种将转瓶中培养3 4天的VERO细胞经消化后，转移至蓝盖瓶中，吹打分散均勻，一并接入14L生物反应器中，添加培养基至10L。4. 5参数控制搅拌转速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40-50%饱和度；温度 36. 5 37. 5°C。4. 6灌流控制接种12小时后开启灌流，灌流量为每天1. 5工作体积，培养5 6天。5、在75L生物反应器中培养四级种子细胞5. 1 培养基同 4. 1.5. 2反应器选择选择NBS或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为75L，工作体积50L。5. 3微载体使用方法及用量同4. 35. 4转罐接种将14L生物反应器中培养5 6天的细胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，搅拌振荡分散均勻，用胰酶抑制剂(Gibco)终止反应后，通过管道将细胞连同微载体一并转入75L生物反应器，定容至50L。5. 5参数控制搅拌转速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%饱和度；温度 36. 5 37. 5°C。5. 6灌流控制接种12小时后开启灌流，灌流量为每天1. 5工作体积，培养5 6天。6、在300L生物反应器中大规模培养VERO细胞和病毒6. 1培养基和维持液配方培养基同4. 1.维持液:M199培养基 9. 55g/L，NaHCO3 2. 2g/L，蔗糖 1. Og/L，人血白蛋白 0. lg/L。6. 2反应器选择
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选择比欧或Sartorius哺乳动物细胞培养罐，罐体积为300L，工作体积210L。6. 3微载体用量同4. 36. 4 转罐将75L生物反应器中培养5 6天的细胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，搅拌振荡分散均勻，用胰酶抑制剂(Gibco)终止反应后，通过管道将细胞连同微载体一并转入300L生物反应器，定容至210L。6. 5培养参数同4. 5。6. 6灌流控制接种M小时后开启灌流，灌流量为每天1. 5工作体积，培养5 6天。7、接种乙脑P3株病毒培养7.1接毒方法暂停控制参数，沉降微载体和细胞，抽掉上清培养基，更换为维持液，待参数稳定后按照MOI为0.01接种病毒。7. 2参数控制搅拌转速35 40RPM ；pH :7· 5 7. 6 ；DO 40 50 %饱和度；温度33. 5 34. 5"C。7. 3以连续灌流的方式收获病毒培养液接毒12小时后开始灌流，灌流量为每天1. 5工作体积，从接毒48小时起开始收获病毒液，连续收获8天。8、病毒收获液的澄清过滤和超滤浓缩8. 1澄清过滤选择膜面积为1平方米(20英寸)的Iym和0.5 μπι的聚醚砜滤芯串联，先经Iym 滤膜、再经0. 45 μ m滤膜过滤。8. 2超滤浓缩8. 2.1缓冲液选择选择(pH7. 2-8. 0无菌磷酸)缓冲液冲洗平衡好的超滤系统。8. 2. 2设备选择使用Millipore公司的0. 5平方米PELLIC0N 2超滤系统，安装2块PELLIC0N 2 超滤膜包，截留分子量为300KD的滤膜。8. 2. 3操作参数设定进液口压力为10 20psi，回流口压力为5 10psi，2 4小时内完成80 120L病毒收获液的超滤；样品浓缩20 40倍，得到2 6L浓缩液。9、病毒灭活9. 1灭活试剂的准备先将β -丙内酯用注射用水稀释成40倍的母液，经0. 22 μ m膜过滤除菌。9. 2灭活操作将预稀释的β-丙内酯母液加入浓缩液中至终浓度为1/4000，2 8°C下放置灭活，24小时后在37°C下水解2小时。10、分子筛层析
10. 1缓冲液的选择pH 7. 5 8. 5的磷酸缓冲液。10. 2填料选择GE公司的S^hacryl S-300层析填料，装柱高度为20 60cm。10. 3层析操作首先使用2倍柱体积的缓冲液平衡层析柱，流速为20 50cm/h，上样的样品体积为8% 12%柱体积，收获第一峰(波长^Onm的紫外检测器)。11、离子交换膜层析11. 1缓冲液的选择缓冲液A:pH 7. 5 8. 5磷酸缓冲液，缓冲液B :pH 7. 5 8. 0磷酸缓冲液加 500mMol/L 氯化钠。11. 2离子交换膜的选择Sartorius公司的Sartobind Q离子交换层析膜。11. 3层析操作先用10倍体积的缓冲液A平衡层析膜，上样经分子筛层析纯化后的抗原样品，用缓冲液A(体积比100^-0%)和缓冲液B(体积比0^-100%)形成的线性梯度洗脱，收集70mM至250mM之间的洗脱液为纯化后原液。12、铝佐剂原位吸附抗原12. 1 试剂lmol/L NaOH 溶液，lmol/L pH8. 5 的磷酸盐缓冲溶液，0. 2mol/L 的 AlCl3 溶液， lmol/L的NaCl溶液，过滤除菌。12. 2吸附方法将纯化后的抗原过滤除菌后，加入lmol/L pH8. 5磷酸盐缓冲溶液使其磷酸盐浓度为0. 05mol/L,然后搅拌加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液，反应过程中保持体系的pH为7. 0左右，反应体系中的Al (OH)3量为2. 0 2. 5mg/ml时止。12. 3 稀释用lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀释补至接抗原量为1 2 1 4，Al (OH)3 含量为 0. 5 0. 75mg/ml, NaCl 浓度为 0. 14 0. 16mol/L。12. 4加入添加剂1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。12. 5半成品检测无菌试验。实施例21.本发明生产方法制备的产品的批次间稳定性研究对040801、040802和040901三批中试培养原液的检测结果显示，三批样品收获液的病毒滴度、补结抗原、蛋白残留、无菌试验和效力均无显著差异(见表1)。表1三批中试培养收获液的检定结果
权利要求
1.一种乙型脑炎疫苗的生产方法，该生产方法包括以下步骤(1)将Vero种子细胞加入300升生物反应器中，与微载体一起进行灌流培养，其中培养基包含9. 55g/L的M199培养基、2. 2g/L的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括搅拌速度为35 40转/分，pH为 7. 2 7. 4，溶解氧为40 50%饱和度，温度为36. 5 37. 5 °C，培养基的灌流速度为315 升/天；(2)灌流培养5 6天后，沉降微载体和细胞，以维持液替换培养基，接种乙型脑炎病毒继续进行灌流培养，其中维持液包含9. 55g/L的M199培养基，2. 2g/L的NaHCO3,1. Og/L的蔗糖以及0. lg/L的人血白蛋白；培养条件包括搅拌速度为35 40转/分，pH为7. 5 7. 6，溶解氧为40-50%饱和度，温度为33. 5-34. 5°C，维持液的灌流速度为315升/天；(3)收集病毒培养液，过滤、灭活并纯化。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述乙型脑炎病毒按照感染复数为 0.01接种。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述Vero种子细胞的制备方法包括以下步骤将复苏的Vero细胞依次在175cm2方瓶、2升转瓶、14升生物反应器以及75 升生物反应器中培养。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述175cm2方瓶中的培养基为包含 10% (体积/体积)的胎牛血清的M199培养基；培养条件包括温度为37°C，通入5% (体积/体积)的CO2。
5.根据权利要求3或4所述的生产方法，其特征在于，所述175cm2方瓶中的培养方法为将液氮保存的细胞迅速融化后，按IX 105/cm2的接种密度转入175cm2方瓶中，滴加培养基并在37°C和5% (体积/体积)的CO2下培养，长至致密单层后消化，再以1 4(体积/ 体积)的接种比例将经消化得到的细胞悬液加到新的培养基中，在37°C和5% (体积/体积)的CO2下培养3 4天后，再以1 4(体积/体积)接种比例加到新的培养基中，在 37°C和5% (体积/体积)的(X)2下培养3 4天。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述2升转瓶中的培养基包括9. 55g/L的M199培养基、1. 8g/L的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括温度为37°C，转速为1/8转/分。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述2升转瓶中培养的接种密度为1. 0 2. OX 105/cm2，培养时间为3 4天。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述14升和75生物反应器中的培养基包括9. 55g/L的M199培养基、2. 2g/L的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L 的谷氨酰胺以及10% (体积/体积)的胎牛血清；培养条件包括搅拌速度为35 40转 /分，PH为7. 2 7. 4，溶解氧为40 50%饱和度，温度为36. 5 37. 5°C，培养基的灌流速度为315升/天，并且加入微载体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述过滤包括依次经过孔径为1 μ m和0. 45 μ m的滤膜过滤，再经过截留分子量为300KD的滤膜超滤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述灭活的灭活剂为 β-丙内酯。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述纯化的方法为分子筛层析和/或离子交换膜层析。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述微载体的用量为每升培养基5. 0g。
全文摘要
本发明提供一种乙型脑炎疫苗的生产方法，该生产方法包括以下步骤将Vero种子细胞加入300升生物反应器中，与微载体一起进行灌流培养；灌流培养5～6天后，沉降微载体和细胞，以维持液替换培养基，接种乙型脑炎病毒继续进行灌流培养；收集病毒培养液，过滤、灭活并纯化。上述方法使得用于生产的细胞密度提高，大大提高了生产能力，实现大规模、高密度培养；消除了产品批次间差异和培养周期的不稳定性，保证产品的质量稳定均一，提高了产品质量；解决了生物反应器放大培养工艺的难题，实现了生物反应器高密度、大规模培养哺乳动物细胞。
文档编号A61P31/14GK102327609SQ201010264218
公开日2012年1月25日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘丹, 刘钿莲, 艾文 申请人:丽珠集团疫苗工程股份有限公司