专利名称：丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药提取物丁香苷在医学中的新用途，具体地说是涉及 丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用。背景技术：
痛风(gouty)，又称痛风性关节炎(gouty arthritis)，是体内嘌呤代谢紊乱所致 的疾病，表现为血中尿酸过多，易于使尿酸盐(MSU)在关节等组织析出结晶。痛风的急性发 作是由于沉积在关节的MSU引起中性粒细胞局部浸润和炎性反应。西药在痛风急性发作期选用三种药秋水仙碱、非留体抗炎药和肾上腺皮质激素。 秋水仙碱的作用机制是与中性粒细胞的微管蛋白结合，从而妨碍粒细胞的活动，抑制粒细 胞浸润。非留体抗炎药如吲哚美辛，抑制环氧酶(COX)活性而发挥抗炎作用，以及选择性 COX2抑制药。它们虽然消炎止痛作用快，但毒副作用也相当明显，如秋水仙碱的有效剂量与 产生腹泻等胃肠道症状的剂量相近，非留体抗炎药在有活动性消化性溃疡、胃肠道出血情 况下绝对禁用，而保泰松用药短至3周也可致严重的粒细胞减少症或再生障碍性贫血。丁香苷(Syringin)主要来源于木犀科欧丁香Syringa vulgaris L.树皮、五加 科刺五力口 Acanthopanax Senticosus (Puper. et Maxim) Harms 等植物。药理作用研究显 示，丁香苷有降血脂作用(Ho-Shan Niu, Feng-Lin Hsu, I-Min Liuc. Role of sympathetic tone in the loss of syringin-induced plasma glucose lowering action in conscious Wistar rats[J]. Neuroscience Letters,445(2008) 113 ；Juei-Tang Cheng, I-Min Liu, Tzong-Cherng Chi, et al. Plasma Glucose-Lowering Effect of Tramadol in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats [J]. DIABETES，2001，50 (12) :2815.)、对心 肌缺血的保护作用(张迪.《刺五加皂苷单体B对大鼠急性心肌缺血的保护作用》，2006 年东北师范大学硕士学位论文.)、免疫增强作用(张勇.《紫丁香苷的测定及其降血脂 增强免疫力的研究》.2004年吉林大学硕士学位论文.)、抗氧化(Nour-Eddine Es-Safi, Albert Kollmann,Samira Khlifi,et al. Antioxidative effect of compounds isolated from Globularia alypum L. structure-activity relationship[J]. 2007,40 :1246.) > 抗抑郁(Takahiro Nakaz awa, Takaaki Yasuda and Keisuke Ohsawa. Metabolites of orally administered Magnolia officinalis extract in rats and man and its antidepressant-like effects in mice[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2003，55 :1583.)，对人宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肺癌A549细胞、前列腺癌PC-3 细胞及小鼠S180实体瘤有明显的抗肿瘤活性(汪琢，姜守刚，祖元刚，等.刺五加中紫丁香 苷的提取分离及抗肿瘤作用研究，时珍国医国药，2010，21 (3))。目前丁香苷用于制备药物 用途的国家发明专利是在抗疲劳、镇静安神、扩张血管、降低血液粘度、止血、抗忧郁、抗抑 郁方面(苑立超.注射用紫丁香苷、制备方法及应用，CN 101554370.)。
发明内容
本发明是从刺五加等植物中分离出丁香苷成分，用MSU致人血管内皮细胞 (HUVEC)损伤的急性痛风模型评价显示，对MSU致HUVEC损伤具有保护作用，并抑制ICAM-I表达，可用于制备治疗急性痛风炎症药物。本发明的目的在于提供丁香苷在医学中的新用 途，具体的说是涉及丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用。本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的现代医学病理研究表明，痛风性关节炎是MSU引起中性粒细胞局部浸润和炎 性反应，急性痛风产生的本质是中性粒细胞(PMN)-血管内皮细胞(HUVEC)黏连增强 (Terkeltaub R, et al. The murine homolog of the interleukin-8 receptorcxcr-2 is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis. Arthritis Rheum,1998, 41 (5) =900-909.)，HUVEC损伤，其分子生物学基础在于PMN与HUVEC表面黏附分子的相 互作用(FujiwaraY, et al. Interleukin-8 stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF- α ,IL-I β ,IL-8,and IL-I rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis. Lablnvest, 1998, 78 (5) :559_569.)，其中细胞间黏 附分子-I(ICAM-I)与粘附功能关系最密切，是急性痛风炎症的重要指标之一(张春，唐怡， 刘军，等.痛风灵方对尿酸钠致大鼠模型关节软组织ICAM-I表达的影响，重庆医学，2002， 31(12) :1211-1213·)。因此，针对急性痛风MSU致HUVEC损伤，ICAM-I表达增多的病理特征，本发明用 MSU致HUVEC损伤的体外急性痛风模型(杨妍华，尹莲，王明艳，等.尿酸钠诱导HUVEC损伤 的急性痛风模型研究，中华中医药学刊，2010，28 (3) :592-594.)，从刺五加中分离出丁香苷 成分，评价其抗急性痛风炎症活性。1 丁香苷的制备称取刺五加干粉4kg，用60% 90%乙醇回流提取3次，固液比分别为(1 8 1 10 ;1 6 1 8 ;1 5 1 7)，0. 5 1.5h/次，滤液合并，回收乙醇，浓缩液加 5 10倍量水搅拌成混悬液，用等量石油醚萃取3 5次，水层再用醋酸乙酯等体积萃取 3 5次，合并醋酸乙酯层，减压浓缩干燥，得浸膏，取浸膏上硅胶柱分离，依次用氯仿-甲醇 极性递增梯度洗脱，当氯仿_甲醇为100 4时，洗脱得粗结晶，再经甲醇重结晶得该化合 物丁香苷晶体。该化合物丁香苷晶体经TLC薄层鉴别，与丁香苷对照品斑点位置、显色颜色一 致。核磁共振氢谱分析，吸收峰有δ 6. 72 (2Η，S)，6. 44 (1Η，d，15Hz)，6. 35 (1H，d，15Hz)， 4. 10 (2H, m)，4. 80 (1H, d, 8. 9Hz)，3. 77 (6H, s)，3. 03 (1H, m)，3. 13 (1H, m)，3. 18 (1H, m)， 3. 20 (1H, m)，3. 57 (2H，m)；核磁共振碳谱分析，吸收峰有δ 152. 8，134. 0，132. 7，130. 3， 128. 5，104. 5，102. 7,81. 6,77. 3,76. 7,74. 3,70. 1,61. 0,56. 5，与文献基本一致(郑璐，吴 立军，沈燕，等.丁香苷的核磁共振研究[J].波谱学杂志，1999，16 (5) :465.)，确定该化合 物为丁香苷(Syringin)，分子式(C17H24O9)，分子量(372. 37)。2 丁香苷抗急性痛风炎症实验2.1溶液配制5g尿酸加IOOOmL蒸馏水煮沸，加5% NaOH溶液调PH 7. 4，搅拌，冷却析晶制成尿 酸钠结晶(MSU)。将制好的MSU IOmg高压灭菌，加不含血清的DMEM培养液10mL，研磨配成 lmg/mL的DMEM溶液。实验时，此溶液再加DMEM培养液配成不同浓度DMEM的MSU溶液。丁香苷2. 5mg，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，DMSO终浓度< 0. 02%，再加无血清的
4DMEM 培养液，配制成浓度 2. 5 μ g/mL、25 μ g/mL、250 μ g/mL。阳性药吲哚美辛2. Omg，方法同丁香苷，配制浓度20 μ g/mL。2. 2血管内皮细胞的体外培养人脐静脉血管内皮细胞HUVEC株由南京中医药大学基础医学院提供，细胞经支原 体检测，无支原体污染，细胞经0. 25 %胰蛋白酶消化，含10 %小牛血清的DMEM培养液中和， 离心(1000r/minX6min)，去上清液，加含10%小牛血清的DMEM培养液，移入细胞培养瓶 中，放37°C、5% CO2培养箱中传代培养。2. 3对MSU刺激HUVEC活力的影响HUVEC在培养瓶中培养，待生长至70% 80%融合时，以0. 25%胰蛋白酶消化、 离心，10 %小牛血清DMEM培养液洗涤3次，用10 %小牛血清DMEM培养液调成4X 104/mL 细胞悬液，植入96孔板(每孔200 μ L)，培养24小时后轻吸出原培养液，进行以下实验，每 组各8孔，具体分组及加液如下对照组(200 μ LDMEM培养液)、模型组(100 μ g/mLMSU溶 液)、干预 A 组(100 μ g/mL MSU 溶液 +2. 5 μ g/ml 丁香苷)、干预 B 组(100 μ g/mL MSU 溶液 +25 μ g/ml 丁香苷)、干预C组(100 μ g/mL MSU溶液+250 μ g/ml 丁香苷)，加液后继续放 37°C,5% CO2培养箱中培养24小时，收集上清液，剩余的HUVEC用于测定细胞活性，每孔再 加5mg/mLMTT液20 μ L，继续放37 °C、5 % CO2培养箱中培养4小时后，弃MTT液，加入二甲 基亚砜200 μ L溶解，震荡，于酶标仪读取吸光度值，波长490nm。阳性药组加液(100 μ g/mL MSU溶液+20 μ g/mL吲哚美辛)，其它方法同上。数据统计学处理，细胞活力(％ )=实验组吸光度值/对照组吸光度值X 100%， 结果见表1。与对照组对比，模型组细胞活力显著减小(P < 0. OLP < 0. 05)，阳性药吲哚美辛 及丁香苷干预后细胞活力显著提高(P < 0. 01，P < 0. 05)，并强于对照组，其中，丁香苷各 浓度组的细胞活力强于阳性药吲哚美辛。表1 丁香苷对MSU刺激的血管内皮细胞活力的影响(Γ士S)
注
组别药物浓度 (pg/rriL)n/孔吸光度细胞活力 (%)对照组80.44±0.08100模型组80.37±0.02λα84.87阳性药2080.47±0.02**108.18对照组80.310±0.064100.00模型组80.281±0.015α90.742.580.532±0.012**171.88丁香苷2580.634±0.095**204.9825080.549±0.077**177.37与模型组相比，**P < 0. 01 ;与对照组相比汐6 <0.01，勺3 < 0. 05
2. 4对ICAM-I表达影响
将处于对数生长期的HUVEC用0. 25%的胰蛋白酶消化，轻轻吹打，制成细胞悬液， 调整细胞密度为5 X 109/L，接种于细胞培养瓶中。待细胞长满后(约24h)，弃去上清液，分为下列组对照组、模型组(100 μ g/mLMSU溶液)、丁香苷组(100 μ g/mLMSU溶液+25 μ g/mL 丁香苷)，继续培养24小时，PBS收集细胞，离心去上清，加入⑶54单克隆抗体，30min后， PBS洗涤，重悬细胞，应用流式细胞仪检测其阳性细胞百分率(η = 10000)，重复3次，结果 见
图1。 结果显示，空白组HUVEC几乎无ICAM-I表达，模型组ICAM-I的表达最高，与模型 组相比，丁香苷对ICAM-I的表达有较强的抑制作用。
2. 5对MSU刺激HUVEC细胞形态的影响六孔板中各放入一张无菌的盖玻片，将处于对数生长期的HUVEC用0.25%的胰蛋 白酶消化，轻轻吹打，制成细胞悬液，1 X IO5/孔接种于六孔板中，待细胞长满后(约24h)， 弃去上清液，分为3组对照组(200 μ L DMEM培养液)、模型组(100 μ g/mLMSU溶液)、丁香 苷组(100 μ g/mLMSU溶液+25 μ g/mL 丁香苷)，继续培养24小时，分别加10 μ 1 Α0/ΕΒ溶液 (100 μ g/ml AO ； 100 μ g/ml EB)，1分钟后在显微镜下观察，见图2 (A-C)。正常组细胞核完全完整，无皱缩现象；模型组橘色凋亡细胞明显，细胞损伤严重； 丁香苷干预后凋亡细胞明显减少。结果表明，丁香苷可显著保护MSU致HUVEC的损伤，减少 细胞凋亡。有益效果研究结果表明，用MSU致HUVEC损伤的急性痛风模型评价显示，丁香苷可保护MSU 致HUVEC损伤，减少细胞凋亡，提高细胞活性，抑制ICAM-I表达，具有抗急性痛风炎症的活 性，丁香苷可用于制备治疗急性痛风炎症药物。四、图面说明图1 丁香苷对MSU致HUVEC损伤ICAM-I表达的抑制作用图2 丁香苷对MSU诱导的HUVEC细胞核的影响A-对照组、B-模型组、C- 丁香苷组。
五具体实施例方式实施例1 丁香苷制备称取刺五加干粉2kg，70%乙醇回流提取3次，固液比分别为(1 8 ；1 6 ； 1 5)，Ih/次，滤液合并，回收乙醇，浓缩液加8倍量水搅拌成混悬液，用等量石油醚萃取3 次，水层再用醋酸乙酯等体积萃取4次，合并醋酸乙酯层，减压浓缩干燥，得浸膏。取浸膏上 硅胶柱分离，依次用氯仿-甲醇极性递增梯度洗脱，当氯仿-甲醇为100 4时，洗脱得粗 结晶，再经甲醇重结晶得丁香苷晶体。实施例2 丁香苷保护HUVEC活性丁香苷0. 20mg，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，DMSO终浓度< 0. 02%，再加无血清的 DMEM培养液，配制成浓度20 μ g/mL。HUVEC在培养瓶中培养，待生长至70% 80%融合时，以0. 25%胰蛋白酶消化、离 心，10%小牛血清DMEM培养液洗涤3次，用10%小牛血清DMEM培养液调成4X 10VmL细胞 悬液，植入96孔板(每孔200 μ L)，培养24小时后轻吸出原培养液，进行以下实验。每组 各8孔，具体分组及加液如下对照组(200 μ L DMEM培养液)、模型组(100 μ g/mL MSU溶 液)、丁香苷组(100 μ g/mL MSU溶液+20 μ g/ml 丁香苷)，加液后继续放37°C、5% CO2培养
6箱中培养24小时，收集上清液，剩余的内皮细胞用于测定细胞活性，每孔再加5mg/mL MTT 液20 μ L，继续放37°C、5% CO2培养箱中培养4小时后，弃MTT液，加入二甲基亚砜200 μ L 溶解，震荡，于酶标仪读取吸光度值，波长490nm。实施例3 丁香苷抑制ICAM-I表达将处于对数生长期的HUVEC用0. 25%的胰蛋白酶消化，轻轻吹打，制成细胞悬液， 调整细胞密度为5 X 109/L，接种于细胞培养瓶中。待细胞长满后(约24h)，弃去上清液，分 为下列组对照组、模型组(100 μ g/mLMSU溶液)、丁香苷组(100 μ g/mLMSU溶液+20 μ g/mL 丁香苷)，继续培养24小时，PBS收集细胞，离心去上清，加入⑶54单克隆抗体，30min后， PBS洗涤，重悬细胞，应用流式细胞仪检测其阳性细胞百分率(η = 10000)。
权利要求
丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了丁香苷在医学中的新用途，具体地说是丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用。丁香苷从刺五加等植物中提取分离得到，提取方法是将刺五加干粉用乙醇回流提取，回收乙醇，浓缩液加水搅拌成混悬液，用石油醚萃取，水层再用醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯层，减压浓缩的浸膏，上硅胶柱分离，依次用氯仿一甲醇梯度洗脱得粗结晶，再经甲醇重结晶得丁香苷晶体，经实验研究结果表明丁香苷对尿酸盐致人血管内皮细胞损伤的急性痛风模型具有保护作用，并抑制ICAM-1表达，因此，丁香苷可用于制备治疗急性痛风炎症药物。
文档编号A61P19/06GK101953842SQ20101026354
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者尹莲, 杨研华, 王明艳 申请人:南京中医药大学