一种聚酯类纤维载体培养细胞以制备病毒或生产疫苗的方法

专利名称：一种聚酯类纤维载体培养细胞以制备病毒或生产疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术制药领域，具体是一种聚酯类纤维载体培养细胞以制备病毒或生产疫苗的方法。
背景技术：
疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗作为一种特殊的药物，作为免疫学经验理论和生物技术共同发展而产生的生物制品，从防患于未然的角度消除了众多传染病对动物生命的威胁，保证了人体健康，也促进了养殖业的健康发展， 在国计民生的健康发展中起到了巨大的作用。疫苗的发现可谓是人类发展史上一件具有里程碑意义的事件。因为从某种意义上来说人类繁衍生息的历史就是人类不断同疾病和自然灾害斗争的历史，控制传染性疾病最主要的手段就是预防，而接种疫苗被认为是最行之有效的措施。而事实证明也是如此，威胁人类几百年的天花病毒在牛痘疫苗出现后便被彻底消灭了，迎来了人类用疫苗迎战病毒的第一个胜利，也更加坚信疫苗对控制和消灭传染性疾病的作用。疫苗的生产主要是通过病毒在细胞内增殖得到的。病毒是严格的细胞内寄生物， 不能在任何无细胞的培养液内生长。在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离，鉴定病毒或制备一定量的病毒液。随着细胞培养技术的发展首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的增值，鉴定提供了来自不同动物，不同组织的细胞来源。通过不同病毒对不同细胞的敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可由相应的敏感细胞，为病毒的分离，鉴定和增值创造了条件，同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源。目前疫苗的工业化生产主要是通过鸡胚细胞培养的方法。培养方法包括静置培养，转动培养，悬浮培养。随着动物生物疫苗生产工艺的发展，传统的用动物和鸡胚繁殖病毒的方法已经远不能满足大规模工业化生产的要求。常用的单层静置培养和转瓶培养技术由于细胞生长的表面积小，产量低，占用空间大，劳动强度大，不能满足日益增长的对细胞产品的需求。近些年，贴壁细胞的载体培养技术是一种新兴的大规模细胞培养技术，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。通过对细胞没有毒副作用的载体介质，细胞贴附于载体表面或内部，可以大大提高细胞培养面积和效率，比如微载体培养技术，具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势，培养条件(温度、PH值、二氧化碳浓度等)容易控制，并且培养过程系统化、自动化，不易被污染。随着人们对疾病预防需求的加强，对疫苗质量，产量的要求也随之提高，同时企业要适应市场需求，提高利润等原因，促成新的大规模生产疫苗的方法在不断完善，使用载体培养细胞的方法必将被广泛应用，而且也是今后规模化生产的发展趋势。但是，目前市面上的细胞载体(例如Cytodex系列微载体)大多价格昂贵， 不适于工业化大规模培养细胞制备病毒或生产疫苗。
经对现有技术文献的检索发现，Rourou S，Majoul S, Trabelsi K，Kallel H.等人在《Appl Microbial Biotechnol》2009 ;85 (1) :53-63.上发表的"A novel animal-component-free medium for rabies virus production in VERO cells grown on Cytodex 1 microcarriers in a stirred bioreactor"(“一个用于 cytodexl 微载体 VERO细胞搅拌式生物反应器培养生产狂犬病病毒的创新的无动物成分培养基”，《应用微生物生物技术》)中，报道了使用Cytodex 1微载体进行狂犬病病毒的生产。目前常用的商品化微载体有Cytodex系列、Biosilon系列、Solo微载体等，这些微载体对用于细胞培养制备病毒或生产疫苗来说，价格往往过于昂贵，用于大规模生产成本大，不适合进行工业化生产；同时，作为成型商品，这些细胞载体的形状和大小已经固定，不易加以改动，影响了相应工艺的设计、改进和优化。

发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有常见细胞载体的缺陷，实现简便高效廉价的病毒疫苗生产。发明人经过研究开发，提供了利用一种价格低廉、易于切割加工的无纺布 (聚酯类纤维)作为细胞培养载体，在细胞培养系统中培养扩增病毒敏感细胞，并接种增殖目标病毒，实施工业化大规模病毒制备或疫苗生产。本发明使用的细胞贴壁生长载体，是一种无纺布纤维。无纺布(英文名Νοη Woven)又称不织布。是由定向的或随机的纤维而构成，它是一种不需要纺纱织布而形成的织物，只是将纺织短纤维或者长丝进行定向或随机撑列，形成纤网结构，然后采用机械、热粘或化学等方法加固而成。因具有布的外观和某些性能而称其为布。无纺布是新一代环保材料，具有防潮、透气、柔韧、质轻、不助燃、容易分解、无毒无刺激性、色彩丰富、价格低廉、 可循环再用等特点。制作无纺布的纤维材料主要有聚丙烯或者聚酯纤维等。其中，聚酯纤维由有机二元酸和二元醇缩聚而成的聚酯经纺丝所得的合成纤维。它是以精对苯二甲酸 (PTA)或对苯二甲酸二甲酯(DMT)和乙二醇(EG)为原料经酯化或酯交换和缩聚反应而制得的成纤高聚物一聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，经纺丝和后处理制成的纤维。本发明即是使用无纺布为材料制作成的各种形状和大小的细胞载体，进行细胞培养制备病毒或生产疫苗的工艺和方法。本发明包括以下步骤1)将无纺布(聚酯类纤维)材料用物理或者化学方式进行适当处理(包括进行各种表面处理)，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；同时，剪切加工制作成不同形状和大小的、具有一定强度的、用于细胞培养的各种细胞生长载体。2)在细胞培养系统(包括各种细胞培养瓶、袋、生物反应器等)中，以上述无纺布 (聚酯类纤维)的加工品(包括切片、碎片、碎纤维、碎屑、颗粒等)作为载体，用合适的细胞增殖培养液(基)，培养用于制备病毒和生产疫苗的细胞。3)在所属步骤幻中细胞生长到一定量或密度的时候，接种含有病毒毒种的维持培养液(基)，使病毒感染细胞并增殖。4)接毒一定时间后，收获所属步骤幻得到的细胞培养病毒液；5)对收获的病毒液根据所需制备疫苗类型进行进行病毒灭活或实施活疫苗处理。6)浓缩，纯化病毒液体。根据需要，采取裂解处理。\7)添加稳定剂和免疫佐剂。8)疫苗的冻存和分包装。9)疫苗的质量检查。本发明以无纺布为材料制作成细胞培养载体，进行细胞培养制备病毒或生产疫苗，具有以下优点1、拥有较高的细胞培养比表面积，从而可以增加细胞培养体系内细胞总量。细胞量增加，病毒产量亦可提高。例如，应用于细胞培养滚瓶内部，通过增大单个滚瓶的细胞培养面积，减少滚瓶数量，从而降低劳动强度，并减小细胞感染机率。2、细胞所承受的剪切力较小，并可保证较高的营养利用率和氧传递率。例如在应用于固定床技术培养细胞工艺中，细胞可以牢固贴附于无纺布材料表面和内部，培养液可以通过在载体间流动，提高营养成分的利用率；同时，细胞嵌于载体内部纤维中，降低了外部剪切力对细胞的损伤，从而可以通过加大搅拌速率或流体流经速率而提高氧传递效率。3、降低成本无纺布纤维用作载体，与传统常见的商品化细胞载体相比，价格低廉，从而可以降低细胞培养成本，更适合于病毒疫苗的产业化大规模生产。4、价格低廉，可以一次性使用，减少了生产批次间的交叉污染。5、无纺布材料易于被切割成各种形状和大小，比如圆形、三角形、四方形、菱形等等，大大增加了使用的范围，提高了工艺优化的空间。


图1、为本发明细胞载体的一种形状一圆片形；图2、为本发明细胞载体的一种形状一长片形；图3、为本发明细胞载体的一种形状一折叠菱形；图4、为本发明细胞载体的一种形状一碎屑碎纤维形；
具体实施例方式具体实施例1本实施例子中采用连续灌注固定床培养的方法，在生物反应器中培养扩增VERO 细胞，然后接种、制备狂犬病毒，生产狂犬病毒疫苗。将无纺布制作成直径为6mm的圆形小片体，作为细胞生长载体。1、采用美国 BBA Fiberweb 的 Reemay 公司(Old Hickory, TN, USA)生产的无纺布聚酯类纤维(Non Woven Polyester Fabric), style no. 2214作为无纺布纤维材料，经表面处理并切割成直径为6mm的圆形小片体。2、从种子细胞库中复苏1支VERO细胞(由非洲绿猴肾细胞培育出的可传代的广谱宿主细胞，购买自中国药品生物制品鉴定所)，48小时传代，用方瓶扩增。3、细胞生物反应器选择的是购买自美国NBS公司的5L生物反应器Celligen Plus，工作体积3. 5L，采用固定床篮式搅拌系统。在生物反应器中加入上述处理切割好的直径为6mm的圆形聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，121摄氏度消毒30分钟。消毒后，排空磷酸缓冲液，加入VERO细胞生长培养基，并开始细胞生物反应器条件控制。4、将方瓶扩增好的VERO细胞，作为细胞生物反应器的种子细胞，以2_5X 105/ml的密度接种到生物反应器中的无纺布聚酯纤维圆形小片载体上，用细胞增殖培养液进行扩增培养。其中聚酯纤维圆形小片载体的使用量为每升罐体积35g，所使用的细胞增殖培养液为DMEM-F12培养基加10%新生牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度(pH)值7. 2， 温度37°C，溶氧浓度(DO)空气饱和的50%，搅拌速度120rpm。5、在VERO细胞生长至一定密度时，一般在接种后7_13天，换用细胞维持培养基， 以0. 005-0. 125M0I (用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)感染复数接种狂犬病毒7aG 株，使细胞感染；细胞所用的细胞维持培养液使用DMEM-F12培养基加上的小牛血清配制而成；设定生物反应器培养的条件为PH值7. 6，温度36°C，溶氧浓度(DO)空气饱和的 50%，搅拌速度为lOOrpm。连续灌注收获20天，病毒滴度保持在81gLD50/ml以上。6、收获的病毒液用1 4000β-丙内酯灭活。7、以s印harose 4 fast flow为填料进行层析纯化，收集抗原峰。8、纯化除菌后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂。9、病毒滴定，效力测定，蛋白含量测定，牛血清蛋白残留量测定，残余DNA测定按照《中国药典》2005版相关要求进行。具体实施例2本实施例子中采用悬浮培养的方法，在生物反应器中培养细胞制备病毒或生产疫苗。将无纺布制作成长条状，作为细胞生长载体。1、无纺布材料采用国内某公司生产的聚酯纤维无纺布，将材料经过适当剪切，成为形状不规则的碎纤维片，作为细胞培养用载体。2、生物反应器选择的是荷兰Applicon autoclavable bioreactor 15L反应器，工作体积11L。将长条状无纺布纤维细胞载体用PBS冲洗，膨胀过夜，漂洗几次后加入生物反应器，高压灭菌。加入无菌细胞生长液，浸泡载体。3、从种子细胞库中复苏1支VERO细胞(由非洲绿猴肾细胞培育出的可传代的广谱宿主细胞，购买自中国药品生物制品鉴定所)，48小时传代，用方瓶扩增。4、将方瓶扩增扩增好的VERO细胞，以3_6X 105/ml的密度接种到装有长条状聚酯类纤维切片为载体的生物反应器罐中，用细胞增殖培养液进行扩增培养，其中无纺布聚酯类纤维载体的使用量为每升罐体积45g，所使用的细胞增殖培养液使用DMEM-F12培养基加 10%新生牛血清。细胞增殖培养条件为Ph值7. 0-7. 2，温度37°C，溶氧浓度(DO)空气饱和的50%，搅拌速度15-35rpm。5、培养约4天，通过生物反应器的细胞/载体截流装置，抽弃细胞生长液，换用细胞维持培养基，以0. 005-0. 125M0I (用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)感染复数接种乙脑病毒株，继续培养，接毒后3-5日收获细胞培养毒液，收获的毒液置于_70°C保存。6、将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素， 充分摇勻，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。具体实施例3本实施例子中采用悬浮培养的方法，在生物反应器中培养棉铃虫卵巢细胞系 SFE-HA制备棉铃虫单粒包埋型核多角体(HaSNPV)病毒，以生产病毒农药。将无纺布制作成不规则碎纤维，作为细胞生长载体。1)纺布材料采用国产的聚酯纤维无纺布，将材料经过适当裁剪，成为形状不规则的纤维类碎片，作为细胞培养用载体。2)在15L生物反应器中，将长条状无纺布纤维细胞载体用PBS冲洗，膨胀过夜，漂洗几次后加入生物反应器，高压灭菌。加入无菌细胞生长液，浸泡载体。3)将方瓶扩增扩增好的棉铃虫卵巢细胞，以2-4X 105/ml的密度接种到装有不规则碎片状聚酯类纤维切片为载体的生物反应器罐中，用细胞增殖培养液进行扩增培养，其中无纺布聚酯类纤维载体的使用量为每升罐体积25g，所使用的细胞增殖培养液使用BML-TClO培养基添加20%小牛血清，100U/ml卡那霉素。细胞增殖培养条件为pH值 7. 0-7. 2，温度37°C，溶氧浓度(DO)空气饱和的50%，搅拌速度15_35rpm。4)棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV)，先用人工饲养的棉铃虫4龄幼虫进行增殖，经口感染后6天，收集病虫血淋巴为感染细胞的初始毒源。随后则用被感染细胞的培养上清液作为实验用感染源。5)在经M小时培养的贴壁细胞中加入病毒液，感染复数约为7TCID5(1/细胞。继续培养，收获细胞培养毒液，收获的毒液置于-70°C保存。6)将收获液分装，保存。也就是说，本发明提供了一种无纺布(聚酯类纤维)载体培养细胞以制备病毒或生产疫苗的方法，包括以下步骤1)将无纺布(聚酯类纤维)材料用物理或者化学方式进行适当处理(包括进行各种表面处理)，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；同时，剪切加工制作成不同形状和大小的、具有一定强度的、用于细胞培养的各种细胞生长载体。2)在细胞培养系统(包括各种细胞培养瓶、袋、生物反应器等)中，以上述无纺布 (聚酯)的加工品(包括切片、碎片、碎纤维、碎屑、颗粒等)作为载体，用合适的细胞增殖培养液(基)，培养用于制备病毒和生产疫苗的细胞。3)在所属步骤幻中细胞生长到一定量或密度的时候，接种含有病毒毒种的维持培养液(基)，使病毒感染细胞并增殖。4)接毒一定时间后，收获所属步骤幻得到的细胞培养病毒液；5)对收获的病毒液进行病毒灭活或实施活疫苗处理；如需要，并进行浓缩。6)浓缩，纯化病毒液体。根据需要，采取裂解处理。7)添加稳定剂和免疫佐剂。8)疫苗的冻存和分包装。9)疫苗的质量检查。细胞培养系统包括常见的细胞培养生物反应器，比如搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、细胞悬浮或贴壁式生长生物反应器、间歇式或流加式或连续灌注式生物反应器、wave生物反应器等，以及其他各种形式和基于各种原理的细胞培养系统或装置，包括各种细胞培养瓶、袋系统、一次性塑料袋系统等。细胞培养方式包括常见的贴壁固定床式细胞培养、载体悬浮式细胞培养等，以及该些培养方式的各种衍变形式。所述病毒可以是下列中之一个或多个禽、兽类病毒狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus) > ^: ^ (Canine Distemper Virus)、Λ _/]、__ _ (Canine parvovirus virus) (Infectious canine hepatitis(Mink Parvovirus Enteritis Virus)、禽流感病毒(Avian influenza virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、猪繁殖禾口呼吸系统综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)、猪癌病毒(Classical Swine Fever Virus)、猪细小病毒 (Swine Parvovirus)、猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)、猪传染个生胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of pigs)、猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、猪流行性感冒病毒(Swine influenza virus) ,Parapoxvirus ovis病毒；上述各病毒应包含其各所属所有亚型毒株和各种致弱型毒株。所述病毒可以是下列中之一个或多个人类病毒人用狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus) > ) ^^! (Measles virus)、月g _ _ (Mumps virus)、M # _ _ (Rubella virus)、/K痘病毒(varicella virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、流感病毒(influenza virus)、乙月干病毒(Hepatitis B virus)、流脑病毒(meningitis virus)、 艾滋病病毒(HIV)、口服轮状病毒(oral rotavirus)、染性肝炎病毒Gnfectious canine hepatitis virus)、禽流感病毒(Avian influenza virus)；上述各病毒应包含其各所属所有亚型毒株和各种致弱型毒株。所述疫苗可以是下列中之一个禽、兽用疫苗包括单价和多价疫苗，或具下列中之多个禽、兽用疫苗之效能的多联疫苗，基因工程亚单位疫苗，基因重组疫苗等常见疫苗类型中的一种或多种狂犬病疫苗(Rabies vaccine)、犬瘟热疫苗(Canine Distemper Vaccine)、；^ _/]、___ ^ (Canine parvovirus vaccine) > ^ # ^ HT iit ^ Iej (Infectious canine hepatitis vaccine、水|§肠炎疫苗(Mink Parvovirus Enteritis vaccine)、禽流感疫苗(Avian influenza vaccine)、新城疫疫苗(Newcastle disease virus)、猪繁殖和呼吸系统综合症疫苗(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome vaccine)、猪癌疫苗(Classical Swine Fever vaccine)、猪细小病毒疫苗(swine Parvovirus vaccine)、猪^f f生月复 写疫苗(Porcine epidemic diarrhea vaccine)、猪传染 f生胃肠炎疫苗(Transmissible gastroenteritis vaccine for pigs)、 猪圆环疫苗(Porcine circovirus vaccine)、猪伪犬病疫苗(Pseudorabies vaccine)、 猪流行性感冒疫苗(Swine influenza vaccine)；上述各疫苗可以是活疫苗(Live virus vaccine) Κ灭 舌苗(Inactivated or killed virus vaccine)。所述疫苗可以是下列中之一个人用疫苗包括单价和多价疫苗，或具下列中之多个人用疫苗之效能的多联疫苗，基因工程亚单位疫苗，基因重组疫苗等常见疫苗类型中的一种或多种人用狂犬病疫苗(Rabies Vaccine for human use)、麻疹疫苗 (Measles vaccine)、腿腺炎疫苗(Mumps vaccine)、风疫疫苗(Rubella vaccine)、7_K痘疫苗(varicella vaccine)、脊髓灰质炎疫苗(polio vaccine)、流感疫苗(influenza vaccine)、乙月干疫苗(Hepatitis B vaccine)、流脑疫苗(meningitis vaccine)、艾滋病疫苗(HIV vaccine)、口服轮状疫苗(oral rotal vaccine)、染性肝炎疫苗 Qnfectious canine hepatitis vaccine)、 ^ 胃^ (Avian influenza vaccine) ；^1 ^ bJ 是 舌疫苗(Live virus vaccine)或灭 舌疫苗(Inactivated or killed virus vaccine) 所述病毒可以是下列之一的昆虫病毒，以生产相关类型的病毒杀虫剂生物农药 核型多角体病毒(NPV)，如家蚕NPV、棉铃虫NPV、松毛虫NPV、春尺蠖NPV、舞毒蛾NPV、斜纹夜蛾NPV、粘虫NPV、中国刺蛾NPV ；颗粒体病毒(GV)，如黄地老虎GV、菜粉蝶GV、茶小卷叶蛾GV;细胞质多角体病毒(CPV)、虹彩病毒等等。所述细胞可以是下列中之一个或多个组合BHK21细胞(幼金仓鼠肾细胞/Baby hamster kidney cell)、Marcl45 细胞(克隆恒河猴肾细胞/Maacague kidney cell) ,VERO 细胞(非洲绿猴肾细胞/Kidney cells of Afrcan Green Monkey)、F81细胞(猫肾细胞/ Kidney cells of Cat,Felis catus)、猪肾传代细胞系(PK-15或IBRS-2)或其它敏感猪源细胞系、ST细胞(胎猪睾丸细胞/Testis cells of Swine)、牛睾丸细胞(Testis cells of fetus bovine)、牛羊犬等的肾细胞、鸡胚成纤维细胞、按蚕蛾(anteraea eucalypti)卵巢细胞、白纹伊岐(Aedes albopictus Skuse)细胞Aa2_678、小菜蛾(Plutell xylostella L innaeus)细胞 BCIRL-Px2_HNU3、草地贪叶蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞 Sf21 及其克隆株Sf9和粉纹夜蛾(Trichop lusiani)胚胎细胞系BTI_Tn5-BI-4等昆虫细胞，以及其他种类的适合感染病毒和制备病毒的细胞；上述各种细胞应包含其各所属所有亚型细胞株及其各种驯化、基因工程改造型细胞株。上述所述细胞培养包括动物组织培养。还有，本发明提供一种可用于培养细胞以制备病毒或生产疫苗的无纺布(聚酯类纤维)细胞载体，包括制作该载体的无纺布(聚酯类纤维)纤维类材料包括聚丙烯类、聚酯类、粘胶类、丙烯酸纤维类、聚酰胺类以及其他纤维，即包括聚酯纤维(聚酯类纤维)无纺布、聚丙烯纤维无纺布、粘胶类无纺布、聚酰胺类无纺布等等。聚酯类纤维包括无纺布聚酯纤维、聚酯纤维无纺布、普通聚酯纤维，以及一切以聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)为材料做成的聚酯纤维；该载体的制作过程包括将无纺布(聚酯类纤维)材料用物理或者化学方式进行适当处理(包括进行各种表面处理)，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；该载体可以是按照不同应用情况而将无纺布(聚酯类纤维)通过剪切、加工等手段制作而成的、 具不同形状和不同大小的、具一定强度的、可用于细胞培养的各种细胞生长载体。所述的聚酯纤维类无纺布又可称为无纺布聚酯纤维或者聚酯非织造纤维，英文名称是non woven polyester fabric，主要化学成分是聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)。所述载体由无纺布(聚酯类纤维)材料制作切割的方式和切割成的形状可随具体应用而任意变化；可以但不局限于制作成包括圆形、方形、三角形、碎屑、碎纤维等各种可以设想和制作出来的形状和任意大小。所述载体可以但不局限于是球状、棒状、条状、片状在内的任何规则和不规则载体。以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种聚酯类纤维载体培养细胞以制备病毒或生产疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤1)将聚酯类纤维材料用物理或者化学方式进行包括表面处理在内的处理，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；同时，剪切加工制作成不同形状和大小的、具有一定强度的、用于细胞培养的各种细胞生长载；2)在包括各种细胞培养容器和生物反应器在内的细胞培养系统中，以所述聚酯类纤维材料的加工品作为载体，用合适的细胞增殖培养液/基，培养用于制备病毒和生产疫苗的细胞；3)在所属步骤幻中细胞生长到预先设定的量或密度的时候，接种含有病毒毒种的维持培养液/基，使病毒感染细胞并增殖；4)接毒到预先设定的时间后，收获所属步骤幻得到的细胞培养病毒液；5)对收获的病毒液进行病毒灭活或实施活疫苗处理；如需要，并进行浓缩；6)纯化病毒液体；7)添加稳定剂和免疫佐剂；)疫苗的冻存和分包装。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括裂解处理操作。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括细胞培养方式包括贴壁固定床式细胞培养、载体悬浮式细胞培养，以及该些培养方式的各种衍变形式。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述病毒可以是下列中之一个或多个禽、兽类病毒狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus)、犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus)、Λ_/]、___ (Canine parvovirus virus)、个生月(Infectious canine hepatitis virus、(Mink Parvovirus Enteritis Virus) 感病毒(Avian influenza virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、猪繁殖禾口呼吸系统综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)、猪(Classical Swine Fever Virus)、■_/]、__ (Swine Parvovirus) Λ ^Mt^if ft 腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of pigs)、猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、猪流行性感冒病毒(Swine influenza virus)、Parapoxvirus OVis病毒；上述各病毒应包含其各所属所有亚型毒株和各种致弱型毒株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述病毒可以是下列中之一个或多个人类病毒人用狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎 ^ (Mumps virus)(Rubella virus)(varicella virus)炎病毒(polio virus)、流感病毒(influenza virus)、乙月干病毒(Hepatitis B virus)、流脑病毒(meningitis virus)、艾滋病病毒(HIV)、口服轮状病毒(oral rotavirus)、染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus)、禽感病毒(Avian influenza virus)； 上述各病毒应包含其各所属所有亚型毒株和各种致弱型毒株。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述疫苗可以是下列中之一个禽、 兽用疫苗包括单价和多价疫苗，或具下列中之多个禽、兽用疫苗之效能的多联疫苗，基因工程亚单位疫苗，基因重组疫苗等常见疫苗类型中的一种或多种狂犬病疫苗(Rabiesvaccine) > ^ 1 |ej (Canine Distemper Vaccine)、；^ _/]、___ (Canine parvovirus vaccine)、i 7I专染 f生月干炎苗(Infectious canine hepatitis vaccine、 7-KlnJSi^ialEi (Mink Parvovirus Enteritis vaccine) >(Avian influenza vaccine)、新城疫疫苗(Newcastle disease virus)、猪繁殖和呼吸系统综合症疫苗 (Porcine Reproductive and Res piratory Syndrome vaccine)、猪癌疫苗(Classical Swine Fever vaccine)、猪细小病毒疫苗(Swine Parvovirus vaccine)、猪流行性腹 写疫苗(Porcine epidemic diarrhea vaccine)、猪传染 f生胃肠炎疫苗(Transmissible gastroenteritis vaccine for pigs)、猪圆环疫苗(Porcine circovirus vaccine)、猪伪狂犬病疫苗(Pseudorabies vaccine)、猪流行性感冒疫苗(Swine influenza vaccine)； 上述各疫苗可以是 舌疫苗(Live virus vaccine)或灭 舌疫苗(Inactivated or killed virus vaccine)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述疫苗可以是下列中之一个人用疫苗包括单价和多价疫苗，或具下列中之多个人用疫苗之效能的多联疫苗，基因工程亚单位疫苗，基因重组疫苗等常见疫苗类型中的一种或多种人用狂犬病疫苗(Rabies Vaccine for human use)、麻疫疫苗(Measles vaccine)、腿腺炎疫苗(Mumps vaccine)、风疫疫苗 (Rubella vaccine)、7_K 痘疫苗(varicella vaccine)、脊髓灰质炎疫苗(polio vaccine)、 流感疫苗(influenza vaccine)、乙肝疫苗(Hepatitis B vaccine)、流脑疫苗(meningitis vaccine)、艾滋病疫苗(HIV vaccine)、口服轮状疫苗(oral rotal vaccine)、染性肝炎疫 It (Infectious canine hepatitis vaccine)、 ^ 胃^5 (Avian influenza vaccine)； 上述各疫苗可以是 舌疫苗(Live virus vaccine)或灭 舌疫苗(Inactivated or killed virus vaccine)。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述病毒可以是下列之一的昆虫病毒，以生产相关类型的病毒杀虫剂生物农药核型多角体病毒(NPV)，如家蚕NPV、棉铃虫 NPV、松毛虫NPV、春尺蠖NPV、舞毒蛾NPV、斜纹夜蛾NPV、粘虫NPV、中国刺蛾NPV ；颗粒体病毒(GV)，如黄地老虎GV、菜粉蝶GV、茶小卷叶蛾GV ；细胞质多角体病毒(CPV)、虹彩病毒。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述细胞可以是下列中之一个或多个组合BHK21细胞(幼金仓鼠肾细胞/Baby hamster kidney cell)、Marcl45细胞(克隆恒河猴肾细胞/Maacague kidney cell)、VER0细胞(非洲绿猴肾细胞/Kidney cells of Afrcan Green Monkey)、F81 细胞(猫肾细胞/Kidney cells of Cat, Felis catus)、猪肾传代细胞系(PK-15或IBRS-2)或其它敏感猪源细胞系、ST细胞(胎猪睾丸细胞/Testis cells of Swine)、牛睾丸细胞(Testis cells of fetus bovine)、牛羊犬等的肾细胞、鸡胚成纤维细胞、按蚕蛾(anteraea eucalypti)卵巢细胞、白纹伊蚊(Aedes albopictus Skuse)细胞 Aa2-678、小菜蛾(Plutell xylostella L innaeus)细胞 BCIRL-Px2_HNU3、草地贪叶蛾 (Spodoptera frugiperda)卵巢细胞 Sf21 及其克隆株 Sf9 和粉纹夜蛾(Trichop lusiani) 胚胎细胞系BTI-Tn5-BI-4等昆虫细胞，以及其他种类的适合感染病毒和制备病毒的细胞； 上述各种细胞应包含其各所属所有亚型细胞株及其各种驯化、基因工程改造型细胞株。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述细胞培养包括动物组织培养。
11.一种可用于培养细胞以制备病毒或生产疫苗的聚酯类纤维细胞载体，其特征在于， 包括制作该载体的无纺布纤维类材料包括聚丙烯类、聚酯类、粘胶类、丙烯酸纤维类、聚酰胺类以及其他纤维，聚酯类纤维包括无纺布聚酯纤维、聚酯纤维无纺布、普通聚酯纤维，以及一切以聚对苯二甲酸乙二醇酯为材料做成的聚酯纤维；该载体包括将无纺布材料用物理或者化学方式进行处理，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；该载体是将无纺布通过剪切、加工等手段制作而成的、具不同形状和不同大小的、具一定强度的、可用于细胞培养的各种细胞生长载体。
12.如权利要求11所述的载体，其特征在于，包括所述载体由无纺布(聚酯类纤维) 材料制作切割的方式和切割成的形状可随具体应用而任意变化；可以但不局限于制作成包括圆形、方形、三角形、碎屑、碎纤维等各种可以设想和制作出来的形状和任意大小。所述载体可以但不局限于是球状、棒状、条状、片状在内的任何规则和不规则载体。
全文摘要
本发明涉及一种聚酯类纤维载体培养细胞以制备病毒或生产疫苗的方法。具体包括1)聚酯类纤维细胞培养载体及其加工制作方法；2)在细胞培养系统中，用处理好的聚酯类纤维细胞培养载体，在细胞增殖培养液中培养增殖细胞；3)细胞生长到一定密度或数量后，换用细胞维持培养液，接种病毒感染细胞；4)扩增病毒；5)收获病毒液；6)根据需要的制备类型，灭活或实施活疫苗处理；7)病毒液浓缩、纯化和裂解；8)添加稳定剂和免疫佐剂；9)疫苗包装。本发明使用了一种价格低廉且适合细胞贴壁生长的材料，制作细胞培养载体，进行细胞培养，制备病毒或生产疫苗，大大降低了细胞载体成本。
文档编号A61K39/12GK102406926SQ20101029239
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者冯见, 李敏, 高迪晶, 齐念民 申请人:上海泰因生物技术有限公司