专利名称：Sj16重组蛋白及其在制备血吸虫病疫苗、诊断试剂、治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂，尤其是涉及SJ16蛋白在制备血吸虫病疫苗、诊断试剂、治 疗药物中的应用。
背景技术：
血吸虫病是危害人民身体健康最重要的寄生虫病。医药业界普遍认为研制血吸虫 疫苗可能是控制血吸虫流行最终措施。血吸虫疫苗的研究已有60多年的历史，至今尚未找 到一种真正有价值的疫苗。其原因是多方面的，但人们对血吸虫感染的保护性免疫机制及 血吸虫逃避机体免疫攻击的机制的认识不足可能是一个重要原因。现已有十余个被公认有 前途的日本血吸虫(中国大陆栋)亚单位候选抗原在国内获得了克隆和表达.如，如谷胱 甘肽转移酶、副肌球蛋白、脂肪酸结合蛋白和23ku膜蛋白等，但其中大多数候选疫苗分子 尚未达到所要求的等于或大于40%减虫率的免疫保护力。血吸虫病的早期诊断也是一个尚未解决的难题。感染血吸虫1个月后，感染者的 粪便中才能检测到虫卵，而特异性抗体的出现时间一般在感染后1周左右，且针对抗原的 血清抗体在宿主体内长期存在，不能区分早期和既往感染，没有疗效考核价值。此外，目前 用于检测特异性抗体的诊断抗原主要是成虫抗原和虫卵抗原，但这类抗原成分复杂，也不 易大量获得。一般认为宿主体内(体液中)存在血吸虫抗原，表明有活动性感染的可能，故 检测宿主体内是否存在血吸虫循环抗原，可用于血吸虫病的诊断和疗效。但循环抗原进入 血液系统后，以抗原抗体复合物的形式存在，降低了检测的灵敏度，给诊断带来了困难。特 别是慢性血吸虫病患者感染度普遍偏低，血清和尿液中检测循环抗原的阳性率较低。在慢 性血吸虫病患者血清中，由于CAg不断与血清抗体结合形成血吸虫循环免疫复合物(CIC)， 故CAg含量较少。目前尚缺乏能实际应用的抗原检测试剂。学者们也为解决血吸虫病疗效考核的方法问题作了大量研究。目前国内外在研究 短程抗体的检测方面取得了较大进展，如用抗独特型抗体，重组抗原，或用某些血吸虫抗 原组分对抗体亚类进行检测。但敏感性不及检测总抗体者为高，故对其应用价值还有待于
进一步探索。综上，寻求新的血吸虫病疫苗候选分子和具有早期诊断价值的血吸虫生物标志物 是当前血吸虫病诊断技术实现突破的关键。我们注意到，日本血吸虫(S. japonicunOSjie 是虫体分泌蛋白，其基因序列已被克隆，并建立了重组表达体系。但尚未有人对SJ16进行 在诊断和免疫预防中的价值的研究。
发明内容
本发明对SJ16蛋白在血吸虫病诊断和免疫预防中的价值进行了研究，目的在于 提供一种含有活性成分的SJ16重组蛋白，并提供含有活性成分基因编码所述的融合蛋白 的多核苷酸及该多核苷酸序列相应的核酸构建体系、表达载体和宿主细胞。
进一步的目的在于提供一种日本血吸虫疫苗。再进一步的目的在于，将SJ16蛋白作为诊断抗原，制备克隆抗体，并由此提供一 种日本血吸虫病诊断试剂及其使用方法。更进一步的目的在于，在此研究的基础上提供治疗日本血吸虫病的药物。具体的技术方案为一、关于SJ16重组蛋白及带活性基因编码的多核苷酸首先，我们对SJ16蛋白全长序列(SEQ ID NO 4)进行了分析，发现有2个核定位 序列肽段。分别将这两个核定位序列肽段去除，或同时去除，得到了三个不同的活性成分片 段。SJ16在本发明中的作用，包括SJ16在日本血吸虫在诊断方面的应用；SJ16蛋白的疫苗 活性成分；并发现SJ16蛋白，以及SJ16蛋白的前、中、后三个活性片段并优选其活性片段应 用于诊断和制备血吸虫疫苗。在本发明中，对这三个活性片段分别命名为SJ16-l、SJ16-2、 SJ16-3(对应于 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，基因编码见序列表)。在对全长的SJ16及三个活性片段进行了克隆表达和对小鼠的保护性实验中，证 实了 SJ16蛋白及这些活性片段或它们的任意组合都能引起特异性免疫反应，对实验动物 具有免疫保护作用。并跟据需要针对活性片段进行重组表达，希望得到更优质的活性蛋白。 通过实验证明，在重组蛋白中，与SJ16蛋白或其活性片段具有70%以上的同一性的功能 性变体或这些功能性变体的组合物都具有较好的免疫保护作用，其中更优选的范围是具有 80%以上的同一性的功能性变体或这些功能性变体的组合物。在对上述SJ16蛋白及其活性片段进行重组多肽的研究结果也表明，含SJ16蛋白 活性氨基酸片段的数量为10以上的多肽的免疫保护作用较好。在此研究的过程中，我们还提供了含有SJ16蛋白活性成分基因编码所述的融合 蛋白的多核苷酸及该多核苷酸序列相应的核酸构建体系、表达载体和宿主细胞。二、应用于制备日本血吸虫病疫苗居于上述第一点研究的基础上，我们将上述活性物质应用于制备预防日本血吸虫 的疫苗。该疫苗包含上述所提及的重组蛋白作为活性成分。即该疫苗的蛋白组成多肽序列 包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO :1或SEQID NO :2或SEQ ID NO 3序列 其中的一种或几种。或包含与SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段具有70%以上的同一性的 功能性变体中的一种或几种。三、应用于制备日本血吸虫病诊断试剂在血吸虫感染过程中，由于SJ16蛋白参与了免疫逃避，在患者体内不引起强烈的 免疫应答。SJ16蛋白主要以游离形式存在，因此，我们认为可以通过对SJ16的检测来区分 既往感染或现行感染；并可以达到很高的灵敏度。通过动物感染实验也证实了这一点，感染 1天后，即可检测到血清中SJ16，比检测特异性抗体的时间明显提前，因此认为以SJ16蛋白 作为诊断抗原，其检测特异性抗体的灵敏度明显高于现有的诊断抗原，并具有早期诊断价 值。具体方案为，以SJ16蛋白活性成份作为诊断抗原，通过抗体克隆技术得到对应的 克隆抗体作为诊断试剂，检测到血清中SJ16蛋白。使用方法为将生物样品与克隆抗体接 触，并检测是否产生免疫反应，从而判断是否感染。四、应用于制备日本血吸虫病的治疗药物
在本发明的研究过程中，我们观察到，所涉及的这些活性蛋白及多肽片段有减虫 和减卵的作用；可以用于制备治疗日本血吸虫病的药物。即该药物由SJ16蛋白、其活性片 段或其同一性为70%以上的功能性变体制备。本发明与现有技术相比，有以下优点和创新第一，本发明首次提出将SJ16蛋白应用于血吸虫病诊断，制备诊断试剂。该方法 不但可以区分血吸虫的既往或现行感染，且检测灵敏度高，具有确切的早期诊断价值。第二，本发明首次提出将SJ16应用于血吸虫病的疫苗制备及治疗药物制备。第三，本发明提供的新型免疫抑制剂来源于病原体生物资源，具有极其广阔的市 场空间和较好的社会、经济效益。
具体实施例方式实施例1根据日本血吸虫SJ16基因序列设计引物，经PCRDESIGN软件分析，由上海生工生 物工程公司合成，引物Pl为5，GCCATATGAACATGACTTTAATTAAC，引入NdeI酶切位点；引物P2 为 5，ACTTAATACTTTGTAGAATTCGAACCjIA HindIII 酶切位点。扩增出全长 SJ16 基因。实施例2SJ16全长的表达和鉴定及纯化利用所设计的一对引物(P1、P2)成功扩增。将其克隆到PGEX-4T-1载体上，挑 取筛选到的pGEX-4T-l-Sjl6-l重组质粒的DNA，以其为模板，用Pl、P2引物进行PCR扩增 获取的特异性条带；双酶切验证其大小与预期序列一致；将所筛选的重组质粒送TaKaRa 公司测序，测序结果无误。获得的重组质粒确实为pGEX-4T-l-Sjl6-l重组质粒。将 PGEX-4T-1-SJ16-1重组质粒转化的工程菌经IPTG诱导表达后，15% SDS-PAGE电泳显示在 分子量约46kDa处出现一明显蛋白条带，而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌 在诱导前后均无此条带的出现，表明此蛋白条带可能为目的蛋白条带。菌体裂解上清上亦 有此蛋白条带的出现，显示该蛋白为可溶性表达。将裂解上清经过GST亲和层析柱，经过 thrombin酶酶切以后，可以得到分子量为19kDa左右的单一蛋白。pGEX-4T BL21转化菌经诱导后出现一分子量约为26kDa明显表达带，此为GST蛋 白。pGEX-4T-l转化的BL 21-DE3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约40Da出现一条明显的融 合蛋白表达条带。免疫印迹分析，该蛋白能特异地被抗GST抗体(1 500稀释)识别，于 约40Da位置有一条条带，pGEX24T-l转化菌经诱导于约26kDa处有一条条带为pGEX_4T_l 转化菌经诱导表达GST蛋白能特异地被抗GST抗体识别。ST柱亲和层析纯化。实施例3SJ16-1、SJ16-2、Sj 16-3 的表达和鉴定。根据SJ16-1的蛋白序列直接合成相应的DNA序列，命名为SJ16-1序列。根据 SJ16-2、SJ16-3之间引入柔性臂(-GGAGGA-)，使SJ16-2、SJ16-3融合；再根据其蛋白序列设 计相应的核酸序列。分别将其克隆到PGEX-4T-1载体上，挑取筛选到的pGEX-4T-l-Sjl6-l、 pGEX-4T-l-Sjl6-2、pGEX-4T-l-Sjl6_3重组质粒的DNA,以其为模板，用相应引物进 行PCR扩增获取的特异性条带；双酶切验证其大小与预期序列一致；将所筛选的重组 质粒送TaKaRa公司测序，测序结果无误。获得的重组质粒确实为pGEX_4T_ 1 -Sj 16-1、pGEX-4T-l-Sj 16-2-3 重组质粒。将 pGEX_4T-l-Sjl6-l、pGEX-4T-l_Sj 16-2-3 重组质粒转化 的工程菌经IPTG诱导表达后，15% SDS-PAGE电泳显示其分别在分子量约40kDa、84kDa处 出现一明显蛋白条带，而空质粒转化菌在诱导前后以及重组质粒工程菌在诱导前后均无此 条带的出现，表明此蛋白条带可能为目的蛋白条带。菌体裂解上清上亦有此蛋白条带的出 现，显示该蛋白为可溶性表达。将裂解上清经过GST亲和层析柱，经过thrombin酶酶切以 后，可以得到分子量为14kDa、36kDa左右的单一蛋白pGEX-4T-l转化的BL21-D E3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约40kDa、84kDa出现 一条明显的融合蛋白表达条带。免疫印迹分析，该蛋白能特异地被抗GST抗体(1 500稀 释)识别，于约40kDa、84kDa位置有一条条带，pGEX24T 21转化菌经诱导于约26kDa处有 一条条带为PGEX-4T-1转化菌经诱导表达GST蛋白能特异地被抗GST抗体识别。GST柱亲 和层析纯化。实施例4SJ16单克隆抗体的制备纯化SJ16抗原50 μ g加福氏完全佐剂皮下多点注射纯种BALB/C小鼠免疫3_4次， 末次加强免疫3天后，取脾融合；取108脾淋巴细胞悬液备用。取对数生长骨髓瘤细胞离 心；取得X107细胞备用。选用小鼠腹腔巨噬细胞制备饲养细胞层，调整细胞数至1X105/ ml备用。进行细胞融合。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 10比例混合，用无血清不完全培养 液洗1次；90s内加入37°C预温的Iml 45% PEG(分子量4000)溶液，。37°C水浴作用90s ； 加37度预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml 和6ml ；离心，去上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养 细胞层的96孔板内，每孔加100μ 1。培养板置37°C、5% C02培养箱中培养。用SJ16蛋白进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞。筛选出的阳性细胞株进行 单克隆抗体制备。实施例5制备SJ16单克隆抗体，然后以SJ16单克隆抗体用ELISA方法检测感染血吸虫动 物血清；平行实验对照为M r 31 000/32 000抗原单克隆抗体。以血吸虫尾蚴免疫小鼠， 每组动物各8只，感染45天后杀鼠取的血清，SJ16单克隆抗体ELISA检测，阳性检出率为 92. 1% ；M r 31 000/32 000抗原单克隆抗体检出率52. 3%，无假阳，无交叉。SJ16单克隆抗体检出灵敏度和特异性比M r 31 000/32 000高。两者相比有统计 学意义。实施例6SJ16-1核酸疫苗保护实验构建了 DNA疫苗SJ16-1，并且加不同的佐剂用肌肉注射法分别免疫昆明鼠及 BALB/c小鼠，与对照组相比，裸露DNA诱导小鼠产生了 Sjl6-1特异性抗体，并对日本血吸虫 的攻击感染显示了一定的保护效果。成虫减少率为45.7%，肝卵EPG减少率为40. 1%，肠 卵减少率为37. 4%，肝脏表面结节也明显的减少，统计学分析有显著性意义。实施例7SJ16-1、SJ16-2、Sj 16-3 蛋白疫苗保护实验
重组蛋白Sjl6-1、Sj 16-2, Sjl6_3分别与等量FCA混合，皮下注射免疫BALB/c 小鼠(以FCA作对照)，与PBS注射对照组相比，免疫组减虫率达42.9%，肝卵减少率为 44.9%，肠卵减少率为40.3%。统计学上差异有显著性。上述结果提示Sjl6-1、Sjl6-2、 Sjl6-3蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护力。实施例8:SJ16蛋白功能性变体疫苗保护实验通过序列分析，将SJ16-1定点突变，得到新的功能性变体，其序列MK VTPIIF AVFCVVGGMTLITGTTLEQGPHPSEKDMELVYIDAEYEKE AGLKSICNEIKRSFREDLGM KM LDVAKI L。通过定点技术，得到相应 的核酸序列，并重组克隆到pET-32a载体，构建了重组蛋白SJ16-lt。将重组蛋白Sjl6_lt 与等量FCA混合，皮下注射免疫BALB/c小鼠(以FCA作对照)，与PBS注射对照组相比，免 疫组减虫率达44. 9%，肝卵减少率为50. 2%，肠卵减少率为43. 3%。统计学上差异有显著 性。上述结果提示Sjl6-lt蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护力。
权利要求
一种SJ16重组蛋白，其特征在于该蛋白组成多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列或与上述蛋白具有70％以上同一性的功能性变体中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于所述功能性变体的同一性为80%以上。
3.—种重组多肽，其特征在于该重组多肽包含权利要求1所述的任一蛋白氨基酸片 段的数量为10以上。
4.一种多核苷酸，其特征在于该核苷酸包含权利要求1所述的任何一种蛋白的核酸 序列。
5.一种如权利要求4所述的多核苷酸的载体，其特征在于该载体含有权利要求4所 述的核酸序列。
6.一种抗体，其特征在于该抗体由权利要求1所述的重组蛋白制备。
7.权利要求1所述的重组蛋白在制备血吸虫病诊断试剂中的应用，该诊断试剂包括权 利要求6所述的抗体。
8.权利要求1所述的重组蛋白在制备血吸虫病疫苗中的应用，该疫苗由权利要求1所 述的重组蛋白制备。
9.权利要求1所述的重组蛋白在制备治疗血吸虫病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一系列SJ16重组蛋白及其在制备血吸虫病疫苗、诊断试剂、治疗药物中的应用技术。包括由SJ16蛋白分离得到活性片段SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，通过蛋白重组得到系列同一性70％以上的功能性变体。进一步将上述蛋白应用于制备血吸虫病疫苗、诊断试剂、治疗药物。本发明是首次提出将SJ16蛋白应用于血吸虫病诊断制备诊断试剂，该方法不但可以区分血吸虫的既往或现行感染，且检测灵敏度高，具有确切的早期诊断价值。也是首次提出将SJ16应用于血吸虫病的疫苗和治疗药物的制备。而且，本发明提供的新型免疫抑制剂来源于病原体生物资源，具有极其广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。
文档编号A61K39/00GK101985468SQ20101050178
公开日2011年3月16日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者刘灵辉, 卞国武, 吕志跃, 吴忠道, 孙希, 杨琳琳, 胡少敏, 阮志燕 申请人:中山大学