专利名称：microRNA-139的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种小分子RNA-micr0RNA-139(以下简 称为miR-139)在制备转移性肿瘤的治疗药物和诊断试剂中的用途。
背景技术：
一、microRNAOiiiRNA)在肿瘤细胞恶性表型中的作用及其表达调控机制miRNA作为近年来逐渐被研究者们重视的非编码小核酸，通过结合蛋白编码基因 转录产物3’ UTR的作用方式抑制特定靶分子的翻译，从而在转录后水平抑制了基因表达， 进而影响其下游调控分子发挥正常的生物学功能。与肿瘤相关的miRNA大致可分为两类， 即肿瘤HiiRNA(Oncomir)和肿瘤抑制相关miRNA，其界定标准主要是依靠肿瘤组织中表达的 丰度和生物学功能。前者在肿瘤组织中的表达丰度较正常或癌旁组织为高，实验证明受其 直接调控的靶基因多为抑制肿瘤细胞生存、增殖、运动的分子。例如miRNA-17-92簇被确认 为重要的肿瘤相关miRNA ；转基因动物研究发现miRNA-17-92簇过量表达可导致小鼠体内 淋巴细胞的异常增生，出现恶变倾向，其发生机制可能与直接沉默促凋亡分子Bim和抑癌 基因PTEN密切相关；而miRNA-21被确认为包括神经系统肿瘤、结肠癌、乳腺癌、胃癌等在 内多种肿瘤增殖和转移密切相关的Oncomir，受其直接调节的下游靶点包括PTEN、PDCD4、 Maspin等重要抑癌分子。而肿瘤抑制相关miRNA多数在肿瘤组织中表达缺失或启动子发生 甲基化，不能高水平表达。例如miRNA-34a，作为公认的肿瘤抑制相关miRNA，就存在启动子 高甲基化的现象，导致其下游调控分子Bcl-2等的过量表达，将外源miRNA-34a重新导入肿 瘤细胞可明显抑制肿瘤细胞的体内外增殖能力。第一个被临床证实的肿瘤抑制相关miRNA 是miR-15a-16-l，该分子最早报道是在B细胞淋巴瘤中缺失的一个miRNA，研究者证明其 作用的靶点为抗凋亡分子Bcl-2，外源导入miRNA-15a-16-l可明显逆转慢性淋巴细胞白血 病(CLL)细胞MEG-Ol的恶性表型。而最新研究证明miRNA-15a-16-l的作用靶点远不止 Bcl-2 一个分子，在关于前列腺癌的最新研究中发现该分子可同时抑制Bcl-2、CyClinDl和 Wnt-3a等三个肿瘤相关分子，这更加体现了 miRNA分子在生物特性上的多靶点调节模式。二、HER2介导肿瘤转移的分子机制及其靶向治疗表皮生长因子受体(EGFR)家族也称为HER或ErbB家族，该家族分子成员在细 胞信号转导中发挥重要作用，是细胞生长、分化及存活的重要调节者。HER2/neU是该家族 的第二位成员，人HER2/neU基因定位于17号染色体长臂，表达产物为分子量为185kD的 单链跨膜糖蛋白，即P185，含有1255个氨基酸残基，其细胞内段具有酪氨酸蛋白激酶活 性。HER2/neU通过多种细胞内分子参与信号转导，已知其调控的主要下游信号分子包括 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇_3激酶 (phosphoinositide-3 kinase, PI3K)、C_src、She 及 Grb2 等。HER2 通过同源分子二聚体 化或借助与同一家族的其他成员发生异二聚体化催化其胞内段的酪氨酸残基发生磷酸化 修饰，进而发生构象改变并作用于胞浆中的信号接头蛋白Shc和Grb2，引起Ras-Raf-MAPK 级联途径的活化，增强早期反应基因C-f0S，C-jim和c-myc等的转录活性。另一方面，缺乏
3PI3K结合基序的HER2通过诱导与其结合的异源分子HER3的磷酸化，借助HER3结合PI3K 的生物学特性级联激活PI3K/AKT信号通路。磷酸化并活化的AKT抑制糖原合酶激酶3，使 细胞周期蛋白DKcyclin Dl)水平升高，驱动细胞进入细胞周期。AKT直接或间接作用的靶 分子还包括Forkhead转录因子超家族及Raf。Hung MC研究组发现HER2分子可以转位入核，通过转录调控机制直接激活肿瘤相 关分子C0X-2的表达，从转录调控的角度部分揭示了 HER2阳性肿瘤血管生成的分子机制； HER2通过减缓CXCR4的蛋白质降解促进由其介导的肿瘤细胞转移，然而更为具体的分子机 制尚未阐明。尽管由HER2介导的信号转导通路已经逐渐清晰，但是这些已有的研究结果并 不能完全解释HER2分子活化后所产生的各种生物学效应。例如有研究表明，HER2高表达 与肿瘤组织中多种抑癌基因的启动子甲基化修饰密切相关，提示基因表观遗传学修饰可能 是HER2信号对下游分子发挥调控作用的重要模式。最新研究结果显示，乳腺癌细胞HER2信号上调会引起miRNA-21的表达增高，该 miRNA通过靶向抑制抑癌分子PDCD4的表达发挥促进乳腺癌细胞转移的功能，而其自身表 达的升高与HER2分子活化的ERK激酶信号通路密切相关。但是该研究依旧未能揭示HER2 通过miRNA调控下游效应分子表达的完整信号通路。HER2信号调控的miRNA分子存在两类， 包括表达上调的miRNA分子，如miRNA-21，和表达下调的miRNA分子，因此仅从单个miRNA 入手尚不足以解释与HER2信号介导肿瘤细胞转移相关的miRNA分子的全部生物学效应。由于HER2在介导肿瘤增殖和转移中的重要作用，以HER2为靶点的肿瘤治疗策略 和药物倍受关注，其中应用最为成功的是HER2单克隆抗体赫赛汀(Here印tin)，自1998年 获美国FDA批准上市以来，已经广泛应用于乳腺癌等HER2阳性肿瘤的治疗，效果良好。研 究表明，赫赛汀单用治疗乳腺癌的有效率为12-34%，同时许多化疗药物(如顺钼、卡钼、紫 杉醇等)与赫赛汀(Herceptin)之间存在着增强和/或协同的治疗作用。赫赛汀的作用机 理可能包括1)下调HER2表达；2)抑制HER2与人表皮生长因子家族其它成员的二聚化和 下游信号传递；3)抑制HER2下游PI3K和MAPK信号传递，从而抑制肿瘤血管形成；4)诱导 抑癌蛋白P27表达和细胞周期发生Gl期阻滞；5)诱导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，但具 体的分子机制尚不明确。临床研究中发现，接受赫赛汀治疗的部分患者出现明显的心脏毒 性，同时大部分治疗有效的患者在一年内产生耐药，这些都限制了它的进一步推广和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-139在制备转移性肿瘤的治疗药物和诊断试剂中的用途。本发明为了实现上述目的，分析了 miR-139与人表皮生长因子家族受体 HER2(neu/erbB2)阳性肿瘤发生和转移的关系，在体外培养细胞、荷瘤动物和临床肿瘤标本 中发现miR-139的低表达或不表达与HER2阳性肿瘤的发生和转移能力密切相关。在以上工作基础上，本发明深入探讨了 miR-139表达不足促进肿瘤发生、转移的 分子机制，发现miR-139可以通过抑制其靶基因-趋化因子受体CXCR4的表达，抑制肿瘤细 胞侵袭；HER2和⑶44相互作用，通过表观遗传学修饰抑制miR-139的表达，从而解除其对 CXCR4的抑制作用，因此恢复miR-139的表达可以拮抗上游HER2信号，阻断肿瘤细胞的侵袭 和转移(图3e)。
基于以上研究结果，本发明提出了 miR-139在制备转移性肿瘤的治疗药物和诊断 试剂中的用途。通过检测细胞中miR-139的表达下调，并结合HER2和CXCR4的表达水平， 对肿瘤进行早期诊断，对肿瘤的转移能力和预后进行评价；通过表达miR-139或其类似物， 或通过干涉miR-139上游信号促进miR-139的表达，从而抑制肿瘤的侵袭和转移。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明首次阐明了小分子RNA-miR-139在肿瘤转移中的抑制作用。目前HER2信 号与肿瘤转移的密切关系已成共识，但其具体分子机制尚不清楚。本发明证实HER2与CD44 相互作用，通过诱导miR-139基因启动子区组蛋白去乙酰化而抑制miR-139的表达，从而解 除了其对靶基因CXCR4表达的抑制作用，促进肿瘤转移，由此形成了一个完整的HER2信号 通路。而恢复miR-139的表达，可以有效地抑制HER2阳性肿瘤细胞的迁移和侵袭。2、本发明提出了 miR-139的多种应用途径。除了应用于肿瘤诊断和转移能力评价 外，围绕受HER2信号调控的miR-139可以设计肿瘤干预策略，如通过直接表达miR-139拮 抗HER2信号，以及通过同时沉默HER2和⑶44的表达，从而更有效地封闭介导肿瘤细胞迁 移和侵袭的信号通路等。因此，与现有的以HER2为单一靶点的抗肿瘤药物(如Here印tin) 相比具有明显优势，并有望克服由于HER2本身或下游信号分子突变或表达水平改变导致 的耐药。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。图1为HER2和CD44通过抑制miR-139表达上调CXCR4实验结果示意图。(a)为miR-139和miR_146a均以CXCR4的mRNA为靶点的结合序列对照图。(b)为荧光素酶报告基因系统检测miR-139对CXCR4的转录后抑制作用实验 结果示意图。其中Relative luciferase activity (fold)为相对荧光素酶活性(倍 数)，control指pGL3_CMV荧光素酶对照载体，CXCR4指克隆了 miR-139的3’非翻译区 的pGL3-CMV荧光素酶对照载体，左图和中图为将它们分别与miR-139或对照miRNA(图中 的mock)共转染细胞后相对荧光素酶活性检测结果，右图为将它们分别与miR-139、对照 miRNA(mock)和/或miR-139的反义寡核苷酸(Antisense oligo)或对照寡核苷酸(mock oligo)共转染SGC-7901细胞后相对荧光素酶活性检测结果。(*P < 0. 001，η = 5)(c)为RT-PCR和Western blot检测稳定转染的胃癌细胞中HER2的表达实验 结果示意图。通过设计合成发夹状小干扰RNA(SiRNA)的编码序列并克隆入pSuperior. puro载体，获得表达载体pshl和psh2，它们所针对的HER2mRNA的靶序列分别为 tgatagacaccaaccgctc 和 tgaaacctgacctctccta。 转染SGC-7901 (简写为SGC或S)和 MKN-45(简写为MKN或M)细胞后进行稳定筛选。ctrl#l为稳定转染靶向绿色荧光蛋白 (GFP)的siRNA表达载体的对照细胞，ctrl#2为稳定转染空载体的对照细胞，ctrl#3为未 转染细胞。pool为筛选获得的混合克隆，#1_#3为单克隆。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 和tubulin分别作为RT-PCR和Western blot检测的内参照。以上克隆中SGC/pshl#3(简写为S-3)和MKN/pshl#2 (简写为M_2)克隆HER2表 达抑制最彻底，因此作为后续研究主要使用的细胞，同时SGC/ctrl#l (简写为S-ctrll)和MKN/ctrl#l (简写为M-ctrll)作为上述细胞的对照用于后续研究。(d)中左图为HER2表达抑制的细胞(S_3和M_2)和对照细胞(S_ctrl 1和 M-ctrll)中miR-139及其加工前体pre-miR-139表达的Northern blot检测结果示意图。 U6 RNA作为检测的内参照。右图为不同侵袭能力的胃癌和正常胃粘膜细胞中miR-139表达的Northern blot 检测结果示意图。其中SGC和MKN分别为高侵袭能力的胃癌SGC-7901和MKN-45细胞，AGS 为低侵袭能力的胃癌细胞系，GES为永生化的正常胃粘膜细胞系GES-1。(e)和(f)为RT-PCR(上图)和Western blot (下图)检测反义核酸抑制miR-139 表达(e)或异位表达miR-139 (f)后对CXCR4表达的影响实验结果示意图。其中HER2或 ⑶44分别指通过转染相应表达载体在细胞中表达HER2或⑶44。GAPDH作为检测的内参照。(g)为Northern blot检测HER2和/或CD44表达沉默后对miR-139表达的影响 实验结果示意图。siRNA-⑶44为通过载体在细胞中表达针对⑶44的siRNA以抑制其表达。 U6 RNA作为内参照。(h)为Northern blot检测HER2和/或CD44异位表达后miR-139的表达情况实 验结果示意图。U6RNA作为内参照。图2为HER2和⑶44通过促进miR-139基因启动子区组蛋白去乙酰化抑制其表达
实验结果示意图。(a)为应用克隆了 miR-139启动子区域(-1500 +200bp)的荧光素酶报告基因载 体，在MKN-45细胞中检测HER2和⑶44表达沉默对miR-139转录活性的影响实验结果示意 图。siRNA-HER2和siRNA-⑶44分别为通过载体表达针对HER2和⑶44的siRNA以抑制其 表达，而control为相应空载体转染细胞。数据表述为三次独立实验的均值士标准差。(b)为3mM组蛋白去乙酰化酶抑制剂PBA和5 μ M DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR 处理不同时间后，Northern blot检测细胞中miR-139的表达⑴6作为内参照)，以及 Western blot检测CXCR4的表达情况(Tubulin作为内参照)实验结果示意图。(c)为定量RT-PCR检测未处理细胞(NC)、5 μ M 5-Aza-CdR(Aza)和200 μ M组蛋白 去乙酰化酶抑制剂TSA处理24小时后细胞中miR-139和另一个已知以CXCR4为靶基因的 miRNA-miR-146a的表达情况实验结果示意图。Induction fold为诱导倍数。*，与NC组比 较 P < 0. 05。(d)为3mM PBA处理不同时间后细胞的Western blot检测结果示意图，(d)指天数。(e)为染色质免疫沉淀检测miR-139启动子区组蛋白H3K9的乙酰化水平实验结果 示意图。Acetylated H3指应用乙酰化组蛋白H3的抗体进行免疫沉淀，然后对沉淀获得的 染色体DNA序列进行PCR分析，特异地扩增miR-139启动子区域片段获得的结果。NAC表示 非特异性抗体对照，untreated为未处理组，DKD表示CD44和HER2共沉默细胞。(f)为染色质免疫沉淀检测转移相关蛋白复合物MTAl和组蛋白去乙酰化酶 2 (HDAC2)与miR-139启动子区的结合实验结果示意图。分别用MTAl和HDAC2抗体进行免 疫沉淀，然后对沉淀获得的染色体DNA序列进行PCR分析，特异地扩增miR-139启动子区域 片段。No antibody为未加抗体的对照组。(g)为 Northern blot 和 Western blot 检测 HER2 和 / 或 CD44 表达沉默后 MKN-45细胞中miR-139和MTAl的表达情况实验结果示意图。U6 RNA和tubulin蛋白作为检测的 内参照。MTAl和si-MTAl分别指通过载体在细胞中表达MTAl和抑制MTAl的siRNA。(h)左图为转染和/或5 μ M酪氨酸激酶抑制剂gefitinib处理后GES-1细胞的 Western blot检测结果示意图，P-HER2即磷酸化的HER2，Δ为⑶44的显性负突变体。右 图为Western blot检测50ng/ml HER2信号途径的激活剂Heregulin(HRG)处理不同时间 后MKN-45细胞中MTAl的表达情况实验结果示意图。(i)为 MKN-45 细胞 50ng/ml HRG 处理和 / 或 MTAl 表达沉默后，Northernblot 检 测miR-139和Western blot检测CXCR4、MTAl的表达情况实验结果示意图。(j)左图为3mM PBA处理和/或MTAl表达沉默后细胞的Northern blot检测结 果示意图。右图为50ng/ml HRG和/或3mM PBA处理MKN-45细胞后，Northern blot检测 miR-139和Western blot检测CXCR4、MTA1的表达情况实验结果示意图。图3为HER2和⑶44基因共沉默对体内肿瘤生长的抑制作用，以及HER2、⑶44和 CXCR4在临床胃癌样本中表达的相关性实验结果示意图。(a-c)通过BALB/c裸鼠右后肢皮下注射对照或稳定表达HER2和/或⑶44siRNA 的SGC-7901和MKN-45细胞，建立裸鼠移植瘤模型，连续测量肿瘤体积(tumor volume, a)， 数据表述为三次独立测定的均值士标准差，与对照组比较P < 0. 01 ；待瘤体达500m3时剥 瘤称重，计算其与体重的比值(tumorweight/mouse weight, b)，与对照组比较P < 0. 01 ； Northern blot检测肿瘤组织中miR-139表达(U6为内参照)，Western blot检测HER2、 ⑶44和CXCR4的表达情况(β -actin为内参照)(c)实验结果示意图。(d)为免疫组化检测临床胃癌组织中HER2、⑶44和CXCR4表达的相关性实验结果 示意图。Specimenl为转移性胃癌，Specimen2淋巴结转移灶，Specimen3为非转移性胃癌。(e)为HER2与⑶44相互作用通过表观遗传学机制抑制miR-139表达，从而促进 CXCR4表达的总示意图。图4为miR-139基因的表观遗传学修饰和表达抑制是HER2阳性肿瘤的普遍机制 实验结果示意图。通过定量RT-PCR检测5 μ M 5-Aza-CdR和200 μ M TSA处理24小时后不同细胞系 中miR-139表达情况实验结果示意图。Induction fold，诱导倍数。其中H印G2是肝癌细胞 系，SK-BR-3、MDA-MB-231和MCF-7为乳腺癌细胞系，A549为非小细胞肺癌细胞系，SK0V-3 是卵巢癌细胞系，ECC-I是子宫内膜癌细胞系。*，与未处理细胞(NC)比较P<0.05。
具体实施例方式1.肿瘤细胞中miR-139被HER2抑制后CXCR4表达发生上调。肿瘤细胞表面表达的表皮生长因子家族受体分子HER2与肿瘤的转移密切相关， 而趋化因子受体CXCR4则是公认的介导肿瘤细胞迁移和侵袭的重要分子。HER2信号是否 通过包括miRNA在内的机制上调CXCR4的表达还不清楚。我们以转移性HER2阳性胃癌 SGC-7901细胞系为研究对象，抑制HER2表达后，应用miRNA芯片技术，筛选获得了多个表达 上调的miRNA。除了已经报道的能够抑制CXCR4表达的miR-146a外，我们应用miRNA Viewer 生物信息学软件，预测人 miR-139 (Gene ID 406931 ；MI0000261, microrna. sanger. ac. uk) 也可能作为CXCR4的调控miRNA(如图Ia所示)。为了验证miR-139对CXCR4的调控作用，
7我们构建了 CXCR43’非翻译区的荧光素酶报告基因载体，并转染进入SGC-7901和MKN-45 细胞，通过检测细胞中的相对荧光素酶活性，我们发现miR-139可以明显降低带有CXCR4的 3’非翻译区的mRNA的稳定性(如图Ib左、中所示)，进一步导入针对miR-139的反义核酸， 则能够逆转上述效应(如图Ib右所示)，从而证实了 miR-139对CXCR4在转录后或翻译水 平的抑制作用。同时，HER2信号对miR-139的调控作用也得到证实。如图Ic所示，通过RNA干 扰技术抑制胃癌SGC7901和MKN-45细胞中HER2的表达，分别筛选获得稳定单克隆。通过 设计合成发夹状小干扰RNA(SiRNA)的编码序列并克隆入pSuperior. puro载体，获得表 达载体pshl和psh2，它们所针对的HER2mRNA的靶序列分别为tgatagacaccaaccgctc和 tgaaacctgacctctccta。转染 SGC-7901 (简写为 SGC 或 S)和 MKN-45 (简写为 MKN 或 M)细 胞后进行稳定筛选。Northern blot检测显示，与对照组相比，miR-139的表达显著上调，表 明肿瘤细胞中HER2信号对miR-139的表达发挥重要的抑制作用(如图Id左所示)。同时， HER2中度表达的、低侵袭能力的胃癌AGS细胞系，和HER2阴性的正常胃粘膜细胞系GES-I 中miR-139的表达水平明显高于高侵袭能力的SGC7901和MKN-45细胞(如图Id右所示)， 表明HER2通过抑制miR-139的表达促进肿瘤细胞迁移和侵袭。为了进一步阐明HER2、miR-139和CXCR4之间的调控关系，我们在HER2表达沉 默的SGC-7901和MKN-45细胞中直接导入miR-139的反义核酸，发现阻断miR-139的表达 后CXCR4的表达水平显著上调(如图Ie所示)；相反，在高表达HER2的细胞中转染合成的 miR-139，又能够抑制CXCR4的表达(如图If所示)。以上结果表明，在胃癌等转移性肿瘤 细胞中，HER2信号通过抑制miR-139的表达，解除后者对CXCR4表达的抑制作用。在进一步的研究中，我们发现细胞表面跨膜糖蛋白⑶44对于HER2介导的miR-139 表达抑制是必需的。如图Ig所示，在高表达HER2的SGC-7901和MKN-45细胞中沉默⑶44 的表达，则细胞中miR-139的表达明显上调，而在HER2中度表达⑶44阴性的AGS细胞中异 位表达CD44，则miR-139的表达受到显著抑制，在HER2阴性的GES-I细胞中共表达HER2和 ⑶44，则miR-139的表达亦被显著抑制(如图Ih所示)。这些结果表明，HER2通过与⑶44 相互作用，抑制miR-139的表达，从而促进CXCR4的表达。2. HER2/CD44通过促进miR-139基因组蛋白去乙酰化抑制后者表达。我们对miR-139的表达调控机制进行了深入研究，发现miR-139的表达与其在基 因座位上的宿主基因PDE2A并没有相关性，提示miR-139可能是独立表达的。随后，我们通 过5，RACE实验鉴定了 miR-139前体及其基因表达调控序列，构建了 miR-139启动子区域 (-1500 +200bp)的荧光素酶报告基因表达载体。如图2a所示，通过转染进入胃癌MKN-45 细胞，发现抑制HER2或⑶44的表达并不能显著改变荧光素酶报告基因表达载体中miR-139 启动子的活性(如图2a所示)，提示HER2/⑶44可能通过表观遗传学途径调控miR-139的 表达。为了探索miR-139表达调控的表观遗传学调控机制，我们分别用组蛋白去乙酰化 酶抑制剂PBA和DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理细胞。如图2b所示，PBA处理可以明 显恢复miR-139的表达，而5-Aza-CdR则没有明显作用；应用另一种组蛋白乙酰化酶抑制剂 TSA进行实验，得到了相似的结果(如图2e所示)。另一方面，通过亚硫酸盐测序等实验， 我们发现HER2表达沉默并不能显著影响细胞中miR-139基因启动子区的甲基化水平。以上结果表明，miR-139表达的抑制作用可能是基于miR-139基因启动子区组蛋白的去乙酰 化修饰。我们应用PBA处理HER2阳性胃癌细胞后检测CXCR4的表达，发现CXCR4蛋白水平 显著下调(如图2d所示)；我们随后应用乙酰化组蛋白H3的抗体进行染色体免疫沉淀分 析，发现正常HER2阳性胃癌SGC-7901和MKN-45细胞中无法检测到miR-139基因启动子区 组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)的乙酰化，而通过抑制HER2或⑶44的表达，或者应用PBA 阻断组蛋白的去乙酰化过程，则可以显著上调miR-139基因启动子区组蛋白H3K9的乙酰化 水平(如图2e所示)。这些结果证实，HER2信号通过诱导miR-139基因启动子区域的组蛋 白去乙酰化抑制其表达，从而促进CXCR4的表达。我们进一步对HER2信号诱导miR-139基因组蛋白去乙酰化的详细机制进行了研 究。如图2f所示，分别应用抗组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)抗体和作为Mi2/核小体重塑 和去乙酰化复合体(NuRD)重要组分的转移相关蛋白复合物MTAl的抗体进行染色质免疫 沉淀，均能有效地沉淀获得miR-139的启动子DNA区段，表明MTAl和HDAC2均参与结合 miR-139的启动子区域，从而可能参与该区域的组蛋白去乙酰化过程。那么，MTAl的表达是否受到HER2信号调控呢？我们在MKN-45细胞中抑制HER2或 ⑶44的表达，发现MTAl的表达随之受到抑制，与之同步的是miR-139表达的上调(如图2g 所示)。相似地，应用表皮生长因子家族受体酪氨酸激酶抑制剂gefitinib处理细施，或者 表达⑶44的显性负突变体，也能够强烈抑制MTAl的表达(如图2h左所示)。与此相反， HER2信号的激活剂Heregulin则可以明显上调细胞中MTAl的表达(如图2h右所示)，显 示肿瘤细胞中HER2信号可以明显促进MTAl的表达，而后者是参与组蛋白去乙酰化修饰的 重要蛋白质复合物。我们进一步研究了受HER2信号上调的MTAl对下游miR-139和CXCR4表达的影 响。如图2i所示，无论是否使用HER2信号的激活剂Heregulin，MTAl表达沉默后细胞中 miR-139均得以恢复表达，从而封闭CXCR4的表达。在MKN-45细胞中，组蛋白去乙酰化酶 HDAC抑制剂PBA可以明显上调miR-139的表达，并纠正由MTAl过表达导致的miR-139表达 抑制，但它对MTAl本身的表达水平没有影响(如图2j所示)。以上结果表明，HER2通过与 ⑶44相互作用上调MTAl的表达，后者进一步通过募集HDAC诱导miR-139基因组蛋白的去 乙酰化，从而抑制其表达。3.通过沉默HER2和⑶44的表达上调miR-139，可以有效地抑制裸鼠移植瘤的生长。通过在BALB/c裸鼠右后肢皮下注射对照SGC-7901和MKN-45细胞，或者稳定表 达HER2、⑶44表达沉默的上述细胞，建立裸鼠移植瘤模型。连续测量肿瘤体积(如图3a所 示)，待瘤体达500m3时剥瘤称重，计算其与体重的比值(如图3b所示)。我们发现，HER2 或CD44的表达沉默可以明显抑制在体肿瘤的形成和生长，而同时抑制二者的表达更是完 全阻断了移植瘤的形成(如图3a、b所示)。对肿瘤组织裂解物进行Northern blot和 Westernblot检测，发现HER2或CD44表达沉默后，miR-139的表达明显上升，而CXCR4的表 达则显著受到抑制(如图3c所示)。4.临床胃癌样本中HER2、CD44、miR-139和CXCR4表达呈现相关性。我们收集了 43例原发性胃癌石蜡包埋组织样品，其中19例并发淋巴结转移。免疫组化和原位杂交实验显示，在转移性胃癌中，17例(89% )为HER2阳性，17例(89% )为 ⑶44阳性，18例(95% )为CXCR4阳性，而在这些样品中均来检测到miR-139的表达，而在 非转移胃癌样品中，HER2、CD44、CXCR4和miR-139阳性比率分别为13% (3例)、33% (8 例)、13% (3例)和46% (表1)。在19例并发淋巴结转移灶中，有16例(84% )为HER2、 CD44和CXCR4同时阳性(表l，p < 0. 0001)，这16例转移灶对应的原发肿瘤中，有15例同 时表达3种蛋白，1例为HER2和⑶44双阳性，同时在这些转移性原发肿瘤及其转移灶中均 未检测到miR-139的表达。在非转移性胃癌样品中，仅有3例(12. 5% )检测到三种蛋白的 同时表达(表1)。统计结果表明，在非转移和转移性胃癌样品中，HER2、CD44和CXCR4的表 达均呈现明显的相关性(P < 0. 0001)。表1. 43例胃癌患者肿瘤细胞HER2、CD44、miR-139和CXCR4的表达情况
权利要求
1.microRNA-139在制备治疗转移性肿瘤的药物中的应用。
2.microRNA-139在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了microRNA-139(简称miR-139)在制备转移性肿瘤的治疗药物和诊断试剂中的用途。miR-139通过作用于其靶基因趋化因子受体CXCR4抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。肿瘤细胞中，人表皮生长因子家族分子HER2通过与CD44相互作用，下调miR-139的表达，因此，检测miR-139及其相互关联的HER2、CD44和CXCR4的表达，可以对肿瘤进行早期诊断，对肿瘤的转移和预后做出评价；在HER2阳性肿瘤中表达miR-139，或通过干预miR-139的上游信号恢复内源miR-139的表达，可以对肿瘤的转移发挥抑制作用。
文档编号A61K31/7105GK102000347SQ201010535660
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者付海京, 孟艳玲, 张瑞, 杨安钢, 王磊, 谢桥生, 贾林涛, 鲍炜 申请人:中国人民解放军第四军医大学