专利名称：含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建由可内化的单 链抗体、流感病毒血凝素融合肽和促凋亡分子组成的靶向重组分子基因、上述基因编码的 蛋白及所述的基因和蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
背景技术：
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物。 由于其特异性高、性质均一、可针对特定靶点向制备，抗体药物已被广泛应用于感染、心血 管疾患、自身免疫疾患等多种疾病治疗，特别是在肿瘤治疗中有巨大的潜力与应用前景。抗 体药物具有如下特点(1)特异性。抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这 是抗体药物发挥靶向治疗作用的重要基础；(2)多样性。主要表现为靶抗原的多样性、抗体 结构的多样性和作用机制的多样性以及“弹头”效应分子的多样性；(3)制备抗体药物的定 靶性。即根据需要，制备具有不同治疗作用的抗体药物。可以针对特定的靶分子，定向制备 相应的抗体，实行“量体裁衣”；也可以根据需要选择相应的“弹头”药物或“效应分子”，制 备相应的免疫偶联物或融合蛋白。抗体融合蛋白是抗体介导的靶向重组分子，由抗体片段(如单链抗体)和效应蛋 白两个基本部分构成。抗体片段可以将效应蛋白携带至靶细胞表面，其后效应蛋白发挥其 特定的生物学活性。与单一的单克隆抗体药物主要通过封闭特定信号通路发挥作用相比， 抗体融合蛋白兼具抗体的靶向性和效应蛋白的高生物活性，具有更有效的结构优势。然而， 大多数效应蛋白发挥作用的场所是细胞浆，虽然可内化的单链抗体可以通过靶细胞的内化 作用介导效应蛋白进入靶细胞内吞体，但是由于效应蛋白不能自由穿透内吞体膜结构进入 胞浆，抗体融合蛋白的功效被大大降低。因此，对传统抗体融合蛋白进行结构改造，提高效 应蛋白转位进入胞浆的能力是抗体靶向治疗亟待解决的关键问题之一。流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒包膜表面的一种主要膜蛋白， 由病毒基因组片段4编码，可诱导感染机体产生保护性中和抗体。HA分子感染细胞前必须 经酶裂解成HA1和HA2, HA1具有与宿主细胞受体结合的特性，HA2参与病毒和细胞融合的过 程。流感病毒血凝素融合肽(hemagglutinin fusion peptide)由流感病毒HA2亚单位 N端的20个氨基酸残基组成，能介导病毒外膜与细胞内小体膜融合并释放病毒核衣壳进入 胞浆。流感病毒的融合肽的膜融合作用具有PH依赖性。在较高PH环境下，融合肽N端α 螺旋插入内吞体膜结构中，而C端的空间构象松散，溶于水相中。在质子泵作用下，内吞体 内PH逐渐下降。当ρΗ降至5.0左右时，HA Glu11和Glu15所带电荷被中和，C端极性降低， 在Trp14和Ile18之间形成新的螺旋结构并插入到内吞体膜结构中，与N端α螺旋形成“倒 V”字形结构。融合肽空间构象的变化引起内吞体膜结构稳定性的变化，最终导致膜融合和 内吞体内物质“外泻”进入细胞液(Vaccaro L,Cross K J,Kleinjung J，et al. Plasticityof influenza haemagglutinin fusionpeptides and their interaction with lipid bilayers. Biophys J, 2005,88(1) :25_36)。流感病毒血凝素融合肽能破坏内吞体膜结构稳 定性，这为向细胞液内导入外源蛋白提供了有力的工具
发明内容
本发明的目的在于构建一类特异性强、活性高的靶向重组分子，这类靶向重组分 子可用于肿瘤、感染性疾病等的靶向生物治疗。本发明为实现上述发明目的，将能特异性识别并结合肿瘤抗原(如HER2)或其他 疾病特异性抗原(如乙肝表面抗原HBsAg)的可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合 肽(HAfp)基因和促凋亡分子基因(如活性杀伤分子bid)融合，并在可内化单链抗体基因 与HAfp基因之间加入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。这样，经基因重组获得的 重组分子同时具有抗体对靶细胞的特异性识别功能、HAfp破坏靶细胞内吞体膜稳定性功能 和促凋亡分子诱导靶细胞凋亡的生物学功能，可以用于肿瘤等疾病的靶向治疗。本发明的技术解决方案是含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因，由 可内化单链抗体基因、流感病毒血凝素融合肽基因和促凋亡分子基因组成，并在可内化单 链抗体基因与HAfp基因之间加入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。由上述的基因编码的蛋白，由可内化单链抗体、流感病毒血凝素融合肽和促凋亡 分子组成，并在可内化单链抗体与HAfp之间加入了编码furin蛋白酶识别位点氨基酸序 列。所述的基因在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。所述的蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。本发明所构建的含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子具有以下特点①特 异性——靴向重组分子通过单链抗体特异性地识别表达有特定肿瘤抗原的肿瘤细胞，而对 正常组织细胞没有识别和杀伤作用；②安全性——靴向重组分子主要由人源化单链抗体和 人自身促凋亡分子构成，而流感病毒血凝素融合肽序列短、免疫原性小，反复使用不会诱发 体内产生中和抗体，而且细胞发生凋亡时不引起炎症反应，所以治疗的毒副作用较小；③高 效性——重组分子负载的促凋亡分子具有高效的促细胞凋亡生物活性。如具有杀伤活性的 Bid是细胞凋亡通路中重要的信号传导分子，向细胞中导入活性形式的截短型Bid(tbid) 分子，不仅能够激活caspases通路的凋亡效应，还可以促进AIF等不依赖caspases的凋亡 诱导分子从线粒体中释放，即使caspases被抑制也能启动凋亡的发生，使其对肿瘤细胞的 杀伤作用更直接，且效率更高。此外，靶向重组分子结合靶细胞并内化进入内吞体后，在内 吞体furin蛋白酶的作用下被剪切，释放出Hafp-促凋亡分子小片段，并在HAfp的作用下 实现了促凋亡分子高效转位至胞浆从而发挥其促凋亡生物活性。本发明的研究结果表明，含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子能够特异性 识靶细胞并被靶细胞内吞进入内吞体；由于HAfp的存在，活性促凋亡分子能从内吞体中高 效转位至胞浆；促凋亡分子在靶细胞内可充分发挥其促细胞凋亡的生物活性。本发明可望为肿瘤等多种疾病的靶向生物治疗提供一种新手段。
图1为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。图2为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子基因原核表达产物Westen blot鉴定结果图。图3为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子抗原结合活性ELISA鉴定结果图。图4为HBsAg靶向促凋亡分子特异性识别靶细胞的间接免疫荧光结果图。图5为HBsAg/HER2靶向促凋亡分子抑制靶细胞的生长的MTT结果图。图6为HBsAg靶向促凋亡分子杀伤HBsAg阳性肿瘤细胞的流式细胞检测结果图。
具体实施例方式本发明构建的靶向重组分子由可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基 因和促凋亡分子基因经重组而形成，并在可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基 因之间插入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。现以乙肝病毒表面抗原HBsAg和肿 瘤特异性抗原HER2为例，构建HBsAg/HER2靶向促凋亡分子，并检测上述分子的生物学活 性。上述重组分子的促凋亡分子均为人截短型活性bid(tbid)。实施例1 1. HBsAg靶向促凋亡分子基因的构建(1)构建 pET32a-scFv-Fu-HAfp_tBid 质粒(Fu 为 furin 蛋白酶识别位点，下同)以本发明人实验室保存的质粒pET32a-HBV_scFv为模板(Wen WH，Qin WJ, Gao H, Zhao J, Jia LT, Liao QH, Meng YL, Jin BQ, Yao LB, Chen SY, YangAG. An hepatitis B virus surface antigen specific single chain of variable fragment derived from a natural immune antigen binding fragment phage display library is specifically internalized byHepG2. 2. 15 cells. J Viral Hepat. 2007 Jul ；14(7) 512-9.)，以HBV-scFv-p5和HAfp-lst_p3为上、下游引物进行第一轮扩增，获得的PCR产物 再以HBV-ScFv-p5和HAfp-2nd-p3为上、下游引物进行第二轮扩增，获得scFv-HAfp片段。 将scFv-HAfp片段以Ncol和EcoRI双酶切，与经Ncol和EcoRI双酶切的pET32a载体连接， 获得 pET32a-scFv-HAfp 质粒。以上述 pET32a-scFv_HAfp 为模板，以 EcoRI-Fu_HAfp-p5 和 HAfp-BamHI_p3 为上、下游引物进行扩增，获得Fu-HAfp片段；以本发明人实验室保存的质粒 pET32a-e23sFv-TD-tBid (Wang F, Ren J, Qiu XC, Wang LF, Zhu Q, Zhang YQ, Huan Y, Meng YL, Yao LB, Chen SY, Xu YM, Yang AG. Selective cytotoxicity to HER2-positive tumor cells by a recombinante23sFv-TD-tBID protein containing a furin cleavage sequence. CIinCancer Res. 2010 Apr 15 ； 16 (8) :2284_94.)为模板，以 BamHI_tBid-p5 和 T7ter为上、下游引物进行扩增，获得tBid片段。将Fu-HAfp片段以EcoRI和BamHI双酶切、 tBid片段以BamHI和Xhol双酶切，酶切片段与经EcoRI和Xhol双酶切的pET32a_HBV_scFv 质粒连接，获得pET32a-SCFv-Fu-HAFP-tBid质粒。经酶切鉴定和测序证实载体构建正确。 引物序列如下HBV-scFv-p55’ -TTTCCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3，HAfp-lst-p3
5， -GCCGTTTTCAATAAAGCCTTCAATCGCTTCAAACAGGCCTCGATTGATTTCCACCTTGG-3，HAfp-2nd-p35 ’ -GCGAATTCGCCATACCAGCCATCAATCATGCCTTCCCAGCCGTTTTCAATAAAGCCTT-3’EcoRI-Fu-HAfp-p5 5 ’ -TTTGAATTCGCCGCCAATAGAGTGAGGAGATCTGTGGGCGGCCTGTTTGAAGCGATTG-3’HAfp-BamHI-p 3 5’ -TTTGGATCCGCCATACCAGCCATCAATCATGC-3’BamHI-tBid-p5 5’ -TTTGGATCCGGCAACCGCAGCAGCCACTC-3，T7ter 5’ -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’ 3(2)构建 pET44b-scFv-Fu-HAfp-tBid 质粒将pET32a-scFv-Fu-HAfp-tBid质粒以Kpnl和Xhol双酶切，酶切片段与经Kpnl和 Xhol双酶切的pET44b载体连接，获得pET44b-scFv-Fu-HAfp-tBid质粒。经酶切鉴定证实 载体构建正确(附图1)，测序结果表明该重组分子中具有流感病毒血凝素融合肽的序列。实施例2 2. HER2靶向促凋亡分子基因的构建用Ncol 禾口 EcoRI 双醇切 pET44b-scFv-Fu-HAfp-tBid 质粒禾口 pET32a-e23sFv-TD-tBid 质粒，通过片段回收和连接获得 pET44b-e23sFv-Fu_HAfp-tBid 质 粒经酶切鉴定证实载体构建正确(附图1)，测序结果表明该重组分子中具有流感病毒血凝 素融合肽的序列。3. HBsAg/HER2靶向促凋亡分子原核表达及产物纯化将构建成功的pET44b-scFv-Fu-HAFP-tBid 质粒和 pET44b-e23sFv-Fu_HAfp-tBid 转化入大肠杆菌蛋白表达宿主菌RosettaBlue (DE3)，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素 (100ii g/mL)、四环素(12. 5ii g/mL)、氯霉素(34 u g/mL)的 LB 培养基中，37°C、220rpm 摇菌 过夜，次日以1 100接种，37°C振荡培养至006(1(1为0.6时，加入IPTG至终浓度为0. lmmol/ L诱导表达，于25°C低温振荡培养4小时。离心收集菌体，以每0. lg湿菌加入lmL裂菌缓 冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8. 0,0. 5mol/L NaCl，10%甘油，5mmol/L 咪唑)的比例重悬， 冰上超声破碎菌体(超声功率300W，超声时间15min，超声ls，间隔ls)，4°C 12000rpm离 心15min，收集上清，与2mL镍-次氨基三乙酸(Ni2+_NTA)螯合层析介质混合，至于垂直混合 器上4°C结合1小时。将混合液加入层析柱中，以30mL/h流速收集穿透液，加入10mL洗涤 缓冲液(20mmol/LTris-HCl pH8. 0,0. 5mol/L NaCl，10%甘油，40mmol/L 咪唑)去除与层析 介质非特异结合的杂蛋白，再加入10mL洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,0. 5mol/L NaCl,10%甘油，lmol/L咪唑)洗脱目的蛋白。将蛋白洗脱液以超滤管浓缩，BCA法对浓缩 蛋白进行定量，以lU/50iig纯化蛋白的比例加入肠激酶，22°C作用16小时，将目的蛋白与 其N端融合标签切开，再将酶切后的蛋白溶液与2mL Ni2+-NTA层析介质混合以相同步骤进 行第二次亲和层析，去除N端融合标签，最终的蛋白洗脱液经超滤管浓缩后定量，确定纯化 蛋白浓度，所得产物即为融合基因表达蛋白(附图2)。该基因表达产物具有流感病毒血凝 素融合肽的序列。
4. HBsAg/HER2靶向促凋亡分子表达产物抗原结合活性检测将HBsAg/HER2蛋白配制成20 u g/mL溶液，以每孔50 y L加入ELISA板，4°C包被 过夜。加入不同稀释度的HBsAg/HER2靶向促凋亡分子基因表达产物，以纯化的NusA蛋白 作为阴性对照，37°C孵育1小时，依次加入鼠抗6XHis单克隆抗体(1 1000稀释)、HRP 标记的山羊抗小鼠IgG(l 2000稀释)，37°C各孵育1小时，加入ABTS显色液，37°C孵育 20min，在酶标仪上读取各孔A410nm值。结果显示随着蛋白浓度的下降，融合基因表达产 物与HBsAg/HER2抗原的结合也逐渐降低，表明融合基因表达产物具有HBsAg/HER2结合活 性(附图3)。5. scFv-Fu-HAfp-tBid基因表达产物对靶细胞结合及内化活性检测 胰酶消化PLC\PRF\5和IfepG2细胞，制备细胞爬片，待细胞贴壁后分别加入 scFv-Fu-HAfp-tBi d融合基因表达产物和纯化的NusA蛋白，调整蛋白浓度为1 ii mo 1 /L， 37°C孵育2小时。孵育完毕后，细胞爬片经4%多聚甲醛固定20min，以0. 5% Triton-X100 溶液室温处理lOmin，再以10%兔血清37°C封闭30min，依次加入鼠抗6XHis单克隆抗体 (1 500稀释，4°C孵育过夜)，Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(l 200稀释，室温避光孵育 30min)，再以1 ii g/mL DAPI溶液37°C避光孵育5min，1 1甘油/PBS溶液封片，荧光显微 镜下观察、照相。结果显示scFv-Fu-HAfp-tBid融合基因表达产物能够与HBsAg阳性细胞 (PLC\PRF\5)结合并内化进入细胞，但对HBsAg阴性细胞0fepG2)没有类似作用，显示出特 异的细胞结合活性和良好的内化活性；相同处理条件下，阴性对照NusA蛋白对HBsAg阳性 细胞和阴性细胞都无结合及内化活性(附图4)。6. MTT法检测HBsAg/HER2靶向促凋亡分子基因表达产物对靶细胞生长抑制作用取对数生长期的HBsAg阳性PLC\PRF\5细胞和HER2阳性SGC-7901细胞，以 5 X 103/孔铺于96孔板，培养过夜。纯化的融合蛋白以PBS调整至设定浓度，以0. 2 y m滤器 过滤除菌，加入相应孔中，继续培养48小时后，每孔中加入20 iiL MTT溶液(5mg/mL)，继续 培养4小时后吸去培养液，每孔加入150 ii L DMS0，振荡lOmin，以490nm波长在酶标仪上测 定各孔光吸收值，以光吸收值与融合蛋白作用浓度做图，显示不同浓度融合蛋白的加入对 HBsAg/HER2阳性肿瘤细胞生长状况的影响。结果显示随着靶向促凋亡分子融合基因表达 产物浓度的增加，靶细胞生长被抑制的程度逐渐加强；相同处理条件下，阴性对照NusA蛋 白对靶细胞生长无明显抑制现象(附图5)。7.细胞凋亡早期，细胞膜表面会出现磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧外翻，暴露于细 胞膜外侧，此时可以与Armexin V试剂结合而被检测出来。Armexin V检测是鉴定细胞凋亡 的重要方法。将HBsAg阳性细胞(PLC\PRF\5)接种6孔板，过夜培养，向培养液中加入终浓 度为1 y mol/L的scFv-Fu-HAfp-tBid融合基因表达产物，继续培养12小时后，胰酶消化收 集细胞，以Armexin V凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检测。结果显示与对照组NusA蛋 白相比，scFv-Fu-HAfp-tBid融合基因表达产物处理组细胞发生凋亡的比例显著增加，达到 52. 3%，说明融合基因表达产物可以有效的诱导HBsAg阳性细胞发生细胞凋亡(附图6)。
权利要求
含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因，由可内化的单链抗体基因、流感病毒血凝素融合肽基因和促凋亡分子基因重组而成，并在单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基因之间加入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。
2.如权利要求1所述的含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因，其特征在 于所述的可内化的单链抗体为乙肝病毒表面抗原HBsAg和肿瘤特异性抗原HER2之一。
3.如权利要求1所述的含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子基因，其特征在 于所述的促凋亡分子为人截短型活性bid。
4.由权利要求1所述的基因编码的蛋白，由可内化的单链抗体、流感病毒血凝素融合 肽和促凋亡分子组成，并在单链抗体与流感病毒血凝素融合肽之间加入了编码furin蛋白 酶识别位点的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子编码的蛋白，其特 征在于所述的可内化的单链抗体为乙肝病毒表面抗原HBsAg和肿瘤特异性抗原HER2之o
6.如权利要求4所述的含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子编码的蛋白，其特 征在于所述的促凋亡分子为人截短型活性bid。
7.如权利要求1所述的基因在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
8.如权利要求2所述的蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一类含有流感病毒血凝素融合肽的靶向重组分子，由可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基因和促凋亡分子基因经重组而形成，并在可内化单链抗体基因与流感病毒血凝素融合肽基因之间插入了编码furin蛋白酶识别位点的基因序列。这类靶向重组分子基因表达产物的单链抗体部分可以特异性识别、结合表达有特定抗原的靶细胞，并介导重组蛋白内化进入靶细胞内吞体；重组蛋白在内吞体中经furin蛋白酶切割后单链抗体与其他部分分离，暴露出流感病毒血凝素融合肽，并在其作用下通过破坏内吞体膜稳定性将促凋亡分子释放入胞浆；最终促凋亡分子在胞浆中高效诱导靶细胞凋亡，发挥其生物学活性。
文档编号A61K48/00GK101979594SQ201010535659
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者任君琳, 孟艳玲, 杨安钢, 温伟红, 王涛, 王芳, 白文栋, 贾林涛, 赵晶, 赵智凝, 闫博, 陈锐 申请人:中国人民解放军第四军医大学