专利名称：一种小分子dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA疫苗及其制备方法，特别涉及一种小分子DNA疫苗及其 制备方法。
背景技术：
1990年，Wolff等(Wolff etal，1990)在对小白鼠进行基因治疗试验时，偶然 发现DNA疫苗。1992年，美国同时有四个实验室开发研究出DNA疫苗并在同年九月的 疫苗学新进展大会上同时进行了报告。自此DNA疫苗引起人们的高度重视，被认为是继 减毒、灭活疫苗和亚单位疫苗之后的第三次疫苗革命。DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与含有必要表达调控元件 的真核表达载体质粒重组后，将重组质粒DNA直接注入动物机体，并通过宿主细胞的转 录、翻译系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治 疗疾病的目的。DNA疫苗在传染性疾病、寄生虫和肿瘤的防治中显示出巨大潜力，它既是载体 又能在真核细胞中表达抗原，在体内抗原的表达与自然感染相似，体内表达的抗原蛋白 具有天然构象，诱导的抗体应答特征与野生病毒相似，同时诱导机体产生细胞免疫及体 液免疫反应。目前已经进行了多种病原体的DNA疫苗的研究，如流感、乙型肝炎、艾 滋病等，这些试验结果表明，DNA疫苗不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病 的作用。因此将为长期以来无法预防或预防不理想的传染病带来希望。它与传统疫苗的 区别，主要在于核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生的，表达产物具有天然的构 象，可按照正常的途径被加工、修饰，再提呈给免疫系统，最终引起全面的免疫反应， 整个过程与病毒的自然感染或接种减毒活疫苗相同，所以核酸疫苗最大的优点既具有亚 单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又有减毒活疫苗和重组疫苗诱导全面免疫应答能力的优 点ο现有的DNA疫苗是将目的基因克隆到质粒载体上，置于真核基因启动子的控制 之下，以此质粒DNA注射动物或人，刺激免疫反应，达到预防和治疗疾病的目的。为 筛选出有效装载的DNA质粒，现有的DNA疫苗载体上携带有其他外源基因，如用于克 隆筛选的各种抗生素基因、用于质粒复制的复制起始序列、调节基因转录或表达的增强 子、提高免疫效果的免疫调节基因、标记基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因和β半乳糖 甘酶基因等。由于所携带的基因或DNA序列过多，将会出现许多弊病其一是其他抗原 的表达，可能对机体造成危害或不确定性；其二是因为其他基因的表达，与目的基因的 表达形成了资源竞争，导致免疫效果降低；其三也是最重要的是过多其他基因或非最必 须DNA序列的存在构成了很大的生物安全问题，增加了外源DNA整合到宿主基因组中 的几率，增加了诱发肿瘤等问题的机会，使DNA疫苗的使用存在的不确定性大为增大； 另外在有过多其他基因或非最必须DNA序列的存在的情况下，单位质量内的DNA的拷 贝数相应降低，这将降低DNA疫苗的免疫效率，也将提高疫苗的生产成本，同时载体上携带的其他外源基因可能影响目的抗原蛋白加工、修饰从而形成天然构象。理论上传统的DNA疫苗只使用超螺旋或环状的质粒DNA作为载体，并不使用 线性DNA或用PCR技术扩增出的线性DNA，因此现有的DNA疫苗可以称为质粒DNA 疫苗(Plasmid DNAVaccine, pDNAVaccine)。线性DNA在体内易于降解，一般认为在体内不能有效的表达，不可作为疫苗 或其他基因制剂使用。在我们之前的专利申请中(专利申请号200610033861.5)，突 破常规，将真核生物基因转录启动子和转录终止子与目的基因相连，得到一种短链线性 DNA,并发现该种DNA在动物体内可以有效的表达，可作为DNA疫苗或其他基因制剂 使用。同时，与质粒DNA疫苗相比，该申请的线性DNA疫苗具有更好的安全性，效价 更高等优点。该申请中公开的DNA分子中，一定要含有完整的启动子、目的基因和终止子， 其长度较常规的质粒DNA疫苗虽然有很大的降低，但是其总体长度依然是比较可观的， 现有的PCR技术难以保证其扩增的准确性。
发明内容
一种小分子DNA疫苗，由转录启动子和目的基因构成线性DNA片断，目的基 因包含其起始和终止密码子。优选的，转录启动子为真核基因转录启动子。上述小分子DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤
1)将转录启动子克隆至含有克隆位点的载体中，得到通用载体；
2)将目的基因克隆到通用载体中，得到含有转录启动子和目的基因的重组载体；
3)根据通用载体中转录启动子的上游序列设计通用引物，根据目的基因的下游序 列，设计下游引物，以重组载体为模板，扩增由转录启动子和目的基因构成的线性DNA 片断。优选的，含有克隆位点的载体为多克隆载体。优选的，多克隆载体为含有多克隆位点的T载体。本发明的小分子DNA疫苗，通过注射、喷鼻、吸入等方式施用人或动物，可以 人或动物中诱导体液性免疫和细胞性免疫，提供有效的保护。与现有DNA疫苗相比，本 发明的小分子DNA疫苗，可更快地诱导产生抗体，产生的细胞免疫水平更高。本发明的小分子DNA疫苗，只携带真核生物基因转录启动子和目的基因或目的 基因片段，不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA 尾巴、复制起始点等，具有更好生物安全性。由于线性DNA疫苗的整体长度更短，更易 于扩增，同时，扩增的准确性更高，疫苗的效价比也更高。本发明的小分子DNA疫苗，制备方法简单，制备时间短，从将目的基因克隆到 通用载体到制备出小分子DNA疫苗，整个过程可在24小时内完成，相对于常规的疫苗制 备技术，其生产周期大大缩短。同时，本发明的小分子DNA疫苗，可采用成熟的PCR 技术制备，可大规模工业化生产，特别适用于传染性疾病的爆发等突发事件。
图1是本发明小分子DNA疫苗通用载体的构建示意图。图2是本发明小分子DNA疫苗的制备过程示意图。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本发明。本发明小分子DNA疫苗制备过程如图1、图2所示，较为具体的制备工艺如下 针对人的巨细胞病毒CMV启动子设计引物，设计的上下游引物如下
CMV 上游弓丨物 P1 5，- gcggccgccttatatattctttccca _3， (SEQ ID NO. 1) CMV 下游引物 P2: 5，-ctgacggttcactaaaccagctctgct-3， (SEQIDN0.2) pAdTrack-CMV的质粒作为克隆CMV片段的模板，用引物P1和P2扩增CMV的 CMV启动子基因，反应条件为94°C预变性5min，然后以94°C变性lmin，48°C退火 Imin, 72°C延伸1.5min，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin ；
回收纯化获得的PCR产物，克隆进入pMD18-T载体的EcoR ν克隆位点间，挑取 Amp抗性的阳性单菌落培养，提取其中的质粒后，双酶切鉴定重组质粒，然后测序证实 CMV启动子已克隆进入载体中，获得的含有CMV启动子的重组质粒命名为pCMV-T ； 将目的基团克隆入pCMV-T中，获得的重组质粒称为pCMV-T-Target ； 根据pCMV-T-Target中CMV启动子的上游序列，设计上游引物P1，根据目的基因 的下游序列，设计下游引物P4，其中上游通用引物为
上游弓丨物 P1 5，- gcggccgccttatatattctttccca _3， (SEQ ID NO. 1)； 以pCMV-T-Target为模板，Pl、P4为引物扩增得到线性DNA片断 pMD-CMV-Target,纯化后得到本发明的小分子DNA疫苗。实施例1猪圆环2型病毒(PCV2)的ORF2基因小分子DNA疫苗的构建 使用上游引物 Al 5，-ttaatgacgtatccaaggag-3， (SEQ ID N0.3)禾口
下游引物 A2 5，-tacaggggttaagtgggg-3， ( SEQ ID N0.4 )扩增 PCV2 GD 毒株 (AY613854) ORF2基因，扩增条件为94°C预变性5min，然后以94°C变性lmin，48°C 退火lmin, 72°C延伸1.5min,进行30个循环，最后72°C延伸IOmin ；
回收纯化扩增得到的PCV2 GD毒株ORF2基因克隆进入pCMV_T中，得到重组质粒 命名为pCMV-T-ORF2，使用pCMV-T-ORF2转化感受态细胞大肠杆菌DH5 α，对重组 质粒进行鉴定，确认质粒中已经克隆入PCV2 GD毒株ORF2基因；
以pCMV-T-ORF2为模板，扩增出仅含有CMV启动子和ORF2基因的线性DNA片 断，纯化DNA片断得到pMD-CMV_ORF2小分子DNA疫苗。实施例2猪圆环2型病毒(PCV2)的ORFl基因小分子DNA疫苗的构建
与实施例1类似的构建得到猪圆环2型病毒(PCV2)的ORFl基因的小分子DNA疫 苗，其中，扩增ORFl基因时使用的引物为
上游弓丨物 D1 5，-taaggtaccaatgcccagcaagaagaatg-3， (SEQ ID NO.5) 下游引物 D2 5，-taatctagaatttcatatggaaattcagg-3， (SEQ ID N0.6) 扩增的条件为94°C预变性5min，然后以94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸 1.5min，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin0
小分子DNA疫苗的免疫试验
小鼠免疫试验
选取6 8周健康的雌性BALB/C小鼠54只分为9组，每组6只，分别为 1.生理盐水组，2.壳聚糖对照组，3.脂质体对照组，4.壳聚糖包被 的pMD-CMV_ORF2，5.脂质体包被的pMD-CMV_ORF2，6.壳聚糖包被 的pMD-CMV-ORF1，7.脂质体包被的pMD-CMV-ORFl，8.壳聚糖包被的 pMD-CMV-ORFl + 2，9.脂质体包被的pMD-CMV-ORFl + 2。每只小鼠免疫前用24 小时注射0.2%的利多卡因于后腿股四头肌，每只lOOyL，试验试剂的注射部位相同。
壳聚糖包被的小分子DNA疫苗的制备40mg壳聚糖，加入280 μ L乙酸，然后 加三蒸水至2mL，37°C 180 200r/min摇荡过夜至壳聚糖完全溶解，溶液呈透明状。加 水至190mL，用NaOH调节PH为5.5，最后定容200mL，0.22 μ m滤膜过滤除菌得溶液 a。将小分子DNA疫苗加入50mmol/L的NaS04溶液中至100yg/mL得到溶液b。各取 等体积的溶液a、b，分别预热至50 55°C，迅速振荡混合30s，形成乳白色悬液，即壳 聚糖包被的小分子DNA疫苗。将制备好的小分子DNA疫苗悬浮液室温放置1小时后， 4000r/min离心30min，去除部分上清，再加无菌水定容至pcrDNA含量1 μ g/μ L。每次 每只小鼠注射100 μ L。脂质体包被的小分子DNA疫苗的制备取2 μ g/ μ L的小分子DNA疫苗0.3mL 与脂质体LipOfeCtamineTM2000 0.3mL混合后室温放置15min，即形成脂质体包被的小分子 DNA疫苗。pcrDNA含量为1 μ g/ μ L，每次每只小鼠注射100 μ L。壳聚糖对照组用与壳聚糖包被的小分子DNA疫苗免疫组等量的壳聚糖(不含小 分子DNA疫苗)免疫小鼠。脂质体对照组用与脂质体包被的小分子DNA疫苗免疫组等量的脂质体(不含小 分子DNA疫苗)免疫小鼠。所有小鼠每两星期免疫一次，共免疫三次。实验结果
免疫前及初次免疫后2、4、6、8、10周由小鼠尾部采血，分离血清。用ELISA检 测试剂盒检测结果表明，pMD-CMV-ORF2小分子DNA疫苗、pMD-CMV-ORF1小分 子DNA疫苗及pMD-CMV- ORF1+2小分子DNA疫苗均能诱发小鼠特异性抗体产生，艮P 诱导体液免疫发生。上述疫苗试验组与生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组相比 具有显著性差异。4 9组分别是生理盐水组抗体OD值的149.6%，169.7%，142.4%， 164.1%, 149.6%，189.9% ；壳聚糖对照组、脂质体对照组与生理盐水组没有显著差异。小分子DNA疫苗免疫小鼠弓I发细胞免疫反应 1、淋巴细胞转化试验
1)取小鼠脾脏分离淋巴细胞，调整细胞浓度为IXlO7AnL ；试验设试验组、试验对 照组和空白对照组。2)具体加样方法于96孔细胞培养板，每份淋巴细胞标本分两组(刺激组和对 照组)，每组5个重复孔，刺激组分别加入100 μ L分离好的淋巴细胞、50yL40yg/mL 的刀豆蛋白A(ConA)和10%小牛血清的1640培养液；对照组分别加入100 μ L分离好的 淋巴细胞、100 μ L10%小牛血清的1640培养液；空白对照组每孔加入200 μ L10%小牛血清的1640培养液；
3) 370C 5% CO2,温育24小时，力口入10 μ L MTT (5 μ g/mL)，继续培养4小时，然 后每孔加入100 μ L 10% SDS-0.04mol/L终止液终止反应，37°C 4小时后黑紫色结晶完全
溶解后，用酶联免疫检测仪测定OD63tl值。计算刺激指数(Si)，SI=(刺激组_空白对照组)/ (试验照组_空白对照组)。结果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 小
分子DNA疫苗免疫鼠脾脏淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应均显著高于生理盐水组、 壳聚糖对照组、脂质体对照组。4 9组免疫刺激指数(Si)是生理盐水组的149.3， 133.7%, 125.7%, 129.2%, 127.1%, 150.6% ；壳聚糖对照组、脂质体对照组与生理盐水
组没有显著差异。自然杀伤细胞活性(NK)检测 采用2h短程释放改良法。1)分离小鼠脾单核细胞，10%小牛血清的1640培养基将细胞浓度调整至 IXlOVmL,作为检测NK细胞活性的效应细胞，以SP2/0瘤细胞作为靶细胞，培养管用 无菌1.5mL Eppondof管。试验设NK自然杀伤组(Mixture)、靶细胞自然释放组(Spon)、 最大释放组(Max)共3组，并各设3只复管；
2)具体加样方法100μ L效应细胞和100 μ L靶细胞，效靶细胞浓度比例为50:1， 作为NK自然杀伤组(Mixture) ； 100 μ L靶细胞和2%小牛血清的1640培养液为靶细胞自 然释放组(Spon) ； 100 μ L靶细胞和100 μ L 10% TritonX-IOO为最大释放组，加样完毕， 混勻，500r/min离心2min，37°C孵育2h，然后各管加冰冷生理盐水50 μ L终止效靶细胞 间细胞毒作用；
3)将试验管以3000r/min离心5min，取上清加于40孔聚苯乙烯微量反应板中进行 酶促反应，100 μ L/孔，置37°C预温20min，各孔加入LDH底物液100 μ L，放于37°C恒 温箱中反应lOmin，取出，各孔加0.10101/1^柠檬酸3(^1^以终止酶促反应，在酶联免疫 检测仪上读取OD63tl值。按以下公式计算自然杀伤细胞的自然杀伤率(％)。此百分率值与自然杀伤细胞 的杀伤活性呈正相关。自然杀伤率=(Mixture管 A63tl 值-Spon 管 A63tl 值)/ (Max 管 A63tl 值-Spon 管 A630 值)
结果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl 及 pMD-CMV-ORFl+2 等疫苗免
疫均能够使小鼠脾脏中NK细胞的杀伤活性明显增强；4 9组等疫苗免疫组小鼠脾脏中 NK 细胞的杀伤活性达到 37.2%，30.4%, 31.6%, 34.8%, 39.1%, 34.8%。T细胞亚群的测定
1)制备小鼠脾单个细胞悬液6X106/L 100 μ L，经200目钢筛过滤后1500r/min离心 5min,弃上清；
2)用荧光洗液(0.15mol/LPBS pH7.4、2% 葡萄糖、0.1% BSA> 0.05%NaN3)洗两 遍。用荧光洗液定容100 μ L，分别加入PE标记的抗CD4+、FITC标记的CD8a+、 PE-Cy5标记的CD3+，混均后置4°C避光30min ；
3)取出，用荧光洗液洗2遍，加入300μ L荧光洗液，用流式 细胞仪分析T细胞亚群。结果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 pcrDNA疫苗免疫均能够使小鼠脾细胞中的Th亚群和Tc亚群的百分含量分别高于生理 盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。4 9组疫苗免疫均能够使小鼠脾细胞中的Th 亚群百分含量由生理盐水组的19.3%上升到了 26%，27.7%, 26.1%, 27.1%, 27.8%, 28.5% ； Tc亚群的百分含量由生理盐水组的6.1%上升到了 7%，6.7%, 6.5%, 6.4%, 6.5%, 7.1%。猪免疫实验
将7日龄健康仔猪分成9组，每组3头，分别为1.生理盐水组，2.壳聚糖 对照组，3.脂质体对照组，4.壳聚糖包被的pMD-CMV-ORF2组，5.脂质体包被 的pMD-CMV-ORF2组，6.壳聚糖包被的pMD-CMV-ORFl组，7.脂质体包被的 pMD-CMV-ORFl组，8.壳聚糖包被的pMD-CMV-ORFl + 2组，9.脂质体包被的 pMD-CMV-ORFl + 2组。每头猪分别隔离饲养，共肌肉注射3次，每次间隔2周。每 组于左右颈侧部肌肉各注射ImL经壳聚糖或脂质体包被的小分子DNA疫苗，免疫剂量为 1000 μ L。壳聚糖包被的小分子DNA疫苗的制备40mg壳聚糖，加入280 μ L乙酸，然后加三蒸水至2mL，37°C 180 200r/min摇荡过夜至壳聚糖完全溶解，溶液呈透明状。加 水至190mL，用NaOH调节PH为5.5，最后定容200mL，真空过滤(0.22 μ m滤膜)除菌 得溶液a。将小分子DNA疫苗加入50mmol/L的Na2SO4溶液中至100 μ g/mL得到溶液 b。各取等体积的溶液a、b，分别预热至50 55°C，迅速振荡混合30s，形成乳白色悬 液，即壳聚糖包被的小分子DNA疫苗。将制备好的壳聚糖包被的小分子DNA疫苗悬浮 液室温放置1小时后，4000r/min离心30min，去除上清，再加无菌水定容至pcrDNA含 量lyg/yL。每次每头猪注射1000 μ L。脂质体包被的小分子DNA疫苗按以下比例配制备卵磷脂30mg、胆固醇15 mg和十八胺2mg，完全溶解于15ml乙醚中形成溶液1 ； 2000ug溶于磷酸盐缓冲液 (pH7.4)3ml中形成溶液2;将溶液1和溶液2混合，超声波乳化至不分层，旋转蒸发至 乙醚完全去除。定容终体积为2ml，即脂质体包被的小分子DNA疫苗。4°C保存备用， 小分子DNA含量为1 μ g/ μ L，每次每头猪注射1000 μ L。壳聚糖对照组用与壳聚糖包被的小分子DNA疫苗免疫组等量的壳聚糖(不含小 分子DNA疫苗)免疫猪。脂质体对照组用与脂质体包被的小分子DNA疫苗免疫组等量的脂质体(不含小 分子DNA疫苗)免疫猪。猪圆环2型病毒小分子DNA疫苗免疫猪的攻毒
取第3代PCV2 (GD株)细胞毒经鼻腔和口腔途径感染3周龄无特定病原(SPF)猪， 接种量为5mL。攻毒后24天，无菌取猪的淋巴结、脾脏、肾、扁桃体，勻浆，用灭菌 PBS制成1:3 (W/V)的组织悬液，以6000r/min离心取上清，加青霉素、链霉素处理后， 取含毒组织悬液接种于PK15细胞，用免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)测定TCID5tl后，分装，冻存于_80°C冰柜备用。IPMA 测定 TCID5tl 的试验方法参照文献(Ladekjaer-Mikkelsen et al，2002)。
最后1次免疫后4周，经鼻腔和口腔途径感染106_22TCID5Q/mL的PCV2组织毒， 每头接种5mL。 实验结果
猪圆环2型病毒小分子DNA疫苗免疫猪的抗体水平检测
分别于免疫前、第1次免疫后14天、第2次免疫后14天、第3次免疫后14天和 28天，以及攻毒后1，2，3，4，5周采集各组猪的前腔静脉血，分离血清，用ELISA检 测试剂盒检测血清中的PCV2特异性抗体。第3次免疫后4周通过口腔和鼻腔途径感染 PCV2组织毒(GD株)。结果表明，各小分子DNA疫苗免疫组猪均产生了 PCV2特异性ELISA抗体和中 和杭体，中和抗体效价达到1:20以上；28天后4 9组的猪特异性抗体OD值均比生理 盐水组高一倍以上，2、3组与生理盐水组没有显著差异。猪圆环2型病毒小分子DNA疫苗免疫猪的细胞免疫水平的检测 1、淋巴细胞增殖试验
1)取猪前腔静脉血，置于肝素抗凝管中。分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1X107 mL，试验设试验刺激组、试验对照组和空白对照组；
2)具体加样方法于96孔细胞培养板，每份淋巴细胞标本分两组(试验刺激组和 试验对照组)，每组5个重复孔，试验刺激组分别加入100 μ L分离好的淋巴细胞、50 μ L 40 μ g/mL的ConA和10%小牛血清的1640培养液；试验对照组分别加入100 μ L分离好 的淋巴细胞、100 μ L10%小牛血清的1640培养液；空白对照组每孔加入200 μ L10%小牛 血清的1640培养液，37°C 5% CO2,温育24小时；
3)加入IOyL MTT (5 μ g/mL)， 继续培养4小时，然后每孔加入 100 μ L10%SDS-0.04mol/L终止液终止反应，37°C 4小时后黑紫色结晶完全溶解后，用酶 联免疫检测仪测定OD63tl值。计算刺激指数(Si)，SI=(试验刺激组-空白对照组)/(试验对照组-空白对照 组)。结果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 疫苗
免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应均显著高于生理盐水组、壳聚糖对照 组、脂质体对照组。4 9组免疫猪的外周血淋巴细胞对ConA刺激后的增殖反应SI均 达到2以上，与生理盐水SI值1.62相比产生显著差异；2、3组与生理盐水组没有显著差
已2、自然杀伤细胞活性(NK)检测 采用2h短程释放改良法
1)取猪前腔静脉血，置于肝素抗凝管中；
2)分离淋巴细胞，10%小牛血清的1640培养基将细胞浓度调整至lX106/mL， 作为检测NK细胞活性的效应细胞，以SP2/0瘤细胞作为靶细胞，培养管用无菌1.5mL Eppondof管，试验设NK自然杀伤组(Mixture)、靶细胞自然释放组(Spon)、最大释放组 (Max)共3组，并各设3只复管；
3)具体加样方法100μ L效应细胞和100 μ L靶细胞，效靶细胞浓度比例为50:1， 作为NK自然杀伤组(Mixture) ； IOOyL靶细胞和2%小牛血清的1640培养液为靶细胞自然释放组(Spon) ； 100 μ L靶细胞和100 μ L 10% TritonX-IOO为最大释放组。加样完 毕，混勻，500 r/m in离心2min，37°C孵育2h，然后各管加冰冷生理盐水50 μ L终止效 靶细胞间细胞毒作用。4)将试验管以3 000r/min离心5min，取上清加于40孔聚苯乙烯微量反应板中 进行酶促反应，100 μ L/孔，置37°C预温20min，各孔加入LDH底物液100 μ L，放于 37°C恒温箱中反应lOmin，取出，各孔加O.lmol/L柠檬酸30 μ L以终止酶促反应，在酶 联免疫检测仪上读取OD63tl值。按以下公式计算自然杀伤细胞的自然杀伤率(％)。此百分率值与自然杀伤细胞 的杀伤活性呈正相关。自然杀伤率=(Mixture管 A63tl 值-Spon 管 A63tl 值)/ (Max 管 A63tl 值-Spon 管 A630 值)
结果表明，pMD-CMV_0RF2、pMD-CMV-ORFl 及 pMD-CMV-ORFl+2 pcrDNA 疫
苗免疫均能够使猪外周血淋巴细胞中NK细胞的杀伤活性明显增强，均达到35%左右， 显著高于对照组。3、T细胞亚群的测定
1)取猪前腔静脉血，置于肝素抗凝管中；
2)分离淋巴细胞，制备脾单个细胞悬液6X106/LIOOyL,经200目钢筛过滤后 1500r/min 离心 5min，弃上清。用荧光洗液(0.15mol/L PBS pH 7.4、2% 葡萄糖、0.1% BSA、0.05%NaN3)洗两遍；
3)用荧光洗液定容100μ L，分别加入PE标记的抗CD4+、FITC标记的CD8a+、 PE-Cy5标记的CD3+，混均后，置4°C避光30min ；
4)取出，用荧光洗液洗2遍，加入300μ L荧光洗液，用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果表明，pMD-CMV_ORF2、pMD-CMV-ORFl及 pMD-CMV-ORFl+2 pcrDNA疫苗免疫均能够使猪外周血淋巴细胞中的Th亚群和Tc亚群的百分含量分别高于 生理盐水组、壳聚糖对照组、脂质体对照组。4 9组猪外周血淋巴细胞中的Th亚群的 百分含量均由生理盐水组的20%上升到近30%，Tc亚群的百分含量也略有升高。本发明的小分子DNA疫苗，只携带真核生物基因转录启动子和目的基因或目的 基因片段，不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA 尾巴、复制起始点等，具有更好生物安全性。由于线性DNA疫苗的整体长度更短，更易 于扩增，同时，扩增的准确性更高，疫苗的效价比也更高。
权利要求
1.一种小分子DNA疫苗，由转录启动子和目的基因构成线性DNA片段，目的基因包 含其起始和终止密码子。
2.根据权利要求1所述的一种小分子DNA疫苗，其特征在于转录启动子为真核基 因转录启动子。
3.权利要求1或2所述小分子DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤1)将转录启动子克隆至含有克隆位点的载体中，得到通用载体；2)将目的基因克隆到通用载体中，得到含有转录启动子和目的基因的重组载体；3)根据通用载体中转录启动子的上游序列设计通用引物，根据目的基因的下游序 列，设计下游引物，以重组载体为模板，扩增由转录启动子和目的基因构成的线性DNA 片断。
4.根据权利要求3所述的小分子DNA疫苗的制备方法，其特征在于含有克隆位点 的载体为多克隆载体。
5.根据权利要求4所述的小分子DNA疫苗的制备方法，其特征在于多克隆载体为 含有多克隆位点的T载体。
全文摘要
本发明公开了一种小分子DNA疫苗及其制备方法，小分子DNA疫苗由转录启动子和目的基因构成线性DNA片断，目的基因包含其起始和终止密码子。与现有DNA疫苗相比，本发明的小分子DNA疫苗，可更快地诱导产生抗体，产生的细胞免疫水平更高。本发明的小分子DNA疫苗，只携带真核生物基因转录启动子和目的基因或目的基因片段，不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA尾巴、复制起始点等，具有更好生物安全性。由于线性DNA疫苗的整体长度更短，更易于扩增，同时，扩增的准确性更高，疫苗的效价比也更高。
文档编号A61P31/20GK102008735SQ20101053563
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者刘燕玲, 宋长绪, 蒋智勇, 蔡汝健 申请人:广东省农业科学院兽医研究所