专利名称：一种hiv免疫原及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种引起广谱中和抗体的HIV免疫原及其制备的疫苗，特别涉及ー种具有广谱保护作用的新型HIV疫苗。
背景技术：
艾滋病是全球所面临的最重大挑战之一，严重危害社会进步与经济增长，已造成 6000多万人被感染，其中3000万人已经死亡，目前存活的感染者约为3320万，其中90%以上的病例发生在发展中国家。迄今为止，在各国政府与国际组织强有力的支持下，世界上先后开展了 100多个临床试验，但尚未有ー个成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困难的ー个主要原因是由于艾滋病病毒的特殊性，即HIV-I具有高度的变异性。以往的疫苗所选择的抗原表位主要是自然感染中的优势抗原表位，而这些抗原表位是HIV-I中变异频率最高的位点。因此， 以这些抗原构建的疫苗诱导出的抗体具有延迟性，无法中和已经发生突变的HIV-I。因此，在艾滋病疫苗研究中所存在的ー个重要问题是如何通过保守免疫原设计来诱导具有广谱保护作用的新疫苗。
发明内容
为了解决现有技术中由于HIV变异频率高而导致的抗体无法中和已经突变的HIV 的问题，本发明提供了ー种HIV免疫原，包括ー种肽序列，所述肽序列中包括HIV的4E10和 /或2F5和/或Z13抗原表位序列中的至少ー个，模拟HIV病毒gp41上MPER区融合前的天然状态，从而使其产生特异性更强的抗体。4E10、2F5和Z13抗原表位序列分别为目前分离得到的广泛中和抗体4E10抗体、2F5抗体和Z13抗体所识别的抗原表位序列，识别高度保守的 HIV-lgp41 近月吴端夕卜部区(membrane proximal external region, MPER)。不论 HIV 病毒如何变异，其gp41近膜端外部区MPER基本保持保守，所以针对该区域设计的免疫原产生的抗体能够避免由于病毒的变异导致的无法中和的问题。其中4E 10能以较低的浓度中和 HIV-I原始病毒株在内22株病毒株的全部亚型病毒，2F5可中和大约67%左右的病毒。同时本发明的免疫原由于具有分枝肽结构，包含多个分枝，分子量较大，能够增强该免疫原的免疫原性，而不需要另外的载体蛋白。本发明中，优选4E10表位序列。更优选所述分枝肽有3至4个分枝均包括4E10表位序列。在一个实施方式中，本发明所述HIV免疫原的上述肽序列可进ー步包括Th細胞表位序列。所述Th細胞表位序列包括PADRE。通过B、T細胞双信号识别，有助于增强机体对抗原的免疫应答，并能产生广谱的保护作用。在一个实施方式中，上述HIV免疫原的分枝肽序列也可进ー步包括破伤风毒素 830-843序列和/或ロ蹄疫病毒200-213序列，以增强其免疫原性。上述HIV免疫原，其中所述肽至少部分分枝被选自乙酰基、酰胺基、烷基羰基和链烯基羰基組成的组中的至少ー种修饰基团修饰。优选乙酰基和/或酰胺基。所述烷基羰基可用通式CH3 (CH2)nCO-表示，其中η可为1-16中的任意整数，优选10、12、14和16。所述链烯基羰基可用通式R(CH2)mCO-表示，其中R为烯基、二烯基或三烯基，例如，CH3(CH2)m, CH = CH-XH3CH2CH = CHCH2CH = CH-XH3CH2CH = CHCH2CH = CHCH2CH = CH ;m 和 m，可为 1-10 中的任意整数，优选7。上述修饰基团可与所述分枝肽的N末端α-氨基、C末端α-羧基或任一氨基酸的侧链基团共价连接。优选N末端α-氨基。在所述分枝肽的末端或侧链添加修饰基团以保护所述分枝肽，防止过早被酶解而影响其免疫原性。上述HIV的4Ε10和/或2F5抗原表位序列、Th细胞表位序列、以及破伤风毒素 830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列优选分别通过柔性序列互相连接，以增加各条链的自由度，协助其形成正确的构象。所述柔性序列包括甘氨酸组成的序列、赖氨酸组成的序列、6-氨基己酰基(Ahx) 组成的序列或它们的组合。优选KKKK-Ahx。优选地，各抗原表位序列侧翼还可加上其天然存在时的侧翼序列。以4E10为例，可以加上其侧翼序列YI，即NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。 优选其N末端被修饰基团修饰，即乙酰基(Ac) -NWFDITNWLffYI-KKKK-Ahx,或酰胺基-NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。本发明优选的HIV免疫原包括N末端乙酰基化或酰胺化的4E10抗原表位序列， 所述柔性序列为KKKK-6-氨基己酰基或两个相连的6-氨基己酰基。本发明还提供了一种HIV疫苗，包括上述任一种免疫原。该HIV疫苗，可进一步包括佐剂，例如包括氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、 细胞因子或明矾，或为油佐剂或水型佐剂。优选油溶剂。本发明的HIV疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、口服给药、肺部给药、鼻腔给药、口腔给药、阴道肛门给药。本领域技术人员可利用本领域公知的技术对其进行配方，以使其适合相应给药方式。本文中不再赘述。优选本发明的HIV疫苗在初次免疫及加强免疫过程中可采用同种抗原核心表位-辅助T细胞表位，也可以同种抗原核心表位-不同辅助T细胞表位交替进行免疫；并可以同种抗原核心表位的多肽疫苗和病毒疫苗交替免疫。本发明的免疫原和疫苗能够激发机体产生对HIV病毒具有广谱中和活性的抗体， 从而克服了现有技术中因为HIV的频繁突变而导致的疫苗产生的抗体无法与突变后的病毒中和的问题。
图1为为本发明优选实施方式的免疫原以及对照肽与抗体结合的Western blot 图。其中左图为电泳之后染色的图，右图为经一抗和二抗结合之后显色的图。其中第1道NK-284E10和2F5双表位线性肽 Ac-NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-NH2第2 道Ac-NK-174E10 表位四分枝肽Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4
第3 道Ac-NK-Acp-16第二批次4E10表位四分枝肽Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4第4 道Ac-NK-16-Ahx-3 对照四分枝肽Ac-NGSGSGKWEGGPSKKK-Ahx-MAP4第5道Ac-NK-16-Ahx-24E 10 表位线性肽Ac-NWFDITNWLffYIKKKK-Ahx-OHー抗B为4E10单克隆抗体
具体实施例方式高度保守的HIV_lgp41近膜端外部区被认为是最具潜力的中和抗体设计靶点。目前为止分离得到的七个广泛中和抗体有三个(2F5，4E10和Z13抗体)是识别该区域的，其中4E10能以较低的浓度中和HIV-I原始病毒株在内22株病毒株的全部亚型病毒，2F5可中和大约67%左右的病毒。这三个抗体QF5，4E10和Z13抗体)所识别的表位分别称为 2F5，4E10和Z13表位。具体而言，2F5表位的氨基酸序列包括下列序列QELLELDKWASLW或其变异序列；4E10表位的氨基酸序列包括下列序列NWFDITNWLW或NWFNITNWLW或此二者的变异序列；Z13表位的氨基酸序列包括下列序列WASLWNWFDITN或其变异序列。下文中结合具体实施例说明了本发明的优势和技术效果。本发明的保护范围以权利要求书限定的为准，实施例仅仅是示例性地说明本发明的理念和原则。实施例1抗原表位的设计选取HIV_lgp41MPER上的4E10和/或2F5识别表位作为抗原表位。合成下列氨
基酸序列
权利要求
1.ー种HIV免疫原，包括ー种肽序列，所述肽序列包括HIV的4E10和/或2F5和/或 Z13抗原表位序列中的至少ー个。
2.如权利要求1所述的HIV免疫原，其中所述肽序列进ー步包括Th細胞表位序列和/ 或破伤风毒素830-843序列和/或ロ蹄疫病毒200-213序列。
3.如权利要求1-2中任一项所述的HIV免疫原，其中所述肽序列至少部分被选自乙酰基、酰胺基、烷基羰基和链烯基羰基组成的组中的至少ー种修饰基团修饰。
4.如权利要求2或3所述的HIV免疫原，其中所述HIV的4E10和/或2F5和/或Z13 抗原表位序列、Th細胞表位序列、以及破伤风毒素830-843序列和/或ロ蹄疫病毒200-213 序列分別通过柔性序列互相连接。
5.如权利要求4所述的HIV免疫原，其中所述柔性序列包括甘氨酸组成的序列、赖氨酸組成的序列、6-氨基己酰基组成的序列或它们的組合。
6.如权利要求5所述的HIV免疫原，所述免疫原包括N末端乙酰基化或酰胺化的4E10 抗原表位序列，所述柔性序列为KKKK-6-氨基己酰基或两个相连的6-氨基己酰基。
7.ー种HIV疫苗，包括如权利要求1-6中任一项所述的免疫原。
8.如权利要求7所述的HIV疫苗，进ー步包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、細胞因子或明矾，或为油佐剂或水型佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种引起广谱中和抗体的HIV免疫原及其制备的疫苗。该HIV免疫原包括一种肽序列，该肽序列中包括HIV的4E10和/或2F5和/或Z13抗原表位序列。本发明的免疫原能够激发针对HIV病毒的广谱中和抗体，克服了现有技术中因为HIV高变异性导致的现有疫苗诱发抗体的延迟性的问题。在动物免疫实验表明，本发明的肽免疫原辅以佐剂可诱导免疫动物血清产生特异性抗体，且所诱导抗体具有广泛中和代表型HIV侵染细胞能力，具有开发成为临床抗HIV疫苗和辅助增强HIV疫苗的潜力。
文档编号A61K39/21GK102558314SQ20101057831
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者单亚明, 孔维, 张丽双 申请人:吉林大学