专利名称：用于预防或治疗过敏原引起的气道疾病的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防或治疗过敏原引起的气道疾病的疫苗。
背景技术：
过敏性哮喘的发病机理还不清楚，然而目前的认识包括⑶4+Th2细胞的扩增，以及对其他无害的环境过敏原耐受的破坏(Romagnani等人J Allergy ClinImmunol 2004 ； 113(3) :395-400)。与环境影响关联的遗传易感性似乎影响Th2介导的应答的正常抑制。 已推测在胎儿和新生儿发育期间肺成熟的异常可引起气道更易感于环境过敏原，从而有利于向Th2表型的极化并因此使个体倾向于特异反应性和哮喘。过敏原引起IL-4、IL-5和 IL-3的产生是典型的过敏性病理以及这种Th2细胞因子的分泌启动B细胞向IgE的同种型类别转换，增加粘液产生和嗜曙红细胞向气道的募集。因为⑶4+Th2细胞在一些过敏症中代表协调细胞(co-ordinating cell)类型，所以这提示对反平衡响应(counterbalancing response)的诱导可防止特应性疾症的后续发展。根据Mrachan’ s卫生假说(hygiene hypothesis) WS-^M (Romagnani 等 Int Arch Allergy Immunol 1992 ；98 (4) 279-85)，接触微生物可激活改变Thl、Th2和Treg应答的先天免疫途径。这导致T辅助细胞2细胞扩增的抑制，以及后续的向IgE的同种型转换的抑制。然而，几项研究已经表明病毒和细菌感染在呼吸道疾病的恶化方面有作用。例如，呼吸道合胞体病毒和Thl诱导恶性百日咳杆菌(Bordetella pertussis)感染(Ennis 等人 Clin Exp Allergy 2004 ；34(9) 1488-97)使动物模型中的过敏性炎症恶化。革兰氏阴性百日咳杆菌引起百日咳，一种在全世界范围内造成重大的幼儿发病率和死亡率的严重呼吸道疾病。尽管通过死的全细胞疫苗(Pw)或更新近的非细胞亚单位疫苗(Pa)的免疫已经成功了，但已报道该疾病在年轻成年人中再度出现(Das P. Lancet Infect Dis 2002 ；2 (6) :322)。通常，百日咳杆菌不会急性感染该年龄组；然而被感染的成年人可起到储主的作用并增加幼儿在接种疫苗前感染该疾病的可能性。最新近的疫苗接种方案要求接种三次，在出生后的2个月开始，是6个月达到最佳保护所需要的。因此，需要一种诱导强烈保护新生儿对抗百日咳杆菌的疫苗。尽管诱导了 Thl免疫，恶性百日咳杆菌感染在过敏原引起的炎症的鼠科模型中恶化气道病理(Ennis 等人 Clin Exp Allergy 2004 ；34 (9) :1488-97)。Th2 诱导的 Pa 疫苗对抗百日咳杆菌诱导的过敏性哮喘的恶化，但在全身或局部水平都诱导IL-13(Ermis等人 Clin Diagn Lab Immunol 2005 ； 12 (3) :409-17)。相反，利用 Thl 诱导 Pw 的全身免疫抑制过敏性气道反应性(Mills等人DevBiol Stand. 1998 ；95 :31-41)，表明过敏原引起的疾病的保护并不是简单的Thl/Th2应答的调节，但与激发时气道损伤的程度有关，以至于在气道上皮间充叶单位的破坏过程中经呼吸道气道的过敏原激发可能是比Thl/Th2/Treg极化更重要的因素。最近，已经开发了一种抗百日咳杆菌的遗传减毒活疫苗BPZEl作为对抗百日咳的候选新生儿疫苗(Mielcarek等人PLoS Pahog 2006 ；2 (7) :e65)。这种活的重组百日咳杆菌菌株在鼻内给药时诱导强烈的局部和全身免疫应答。通过鼻途径给药模拟自然感染并预期在1个月龄以上的孩子中产生长效免疫(Mascart等人，J Immunology 2003 ；170(1) 1504-9)。三种毒性因子已经被确定为减毒的目标百日咳毒素、气管细胞毒素和皮坏死毒素。利用等位基因交换，编码这些毒素的基因被缺失或用遗传灭活的类似物替换以诱导保护，而没有与野生型感染相关的严重病理。然而，施用BPZEl对第三方过敏原激发和过敏原诱导的病理的影响还是未知的。
发明内容
本发明涉及一种用于预防或治疗过敏原引起的气道疾病的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其是气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮坏死毒素(DNT)缺陷的。本发明涉及一种用于预防或治疗受试者中过敏原引起的气道疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其中所述活的减毒百日咳杆菌疫苗是气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮坏死毒素(DNT)缺陷的。本发明还涉及活的减毒百日咳杆菌疫苗在制备用于预防或治疗过敏原引起的气道疾病的药物中的用途，该疫苗是气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮坏死毒素 (DNT)缺陷的。本发明的详细说明过敏原引起的气道疾病的例子是过敏性哮喘、枯草热、间质性肺病(包括肺纤维化)。间质性肺病(包括肺纤维化)可以由职业的或环境的暴露而引起。不受限于理论， TCT、PTX和DNT缺陷的活的减毒百日咳杆菌疫苗会在环境暴露(暴露于引发间质性肺疾病的试剂)期间降低气道损伤和重建(remodelling)并还对抗毒性百日咳杆菌的肺纤维化恶化。“受试者”是指人。通常受试者是新生儿、幼儿或成人。气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮坏死毒素(DNT)缺陷的活的减毒百日咳杆菌疫苗已经记载在 W02007/104451 和 Mielcarek 等人(PLoS Pathog 2006 ；2 (7) :e65)中。最近在分子水平上对百日咳杆菌毒性的认识上的进步已经使得能够合理地设计通过消除或改变在百日咳病理发生中涉及的基因进行减毒的策略。三种毒性因子被遗传靶定气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTC)和皮坏死毒素(DNT)。TCT引起对受感染宿主气管中的纤毛细胞的破坏并因此可以涉及到咳嗽症状。TCT 是革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖的降解产物，其一般通过AmpG转运蛋白内化到细胞溶质中以在细胞壁生物合成过程中被再利用。百日咳杆菌AmpG在肽聚糖降解产物的内化中是无效的。百日咳ampG基因可被大肠杆菌ampG基因替代。得到的菌株表达低于1 %的残留TCT活性。任何来自革兰氏阴性细菌(其释放非常少量的肽聚糖碎片到培养基中)的异源ampG基因可用于本发明中。适合的异源ampG基因的例子包括但不限于来自大肠杆菌 (Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、肠杆菌禾斗(enterobacteriaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)、莫拉克斯氏菌属(Molaxella)、螺杆菌属(Helicobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、军团菌属(Legionella)的 ampG 基因。
PTX是引起百日咳杆菌感染的全身效应的主要毒性因子并由酶促激活的部分(称为Si)和负责与靶细胞受体结合的部分构成。它也是主要的保护性抗原之一。天然PtX基因可被编码酶促失活毒素的突变形式替换。这可通过在Sl中分别地Arg-9被Lys置换和 G1U-U9被Gly置换来实现，它们是两个参与底物结合和催化作用的关键残基。可使用等位基因交换来首先删除Ptx操纵子，然后插入突变形式。
百日咳杆菌培养上清液中相关毒素的存在可通过免疫印记分析检测。也可进行其他突变如美国专利6，713，072中记载的那些，以及能够将毒素活性降低到不可检测的水平的任何已知的或其他突变。等位基因交换还可用于移除dnt基因。尽管DNT在百日咳杆菌毒性中的作用还不确定，但它已在紧密相关的物种支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)中被确认为重要的毒素并在微量注射时显示致死活性。在优选的实施方式中，活的减毒百日咳杆菌疫苗是BPZEl菌株。该BPZEl菌株已于2006年3月9日以编号CNCM 1_；3585保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15，FRANCE)。通常，本发明的活的减毒百日咳杆菌疫苗还可带有异种抗原。该活的减毒百日咳杆菌疫苗可用作载体，以携带至少另外一种编码目标蛋白质的异源核酸序列。通常，由至少另外一种异源核酸序列编码的蛋白质是希望在呼吸道中表达的蛋白质。通常，目标蛋白质可以是针对希望的免疫反应的抗原(如病毒或细菌抗原)。携带异种抗原的活的减毒百日咳杆菌疫苗的例子例如已经被Si Ying Ho等人(Infection and Immunity, 2008, 76 (1), 111-119)公开。本发明的疫苗的制剂可利用本领域公认的方法完成。施用于受试者的本发明疫苗的量和施用的方案可根据药物和兽医领域的技术人员熟知的标准技术在考虑如辅剂(如果存在)、特定受试者的年龄、性别、体重、人种和身体状况以及施用途径的因素的情况下确定。该疫苗的施用常常是单剂的。或者，本发明的疫苗的施用利用该疫苗通过首次(初始接种)接着回忆接种至少一次进行。通常，该疫苗可通过鼻给药或吸入方式施用。这种施用方式成本低而且能够使本发明的活的减毒百日咳杆菌疫苗在呼吸道定殖。鼻给药可以利用液体溶液、悬浮液、乳液形式的活的减毒百日咳杆菌疫苗完成。溶液和悬浮液以液滴施用。溶液也可以作为来自鼻喷雾瓶或来自鼻吸入器的细雾施用。凝胶体分配在含有一次施用所需剂量的小注射器中。吸入可以通过溶液、悬浮液和粉末形式的活的减毒百日咳杆菌疫苗完成；这些制剂通过气溶胶、小滴或干粉吸入器施用。粉末可通过吹药器或吹气器施用。以下，通过如下实施例和
本发明。
图1.减毒的百日咳杆菌BPZEl降低由致敏的过敏原引起的气道病理的严重性。第 38天时来自㈧非致敏的，(B)OVA致敏的，(C)OVA致敏的和百日咳杆菌感染的，(D) OVA致敏的和用BPZEl免疫的肺细支气管横切片的典型形态变化。气道炎症利用固定的肺切片的苏木精和曙红(H&E)染色来检测。原始放大倍率为A、C、E和GX 100，B、F和HX400。
图2.减毒的百日咳杆菌疫苗BP^l降低针对致敏过敏原的粘液增生(mucus hyperplasia)的严重性。第37天时来自(A)非致敏的，(B)OVA致敏的，(C) OVA致敏的和百曰咳杆菌感染的，(D)OVA致敏的和用BPZEl免疫的细支气管横切片中的典型形态变化。 气道炎症利用肺切片上的Discombes/阿尔新蓝(Alcian blue)/PAS复合染色来检测。原始放大倍率为X 400。图3.减毒的百日咳杆菌疫苗BPZEl减少BAL液的细胞浸润。在最终OVA暴露M 小时后，毒性BPSM感染、减毒BPZEl激发和/或OVA致敏对BAL组成的效应。阴性对照是用盐水进行的假感染/致敏。检验BAL液的总细胞数(A)，或嗜中性粒细胞(B)、嗜曙红细胞(C)或淋巴细胞(D)的存在。结果表示为细胞数的平均士S. Ε. M.。乍< 0. 05。图4.减毒的百日咳杆菌疫苗BPZEl减少过敏原诱导的IgE。血清中的OVA特异性IgE应答于OVA致敏和/或毒性(BPSM)或减毒的(BPZEl)百日咳杆菌激发而诱生。在第38天收集血清并通过ELISA测定OVA特异性血清IgE水平。低于100pg/ml的浓度被认为是阴性的。结果表示为平均抗体浓度士S. E.M。P <0.05。图5.脾细胞对OVA的细胞介导免疫应答通过先暴露于减毒(BPZEl)或毒性 (BPSM)百日咳杆菌感染10天后的OVA致敏诱发。负号表示用PBS的假致敏或激发。对于 (A)IL-5、(B)IL-IO、(C) IL-13和(D)IFN-Y显示来自所分析的类似培养物的细胞因子应答。在减去典型地2000-4000cPm的背景后，T细胞增殖(E)表示针对200 μ g/ml的OVA的脾增殖的Acpm。结果表示为平均值士S. Ε. Μ。表1.百日咳杆菌/过敏原致敏的病理特征的总结在非致敏的(对照)、OVA致敏的(OVA)、BPZEl免疫的致敏小鼠(ZeOVA)或BPSM 感染的致敏小鼠(SmOVA)中的气道炎症的特征。
权利要求
1.一种活的减毒百日咳杆菌疫苗，其用于预防法或治疗过敏原引起的气道疾病，所述减活百日咳疫苗是气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮坏死毒素(DNT)缺陷的。
2.如权利要求1所述的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其中，所述过敏原引起的气道疾病选自过敏性哮喘、枯草热和间质性肺疾病。
3.如权利要求1或2所述的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其中，受试者是婴儿或幼儿。
4.如权利要求1-3任一所述的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其中，所述活的减毒百日咳杆菌疫苗是BPZEl菌株。
5.如权利要求1-4任一所述的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其中，所述活的减毒百日咳杆菌疫苗带有异种抗原。
6.如权利要求1-5任一所述的活的减毒百日咳杆菌疫苗，其中，所述活的减毒百日咳杆菌疫苗通过经鼻给药或通过吸入施用。
全文摘要
本发明涉及一种气管细胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮坏死毒素(DNT)缺陷的减活百日咳杆菌疫苗，其用于预防法或治疗过敏原引起的气道疾病。
文档编号A61K39/10GK102448490SQ201080019636
公开日2012年5月9日 申请日期2010年4月26日 优先权日2009年4月28日
发明者伯纳德·马洪, 卡米尔·洛赫特, 希瑟·卡瓦纳 申请人:国家健康与医学研究院, 爱尔兰国立梅努斯大学, 里尔巴斯德研究所