专利名称：核酸递送组合物及其使用方法
技术领域：
本公开书涉及用于转导细胞的组合物和方法。
背景技术：
已经使用各种各样的重组病毒载体、脂质递送系统和电穿孔在体外和体内进行核酸至细胞的递送。这些技术通过敲除基因表达或提供用于基因治疗的遗传构建物设法治疗各种疾病和病症或研究不同的生物系统。聚阴离子寡聚物诸如寡核苷酸不容易跨细胞膜扩散。为了克服培养细胞的这个问题，阳离子脂质与阴离子寡核苷酸结合以帮助摄取。不幸的是，该复合物对细胞通常是有毒的，这意味着必须小心地控制阳离子脂的暴露时间和浓度，以保证活细胞的转染。作为选择性降解mRNA的细胞机理的RNA干扰的发现使得可以靶向操作细胞培养物的表型和发展定向治疗技术(Behlke, Mol. Ther. 13，644-670，2006 ；Xie等人，Drug Discov. Today 11，67_73，2006)。然而，由于它们的大小和负(阴离子)电荷的性质，siRNA 是不能进入细胞的大分子。实际上，siRNA超过了 Lipinski的用于细胞递送膜可扩散分子的“k规则”(Rule of 5s)的25倍，在该规则中，通常膜可扩散分子限制为小于500Da的尺寸。因此，在不存在递送载体或转染剂时，裸露的siRNA不进入细胞，即使在毫摩尔的浓度下也不能(Barquinero等人，Gene Ther. 11 Suppl 1，S3-9，2004)。重要的关注集中在使用阳离子脂质上，其凝聚siRNA并在细胞膜上打孔来解决siRNA的递送问题。尽管已经广泛使用，但转染剂不能实现有效地递送到许多细胞类型，尤其是原代细胞和造血细胞系中(T 细胞和B细胞，巨噬细胞)。而且脂质转染试剂经常导致不同程度的细胞毒性，从肿瘤细胞中的轻度到原代细胞中的高度的细胞毒性。
发明内容
本公开书提供了用于将掩蔽的寡核苷酸或多核苷酸递送到活细胞中的方法和组合物。本发明提供了短暂保护的寡核苷酸或多核苷酸，其包含阴离子电荷中和部分/基团。 在一个实施方案中，所述电荷中和部分包含碱性/阳离子电荷。在另一个实施方案中，所述部分包括沿本发明的三酯保护基团的伯胺、仲胺或叔胺。这些化合物可以通过胞吞或大型胞饮机制进入活细胞的细胞胞质。在一个实施方案中，所述磷酸三酯保护/中和基团当暴露于细胞内环境时，被设计成通过酶活性或通过被动的细胞内方法(例如，PH改变)除去， 以提供能够诱发RNAi应答的寡核苷酸或多核苷酸。因此，本发明提供了可用作治疗剂、诊断剂和作为研究工具的寡核苷酸前药。本公开书提供了 RNAi诱导的单个可溶性核糖核酸碱(SiRNB)分子。在一些实施方案中，siRNB分子与肽转导结构域(PTD)细胞递送肽(PTD-siRNB)缀合，所述肽转导结构域(PTD)细胞递送肽(PTD-siRNB) < 2xl04Da。RNB亚磷酰胺结构单元被改造从而包含生物学可逆的氨基异丁基S-酰基硫代乙基碱性磷酸三酯，其被细胞质硫酯酶特异性地去除， 导致反转为野生型磷酸二酯。自递送的PTD-siRNB在培养的原代和转化细胞的全部群体中诱导快速的RNAi应答，并且在小鼠模型的鼻和上呼吸道中体内诱导RNAi应答。PTD-siRNB 代表一种新型的诱导RNAi应答的单个可溶性分子方式。本公开书提供了伯胺基团形式(pKa > 9. 0)的碱性(正)电荷，其使RNB可溶于水中，并且不会被PTD递送肽从溶液中驱除。本公开书提供了在电荷中和的寡核苷酸中使用的修饰核苷酸。核苷酸包含与核苷酸的磷酸基团缀合的氨基烷基S-酰基硫代烷基(“电荷中和部分”或“N-SATE”)。中和基团协助包含所述修饰的核苷酸的寡核苷酸跨细胞膜运输。一旦被细胞摄取，所述中和基团被例如内源性或外源性硫酯酶去除。在一个实施方案中，用于将N-SATE添加至寡核苷酸(例如，和RNA寡核苷酸)的
结构单元包含电荷中和部分，所述电荷中和部分具有下列通式结构
权利要求
1.一种核苷酸化合物，其包含与所述核苷酸的磷酸基缀合的氨基烷基S-酰基硫代烷基(N-SATE)部分。
2.权利要求1所述的核苷酸，其中所述N-SATE部分包含下述通式结构
3.权利要求1或2所述的核苷酸，其中所述N-SATE部分选自
4.权利要求1或2所述的核苷酸化合物，其中所述N-SATE部分与核酸碱基A、G、C、T 或U任一个的磷酸基缀合。
5.权利要求1、2或4所述的核苷酸，其中当所述核苷酸通过磷酸键与另一核苷酸连接时，连接的主链包含下述通式结构
6.权利要求5所述的核苷酸，其中所述N-SATE部分选自
7.一种寡核苷酸或多核苷酸，其包含具有权利要求1所述的N-SATE部分的核苷酸。
8.权利要求7所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中与缺少N-SATE部分的相同所述寡核苷酸或多核苷酸相比所述寡核苷酸或多核苷酸包含中性或更多的阳离子电荷。
9.包含氨基烷基S-酰基硫代烷基(N-SATE)部分的寡核苷酸或多核苷酸，所述氨基烷基S-酰基硫代烷基(N-SATE)部分减少所述寡核苷酸或多核苷酸主链的净阴离子电荷。
10.权利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含SiRNA 分子。
11.权利要求9或10所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多个修饰的具有N-SATE部分的核苷酸。
12.权利要求9或10所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含多个邻近的具有N-SATE部分的核苷酸。
13.权利要求9或10所述的寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含多个彼此间隔1个或多个核苷酸碱基的具有N-SATE部分的核苷酸。
14.权利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸，其还包含至少一个与所述寡核苷酸或多核苷酸结构域缀合的或可操作连接的蛋白质转导结构域(PTD)，所述蛋白质转导结构域包含膜转运功能。
15.权利要求14所述的寡核苷酸，其包含多个蛋白质转导结构域。
16.一种药物组合物，其包含权利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸。
17.一种在体外或体内将寡核苷酸或多核苷酸递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求16所述的药物组合物或权利要求9所述的寡核苷酸或多核苷酸接触。
18.一种制备权利要求9所述的电荷中性或带阳离子电荷的寡核苷酸的方法，所述方法包括在合成仪中使用具有下述通式结构的亚磷酰胺化学合成所述寡核苷酸
19.权利要求18所述的方法，其中所述合成仪是RNA合成仪。
全文摘要
本发明涉及经修饰具有减少的净阴离子电荷的核酸构建物。所述构建物包含磷酸三酯和/硫代磷酸酯保护基团。本发明还提供了制造和使用这种构建物的方法。
文档编号A61K48/00GK102459302SQ201080034240
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者K·戈戈伊, 史蒂文·F·道蒂, 布莱恩·米德 申请人:加利福尼亚大学董事会