专利名称：通过抑制masp-2依赖性补体活化治疗弥散性血管内凝血的方法
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387-400,2002 ;Holmskov 等，Rev. Immunol· 21: 547-578 (2003) ；Teh等，Immunology 101: 225-232 (2000))。Ikeda 等人首先证明，与 Clq 类似，MBL 在与酵母甘露聚糖包被的红细胞结合时能够以依赖C4的方式使补体系统活化(K. Ikeda等，J.Biol. Chem. ^:7451-7454,1987)。MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员，是钙依赖性凝集素，与具有定位于吡喃糖环赤道面上的3-羟基和4-羟基的糖类结合。因此MBL的重要配体是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合这种空间要求的糖类则对MBL没有可检出的亲和性(Weis, W. I.等,Nature 360:127-134,1992)。MBL和单价糖之间的相互作用是相当微弱的，解离常数通常在2 mM的范围内。MBL通过同时与多个单糖残基相互作用来达到对聚糖配体特异性地紧密结合(Lee, R. T.等,ArcAiκ. Biochem. Biophys. 299:129-136,
1992)。MBL识别通常修饰微生物如细菌、酵母、寄生虫和某些病毒的糖模式。相反，MBL不识别D-半乳糖和唾液酸，即倒数第二位的糖和倒数第一位的糖，它们一般修饰哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的“成熟”糖缀合物。一般认为这种结合特异性有助于保护免于自身活化。然而，MBL确实以高亲和力结合高甘露糖“前体”聚糖簇，这些簇位于被隔离在哺乳动物细胞内质网和高尔基体内的N-连接的糖蛋白和糖脂上(Maynard，I等，J. Biol.Chem. 257:3788-3794，1982)。因此，受损细胞是通过MBL结合的凝集素途径活化的潜在目标。纤维胶凝蛋白(ficolin)具有不同类型的不是MBL的凝集素结构域，称为血纤蛋白原样结构域。纤维胶凝蛋白以不依赖Ca++的方式来结合糖残基。在人体中，已经鉴定出纤维胶凝蛋白的三种类型，即L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白。L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白这两种血清纤维胶凝蛋白共同对N-乙酰-D-葡糖胺具有特异性；然而，H-纤维胶凝蛋白还结合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白和MBL的糖特异性的差异意味着不同的凝集素可能是互补的，尽管有重叠，但是可能靶向不同的糖缀合物。这个观点得到了最新报道的支持，即在凝集素途径的已知凝集素中，只有L-纤维胶凝蛋白与脂磷壁酸特异性结合，脂磷壁酸是一种存在于所有革兰氏阳性菌上的细胞壁糖缀合物(Lynch，N. J.等，7； Immunol. 172:1198-1202，2004)。胶原凝集素(即MBL)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列上没有显著的相似性。然而，两组蛋白质具有类似的结构域组构，与Clq类似，装配成寡聚结构，这样就使得多位点结合的可能性最大化。MBL的血清浓度在健康人群中是高度可变的，这在遗传上是由MBL基因的启动子和编码区二者的多态性/突变所控制的。作为急性期蛋白，MBL的表达在炎症期间进一步上调。L-纤维胶凝蛋白在血清中存在的浓度与MBL类似。因此，凝集素途径的L-纤维胶凝蛋白分途径在力量上可能与MBL分途径不相上下。MBL和纤维胶凝蛋白也可能作为调理素起作用，这需要这些蛋白质与吞卩遼细胞受体相互作用(Kuh I man, M.等，J. Exp. Med. 169:1733,1989 ；Matsushita7M.等,J. Biol. Chem. 271:2448-54,1996)。然而，吞噬细胞上受体的身份还未得到确定。
人MBL通过其胶原样结构域与独特的Clr/Cls样丝氨酸蛋白酶形成特异性、高亲和性的相互作用，称为MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases,MASP)。迄今为止已经描述了三种MASP。首先，鉴定出单一的酶“MASP”，其特征是负责启动补体级联(即切割C2和C4)的酶(Ji，Y. H. m,J. Immunol. 150:571-578，
1993)。随后，发现MASP实际上是两种蛋白酶MASP-I和MASP-2的混合物(Thiel, S.等，Nature 386:506-510,1997)。然而，有研究表明仅MBL-MASP-2复合物就足以使补体活化(Vorup-Jensen, T.等,J. Immunol. 165:2093-2100，2000)。此外，只有 MASP-2 快速切割C2 和 C4 (Ambrus, G.等，J. Immunol. 170:1374-1382，2003)。因此，MASP-2 是负责激活C4和C2以产生C3转化酶C4b2b的蛋白酶。这是不同于Cl复合物的显著差异，Cl复合物中两种特异性丝氨酸蛋白酶(Clr和Cls)协同作用导致了补体系统的活化。最近，已经分离出第三种新的蛋白酶 MASP-3 (Dahl, M. R.等，Immunity 15:127-35，2001)。MASP-1 和 MASP-3是同一基因的可变剪接产物。MASP-I和MASP-3的生物学功能仍有待阐明。MASP与Cl复合物的酶成分Clr和Cls共享相同的结构域组构(Sim，R. B.等，Biochem. Soc. Trans. 28:545，2000)。这些结构域包括 N 末端 Clr/Cls/ 海胆 Vegf/ 骨形成蛋白(CUB)结构域、表皮生长因子样结构域、第二 CUB结构域、串联的补体调控蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。与在Cl蛋白酶中一样，MASP-2的活化通过丝氨酸蛋白酶结构域附近的Arg-Ile键裂解而产生，这将酶分成二硫键连接的A链和B链，后者由丝氨酸蛋白酶结构域构成。最近，描述了 MASP-2的遗传上决定的缺陷(Stengaard-Pedersen, K.等，New Eng. J. Med. 349:554-560，2003)。单个核苷酸的突变导致CUB I结构域的Asp-Gly交换，并使得MASP-2不能与MBL结合。MBL 还与称为 19 kDa MBL 相关蛋白(MApl9) (Stover, C. Μ. , ^ Immunol.162:3481-90，1999)或者小 MBL 相关蛋白(sMAP) (Takahashi，M.等，Int. Immunol.11:859-863,1999)的非酶蛋白缔合。MAp 19通过HSd之基因产物的可变剪接而产生，包括MASP-2的头两个结构域，其后接着是4个独特氨基酸的额外序列。MASP I和姻5P 基因分别位于3号染色体和I号染色体上(SchwaebIe, W.等，Immunobiology 205:455-466,2002)。若干证据表明存在不同的MBL-MASP复合物，且血清中的总MASP的大部分不与MBL 结合(Thiel，S.等,J. Immunol. 165:878-887，2000)。H-纤维胶凝蛋白和 L-纤维胶凝蛋白都与MASP结合,并且激活凝集素补体途径，同MBL —样(Dahl, M. R.等，Immunity15:127-35,2001; Matsushita, Μ.等，J. Immunol. 168:3502-3506，2002)。凝集素途径和经典途径都形成共同的C3转化酶(C4b2b)，这两条途径在这一步会合。普遍认为凝集素途径在宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL参与宿主防御的强有力证据来自于对功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick, D. C.,Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413，2002)。这些患者表现出复发性细菌和真菌感染的易感性。这些症状通常在生命早期在易损表观窗期间是明显的，因为从母体获得的抗体效价降低，但处于全部抗体应答发展之前。这种症状经常是由于MBL胶原部分的数个位点突变引起的，其妨碍了 MBL寡聚体的正确形成。然而，由于MBL可以作为不依赖于补体的调理素起作用，所以还不知道对感染的易感性增加在多大程度上是由于受损的补体活化所致。
尽管大量证据表明在非感染性人类疾病的发病机制中，经典补体途径和替代补体途径两者都存在，但是对凝集素途径作用的评价才刚刚开始。最新研究提供的证据表明，凝集素途径的活化可能是造成缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因。Collard等人(2000)报告受到氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL，且在暴露于人血清时显示出C3沉积(Collard, C. D.等，办 . J. Pathol. 156:1549-1556，2000)。此外，用封闭性抗 MBL 单克隆抗体处理人血清抑制了 MBL结合和补体活化。将这些发现扩展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用对照抗体处理的大鼠，用针对大鼠MBL的封闭性抗体处理的大鼠在冠状动脉闭塞时显示心肌损伤显著较轻(Jordan, J. E.等 ，Circulation 104:1413-1418,2001)。尚不清楚氧化应激后MBL与血管内皮结合的分子机制；最近的研究表明，氧化应激后凝集素途径的活化可能是由MBL与血管内皮细胞角蛋白结合而介导的，而不是与糖缀合物结合(Collard, C. D.等，办 . J. Pathol. 159:1045-1054，2001)。其它研究已显示出缺血/再灌注损伤发病机制中的经典途径和替代途径以及凝集素途径在这种疾病中的作用仍然存在争议(Riedermann, N. C.等，Aa J. Pathol. 162:363-367，2003)。与经典途径和凝集素途径相反，没有发现替代途径中完成识别功能的起始因子(initiator)，而在其它两种途径中是Clq和凝集素来完成识别功能的。目前普遍接受的是，替代途径是由外来表面或其它异常表面(细菌、酵母、病毒感染细胞或者受损组织)自发触发的。有四种血浆蛋白直接参与了替代途径C3、B因子、D因子和备解素。对于替代途径，需要由天然C3蛋白水解形成的C3b发挥作用。由于替代途径C3转化酶(C3bBb)含有C3b作为必需亚基，关于通过替代途径的第一个C3b来源的问题代表了令人困扰的问题，且促使了相当多的研究工作。C3属于含有极少的被称为硫酯键的翻译后修饰的蛋白质家族(还有C4和α -2巨球蛋白)。硫酯基团由谷氨酰胺的末端羰基与三个氨基酸距离的半胱氨酸的巯基相结合所形成。该键不稳定，且谷氨酰胺的亲电子羰基可与其它分子通过羟基或氨基形成共价键。当被隔离在完整C3的疏水口袋内部时，硫酯键是相当稳定的。然而，C3被蛋白酶切割成C3a和C3b，导致C3b上高反应性的硫酯键暴露出来，通过该机制C3b与靶共价结合。除了有大量文件证明C3b与补体靶共价结合的作用外，还有研究认为C3硫酯具有触发替代途径的关键作用。根据普遍接受的“慢转理论(tick-over theory) ”,替代途径是由液相转化酶iC3Bb的形成所启动的，iC3Bb是由C3与水解硫酯(iC3; C3 (H2O))和B因子形成的(Lachmann，P. J.等，Springer Semin. IwmunopathoI. 7:143-162,1984)。C3b 样 iC3 由天然 C3 经蛋白质中内部硫酯的缓慢自发水解而产生(Pangburn, M. K.等Exp. Med. 7^:856-867,1981)。通过iC3Bb转化酶的活性，C3b分子沉积在靶表面，从而启动替代途径。对替代途径活化的起始因子的了解甚少。认为激活因子包括酵母细胞壁(酵母聚糖)、许多纯的多糖、兔红细胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞。这些激活因子所共有的唯一特征是糖类的存在，但是糖类结构的复杂性和多样性使得难以确定共享的分子决定子，这是公认的。对于凝集素/经典途径C3转化酶(C4b2b)，替代途径也可以提供强大的放大环路(amplification loop),因为所产生的任何C3b都能与B因子一起参与形成额外的替代途径C3转化酶(C3bBb)。替代途径C3转化酶通过备解素的结合而稳定。备解素延长了替代途径C3转化酶的半衰期6-10倍。向C3转化酶中添加C3b导致替代途径C5转化酶的形成。
一直以来认为所有三种途径(即经典、凝集素和替代途径)会合于C5，它被裂解形成具有多种促炎作用的产物。会合后的途径被称为末端补体途径。C5a是最有效的过敏毒素，引起平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它也是嗜中性粒细胞和单核细胞两者的强有力的趋化因子和激活因子。C5a介导的细胞活化能够通过诱导释放多种另外的炎症介质来显著放大炎症反应，另外的炎症介质包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和活性氧类别。C5裂解导致了 C5b-9的形成，它也被称为膜攻击复合物(MAC)。目前强有力的证据表明，亚裂解的MAC沉积除了起裂解成孔复合物的作用外，还可能还在炎症中发挥重要作用。发明概述
提供本概述，从而以简化形式引入概念的选择，其在以下发明详述中进一步描述。本概述既不欲鉴定请求保护的主题的关键特征，也不欲用于协助确定请求保护的主题的范围。一方面，本发明提供抑制有生命的受试者中MASP-2依赖性补体活化的不利作用 的方法。该方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂给予有需要的受试者的步骤。在本上下文中，短语“MASP-2依赖性补体活化”是指通过凝集素依赖性MASP-2系统而发生的替代途径补体活化。在本发明的另一方面，MASP-2抑制剂通过凝集素依赖性MASP-2系统抑制补体活化，但基本上不抑制通过经典或Clq依赖性系统的补体活化，从而Clq依赖性系统仍然具有功能。在本发明这些方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂是抗MASP-2抗体或其片段。在其它实施方案中，抗MASP-2抗体具有降低的效应子功能。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂是MASP-2抑制肽或非肽MASP-2抑制剂。另一方面，本发明提供用于抑制MASP-2依赖性补体活化的不利作用的组合物，该组合物包含治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体。本发明还提供制备用于抑制有需要的有生命的受试者中MASP-2依赖性补体活化的不利作用的药物的方法，其包括药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂。本发明还提供制备用于抑制MASP-2依赖性补体活化以治疗下文所述病症、疾病和障碍中每一种的药物的方法。本发明的方法、组合物和药物用于在患有如本文将进一步描述的急性或慢性病理病症或损伤的哺乳动物受试者、包括人中体内抑制MASP-2依赖性补体活化的不利作用。这些疾病和损伤包括但不限于与自身免疫性疾病和/或炎性疾病相关的MASP-2介导的补体活化。在本发明的另一个方面，提供用于抑制受试者中MASP-2依赖性补体活化的方法，所述受试者患有凝血障碍如补体介导的凝血障碍或凝血病、或处于发生凝血障碍如补体介导的凝血障碍或凝血病的风险中，所述方法通过向该受试者给予药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来实施。接受根据本发明的治疗的病症包括(借助于非限制性实例)弥散性血管内凝血("DIC 〃)，也被称作消耗性凝血病。在本发明的一个方面，提供用于抑制受试者中MASP-2依赖性补体活化的方法，所述受试者患有凝血障碍或处于发生凝血障碍的风险中，所述方法包括给予该受试者有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂。在本发明的另一个方面，提供用于抑制受试者中MASP-2依赖性补体活化的方法，所述受试者患有凝血障碍或处于发生凝血障碍的风险中，所述方法包括给予该受试者有效选择性抑制MASP-2依赖性补体活化而基本上不抑制Clq依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂。在本发明的另一个方面，提供制备用于抑制患有补体介导的凝血障碍的有生命的受试者中MASP-2依赖性补体活化的作用的药物的方法，所述方法包括将治疗有效量的MASP-2抑制剂组合在药物载体中。在本发明的另一个方面，提供用于在有需要的受试者中治疗弥散性血管内凝血、预防弥散性血管内凝血或降低弥散性血管内凝血的严重程度的方法，所述方法包括给予该受试者包含有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂的组合物。
通过参考下面的详细描述连同附图，本发明前述的方面以及许多附带的优点将更容易领会，同样也更好理解，其中 图I是图解替代补体途径的补体活化需要凝集素途径依赖的MASP-2活化这一新发现的流程 图2是图解人MASP-2基因组结构的 图3A是图解人MASP-2蛋白的结构域结构的示意 图3B是图解人MApl9蛋白的结构域结构的示意 图4是图解鼠MASP-2敲除策略的 图5是图解人MASP-2微基因构建体的 图6A提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的C4活化丧失的结果，如通过甘露聚糖上C4b沉积缺乏所测定的；
图6B提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的C4活化丧失的结果，如通过酵母聚糖上C4b沉积缺乏所测定的；
图6C提供了证明获自MASP-2 +/-、MASP-2 _/_和野生型品系的血清样品的相对C4活化水平的结果，如通过甘露聚糖和酵母聚糖上的C4b沉积所测定的；
图7A提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的以及替代途径介导的C3活化丧失的结果，如通过甘露聚糖上C3b沉积缺乏所测定的；
图7B提供了证明MASP-2缺乏导致凝集素途径介导的以及替代途径介导的C3活化丧失的结果，如通过酵母聚糖上C3b沉积缺乏所测定的；
图8提供了证明加入鼠重组MASP-2到MASP-2 _/_血清样品中以蛋白浓度依赖的方式恢复了凝集素途径介导的C4活化的结果，如通过甘露聚糖上的C4b沉积所测定的；
图9提供了证明MASP-2 -/-品系中经典途径有功能的结果；
图10提供了证明MASP-2依赖的补体活化系统在腹主动脉瘤修复之后在缺血/再灌注阶段中活化的结果；
图IlA提供了证明抗MASP-2 Fab2抗体#11抑制C3转化酶形成的结果，如实施例24所述；
图IlB提供了证明抗MASP-2 Fab2抗体#11与天然大鼠MASP-2结合的结果，如实施例24所述；
图IlC提供了证明抗MASP-2 Fab2抗体#41抑制C4裂解的结果，如实施例24所述；图12提供了证明经测试抑制C3转化酶形成的所有抗MASP-2 Fab2抗体还被发现抑制C4裂解的结果，如实施例24所述；
图13是表示从用于抗MASP-2封闭性Fab2抗体表位作图的大鼠MASP-2衍生的重组多肽的示意图，如实施例25所述；
图14提供了证明抗MASP-2 Fab2 #40和#60与大鼠MASP-2多肽结合的结果，如实施例25所述；
图15提供了证明肾缺血/再灌注损伤模型中再灌注后24小时和48小时野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠的血尿素氮清除率的结果，如实施例26所述；
图16A提供了证明冠状动脉闭塞和再灌注模型中损伤后野生型(+/+)的梗塞大小及MASP-2 (-/-)小鼠中梗塞大小减小的结果，如实施例27所述；
图16B提供了显示冠状动脉闭塞和再灌注模型中各受试动物的分布的结果，如实施例 27所述；
图17A提供了显示从野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠中分离的RPE-脉络膜复合体中的基线VEGF蛋白水平的结果，如实施例28所述；
图17B提供了显示黄斑变性模型中激光诱发的损伤之后第三天野生型(+/+)和MASP-2(-/-)小鼠的RPE-脉络膜复合体中VEGF蛋白水平的结果，如实施例28所述；
图18提供了显示野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠中激光诱发损伤后第七天平均脉络膜新血管形成(CNV)体积的结果，如实施例28所述；
图19提供了显示野生型(+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠在Col2 mAb诱发类风湿性关节炎后随时间变化的平均临床关节炎评分的结果，如实施例29所述；
图20A是显示sMAP (Map 19)基因定向破坏的示意图，如实施例30所述；
图20B提供了从得自雄性sMAP (-/-)嵌合小鼠与雌性C57B1/6小鼠交配的子代分离的基因组DNA的DNA印迹分析，如实施例30所述；
图20C提供了野生型(+/+)和sMAP (-/-)小鼠的PCR基因型分型分析，如实施例30所述；
图21A提供了 sMAP (-/-)小鼠中sMAP和MASP-2 mRNA的RNA印迹分析，如实施例30所述；
图21B提供了野生型(+/+)和sMAP (-/_)小鼠中编码MASP-2 H链、MASP-2 L链和sMAP的cDNA的定量RT-PCR分析，如实施例30所述；
图22A提供了 sMAP (-/-)即MAp 19 (-/-)的免疫印迹，证实小鼠血清中缺乏MASP-2和sMAP，如实施例30所述；
图22B提供了证明在MBL-MASP-sMAP复合物中检出MASP-2和sMAP的结果，如实施例30所述；
图23A提供了显示野生型(+/+)和sMAP (-/-)小鼠血清中C4沉积在甘露聚糖包被的孔中的结果，如实施例30所述；
图23B提供了显示野生型(+/+)和sMAP (-/-)小鼠血清中C3沉积在甘露聚糖包被的孔中的结果，如实施例30所述；
图24A提供了显示sMAP (-/-)血清中的MBL-MASP-sMAP复合物的重构的结果，如实施例30所述；图24B-D提供了显示rsMAP和MASP_2i竞争性结合MBL的结果，如实施例30所述；
图25A-B提供了显示通过加入rMASP-2而不是rsMAP使C4沉积活性恢复的结果，如实施例30所述；
图26A-B提供了显示通过加入rsMAP来降低C4沉积活性的结果，如实施例30所述； 图27A-C提供了显示MASP-2是造成C3的C4旁路活化的原因的结果，如实施例31所
述；
图28A和图28B提供了在正常大鼠血清中给予MASP-2 Fab2抗体之后C4b沉积的抑制(图28A)和凝血酶活化的抑制的剂量响应曲线，如实施例32中所述；
图29A和图29B提供了在弥散性血管内凝血的局部Schwartzman反应模型中，与未处理的野生型小鼠和其中补体途径被放血剂眼镜蛇毒因子(cobra venom factor, CVF)和终末途径抑制剂(C5aR拮抗剂)抑制的野生型小鼠中的血小板凝集(图29A)相比， MASP-2 (-/-)小鼠中测定的血小板凝集(表示为凝集面积)(图29B)，如实施例33中所述；图30A-30C图示在特异于经典或凝集素途径激活路线的试验中，C4-/-血浆中的C3周转的研究结果；
图31A将平均危险区(area-at-risk，AAR)和梗塞体积(INF)图示为在经历冠状动脉左前降支闭塞和再灌注之后WT(+/+)和MASP-2(-/_)小鼠中的总心肌体积的百分比，如实施例34中所述；
图31B将梗塞体积(INF)与平均危险区(AAR)之间的关联图示为在经历动脉闭塞和再灌注之后WT(+/+)和MASP-2(-/_)小鼠中的左心室心肌体积的百分比，如实施例34中所述；
图3IC图示根据Langendorff分离-灌注小鼠心脏模型制备的WT (+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠的缓冲液灌注心脏中的梗塞体积(INF)，其中全心缺血和再灌注在无血清的情况下进行，如实施例34中所述；
图31D图示根据Langendorff分离-灌注小鼠心脏模型制备的WT (+/+)和MASP-2 (-/-)小鼠的缓冲液灌注心脏中的梗塞体积(INF)与风险区带之间的关联，如实施例34中所述；图32图示在WT(+/+)供体肾的WT(+/+) (B6)或MASP-2 (-/-)移植受体小鼠中测定的血尿素氮(BUN)水平，如实施例35中所述；
图33将WT(+/+)和MASP-2(-/_)小鼠的存活者百分比图示为盲肠结扎和穿刺(CLP)模型中微生物感染后的天数的函数，如实施例36中所述；
图34图示盲肠结扎和穿刺(CLP)模型中微生物感染后在WT(+/+)和MASP-2 (-/-)中测定的细菌数，如实施例36中所述；
图35为Kaplan-Mayer曲线，该曲线图示在用绿脓假单胞菌的鼻内给药激发后6天WT(+/+)>MASP-2 (-/-)和C3(-/_)小鼠的存活百分比，如实施例37中所述；
图36图示在WT小鼠内小鼠抗MASP-2单克隆抗体的O. 3 mg/kg或I. O mg/kg皮下给药之后，在不同时间点取样的样品中C4b沉积的水平，测定为对照的％，如实施例38中所述；图37图示在WT小鼠内小鼠抗MASP-2单克隆抗体的O. 6 mg/kg腹膜内给药之后，在不同时间点取样的样品中C4b沉积的水平，测定为对照的％，如实施例38中所述；
图38图示在用O. 3 mg/kg或I. O mg/kg小鼠抗MASP-2单克隆抗体的单次腹膜内注射预处理的WT(+/+)小鼠中激光诱发损伤后第7天的平均脉络膜新生血管形成(CNV)体积，如实施例39中所述；
图39A图示在用5 X 108/100 μ I脑膜炎奈瑟氏菌0 meningitidis)感染后MASP-2 (-/-)和WT(+/+)小鼠的存活百分比，如实施例40中所述；
图39B图示采自用5X108 cfu/ΙΟΟ μ I脑膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2 ΚΟ(-/_)和WT(+/+)小鼠的血样中在不同时间点重新获得的脑膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml，如实施例40中所述；
图40A图示在用2X108 cfu/ΙΟΟ μ I脑膜炎奈瑟氏菌感染后MASP-2 Κ0(-/_)和WT(+/+)小鼠的存活百分比，如实施例40中所述；
图40B图示采自用2X108 cfu/ΙΟΟ μ I脑膜炎奈瑟氏菌感染的WT(+/+)小鼠的血样中在不同时间点重新获得的脑膜炎奈瑟氏菌的log cfu/ml，如实施例40中所述；以及图40C图示采自用2X108 cfu/ΙΟΟ μ I脑膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-2 (-/-)小鼠的 血样中在不同时间点重新获得的脑膜炎奈瑟氏菌的log cfu / ml，如实施例40中所述。序列表描述
SEQ ID NO:I 人 MAp 19 cDNA
SEQ ID NO: 2人MAp 19蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:3 人 MAp I9 蛋白(成熟)
SEQ ID N0:4 人 MASP-2 cDNA
SEQ ID N0:5人MASP-2蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:6 人 MASP-2 蛋白(成熟)
SEQ ID N0:7 人 MASP-2 gDNA (外显子 1-6)
抗原(关于MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO:8 CUBI 序列(氨基酸 1-121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF 序列(氨基酸 1-166)
SEQ ID NO: 10 C臓GFCUBII (氨基酸 1_293)
SEQ ID NO: 11 EGF 区(氨基酸 122-166)
SEQ ID NO: 12丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸429-671)
SEQ ID NO: 13无活性的丝氨酸蛋白酶结构域(氨基酸610-625，具有Ser618至Ala的突变)
SEQ ID NO: 14 TPLGPKffPEPVFGRL (CUB1 肽)
SEQ ID NO: 15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSS GAKVLATLCGQ (CUBI 肽)
SEQ ID NO: 16 TFRSDYSN (MBL 结合区核心)
SEQ ID NO: 17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (MBL 结合区)
SEQ ID NO: 18 IDECQVAPG (EGF 肽)
SEQ ID NO: 19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (丝氨酸蛋白酶结合核心)详述 肽抑制剂
SEQ ID NO: 20 MBL 全长 cDNA
SEQ ID NO: 21 MBL 全长蛋白
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (共有结合序列)
SEQ ID NO:23 OGKLGSEQ ID NO :24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
SEQ ID NO :25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
SEQ ID NO :26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKL GPOG
SEQ ID NO :27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEO ⑶O (人 h_ 纤维胶凝蛋白)
SEQ ID NO :28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPO GKAGPOGPNGAOGEO (人纤维胶凝蛋白 P35)
SEQ ID NO :29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (C4 裂解位点)
表达抑制剂SEQ ID NO:30 CUBI-EGF 结构域的 cDNA (SEQ ID NO:4 的核苷酸 22_680)
SEQ ID NO:31
5’ CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCC TGGGC 3’ SEQ ID NO:4 的核苷酸 12-45，包括MASP-2翻译起始位点(有义链)
SEQ ID NO:32
5’GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAG AAG 3’，编码含有 MASP-2 MBL 结合位点区域的SEQ ID N0:4的核苷酸361_396 (有义链)
SEQID NO: 33
5’AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCC AAA 3’，编码含有 CUBII 结构域区域的 SEQ IDNO:4的核苷酸610-642克隆引物
SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (用于 CUB 的 5’ PCR)
SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (用于 CUB 的 3’ PCR)
SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (用于 CUBIEGF 的 3’ PCR)
SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT(用于 CUBIEGFCUBII 的 3’ PCR)
SEQ ID NO:38-47是人源化抗体的克隆引物 SEQ ID NO:48是9个氨基酸的肽键 表达载体
SEQ ID N0:49是MASP-2小基因插入序列
SEQ ID N0:50 是鼠 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 51是鼠MASP-2蛋白(w/前导序列)
SEQ ID N0:52是成熟鼠MASP-2蛋白
SEQ ID N0:53 是大鼠 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 54是大鼠MASP-2蛋白(w/前导序列)
SEQ ID N0:55是成熟大鼠MASP-2蛋白
SEQ ID N0:56-59是用于人MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，所述人MASP-2用来产生人MASP-2A
SEQ ID N0:60-63是用于鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，所述鼠MASP-2用来产生鼠MASP-2A
SEQ ID N0:64-65是用于大鼠MASP-2的定点诱变的寡核苷酸，所述大鼠MASP-2用来产生大鼠MASP-2A。
发明详述
本发明基于本发明的发明人预料不到的发现，即需要MASP-2来启动替代补体途径的活化。通过使用敲除小鼠模型MASP-2 -/_，本发明的发明人已显示，通过凝集素介导的MASP-2途径抑制替代补体途径活化而同时保持经典途径的完整是可能的，从而确定了凝集素依赖性MASP-2活化是缺少经典途径的替代补体活化所需要的。本发明也描述了 MASP-2作为治疗靶的用途，用于抑制与凝集素介导的替代补体途径活化有关的细胞损伤而同时保持免疫系统经典(Clq依赖性的)途径成分的完整。I.定义
除非本文明确规定，否则本文使用的所有术语都具有如本发明领域的普通技术人员所 理解的相同含义。为了明确用于本说明书和所附权利要求书中描述本发明的有关术语，提供下列定义。本文所用术语“MASP-2依赖性补体活化”是指经凝集素依赖性MASP-2活化而发生的替代途径补体活化。本文所用术语“替代途径”是指例如由酵母聚糖触发的补体活化，所述酵母聚糖来自真菌和酵母细胞壁、革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞以及来自多种纯的多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞，在传统上一直认为是由来自补体因子C3自发水解产生的C3b而引起的。本文所用术语“凝集素途径”是指通过血清和非血清糖结合蛋白(包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)和纤维胶凝蛋白)的特异性结合而发生的补体活化。本文所用术语“经典途径”是指由抗体与外源颗粒结合而触发的并且需要结合识别分子Clq的补体活化。本文所用术语“MASP-2抑制剂”是指与MASP-2结合或直接与MASP-2相互作用并有效抑制MASP-2依赖性补体活化的任何试剂，包括抗MASP-2抗体及其MASP-2结合片段、天然和合成肽、小分子、可溶性MASP-2受体、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，还包括在凝集素途径中为结合其它识别分子(例如MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)而与MASP-2竞争的肽，但是不包括与这些其它的识别分子结合的抗体。用于本发明方法的MASP-2抑制剂可降低MASP-2依赖性补体活化大于20%，例如大于50%，例如大于90%。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂降低MASP-2依赖性补体活化大于90% (即导致仅仅10%或更低的MASP-2补体活化)。本文所用术语“抗体”包括得自产生抗体的任何哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长类动物)并与MASP-2多肽或其部分特异性结合的抗体及其抗体片段。示例性的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体；多特异性抗体(如双特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的小鼠人、小鼠灵长类、灵长类人单克隆抗体；和抗独特型抗体，且可以是任何完整的分子或其片段。本文所用术语“抗体片段”是指得自或涉及全长抗MASP-2抗体的一部分，一般包括抗原结合区或其可变区。抗体片段的说明性实例包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。本文所用的“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链上。Fv多肽一般还包括Vh与\结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。本文所用术语“嵌合抗体”是含有得自非人物种(如啮齿动物)抗体的可变结构域和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的其余部分来源于人抗体。本文所用术语“人源化抗体”是包含符合源自非人免疫球蛋白的特异性互补决定区的最小序列的嵌合抗体，该特异性互补决定区被植入人抗体构架中。人源化抗体通常是其中只有抗体互补决定区是非人来源的重组蛋白。本文所用术语“甘露聚糖结合凝集素”(“MBL”)等同于甘露聚糖结合蛋白(“MBP”)。本文所用的“膜攻击复合物”(“MAC”)是指插入并破坏膜的5种末端补体成分(C5-C9)的复合物。亦称C5b-9。本文所用的“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、狗、 猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。本文所用的氨基酸残基的缩写如下丙氨酸(Ala ；A)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、精氨酸(Arg ；R)、半胱氨酸(Cys;C)、谷氨酸(Glu ；E)、谷胺酰胺(Gin ；Q)、甘氨酸(Gly ；G)、组氨酸(His ；H)、异亮氨酸(He ；1)、亮氨酸(Leu ；L)、赖氨酸(Lys ；K)、甲硫氨酸(Met ；M)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ；P)、丝氨酸(Ser ；S)、苏氨酸(Thr ；T)、色氨酸(Trp ；ff)、酪氨酸(Tyr ；Y)和丙氨酸(Val ；V)。从最广意义上看，天然存在的氨基酸可根据各个氨基酸侧链的化学特性来分组。“疏水”氨基酸是指lie、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。“亲水”氨基酸是指Gly、Asn、Gin、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的这种组别可进一步细分如下。“不带电荷的亲水”氨基酸是指Ser、Thr、Asn或者Gin。“酸性”氨基酸是指Glu或Asp。“碱性”氨基酸是指Lys、Arg或者His。本文所用术语“保守的氨基酸取代”通过下面每组中氨基酸之间的取代来说明(I)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷胺酰胺和天冬酰胺；(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。本文所用术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。该术语还涵盖由天然存在的核苷酸、糖和核苷间(骨架)共价键以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸所组成的寡核苷酸碱基。II.替代途径新见解
补体的替代途径首先是由Louis Pillemer和他的同事在1950年代初期根据由酵母细胞壁制备的酵母聚糖用来激活补体的研究提出的(Pillemer, L.等，J Exp. Med.103:1-13,1956 ；Lepow, I. H. , 7； Immunol. 125:471-478,1980)。从那时起直到现在，酵母聚糖被认为是人和啮齿动物血清中替代途径的特异性激活因子的标准实例(Lachmann，P. J. ^,Springer Semin. Iimunopathol. 1:143-162,1984 ；Van Di jk, H.等，J. Immunol.Methods 85:233-243,1985 ;Pangburn, Μ. K. ,Methods in Enzymol. 162:639-653,1988)。用于替代途径活化的简便而广泛使用的测定法是将血清与包被在塑料孔中的酵母聚糖一起温育，以测定温育后固相上C3b沉积的量。正如所料，与正常小鼠血清温育之后，在酵母聚糖包被孔中有大量C3b沉积(图7B)。然而，与正常血清相比，得自纯合MASP-2缺陷型小鼠的血清与酵母聚糖包被孔一起温育导致C3b沉积大为减少。此外，在该实验中使用姻5P2基因缺陷型杂合小鼠的血清产生的C3b沉积水平，介于纯合MASP-2缺陷型小鼠血清与正常小鼠血清所得到的C3b沉积水平的中间。使用已知激活替代途径的另一种多糖甘露聚糖包被的孔也获得了类似结果(图7A)。由于除了胤SPJ 基因之外，正常小鼠和MASP-2缺陷型小鼠共享相同的遗传背景，因此这些预料不到的结果表明，MASP-2在替代途径活化方面起着重要作用。这些结果提供了强有力的证据，证明替代途径并非象基本上所有现有的有关补体的医学教科书和最新的综述文章中所描述的那样是不受限制的独立的补体活化途径。现行普遍持有的科学观点是，替代途径是在某些微粒靶(微生物、酵母聚糖、兔红细胞)的表面上被自发的“慢转” C3活化的扩大所激活的。然而，在MASP-2敲除小鼠血清中，通过两种众所周知的替代途径“激活因子”都没有产生显著的替代途径活化，这使得无法通过“慢转理论”来解释补体活化的重要生理机制。由于已知MASP-2蛋白酶具有明确的特异性酶作用，负责凝集素补体级联的启动，因此这些结果提示由酵母聚糖和甘露聚糖导致的凝集素途径的活化是随后替代途径活化 的关键性的第一步。C4b是由凝集素途径产生而不是由替代途径产生的活化产物。与这个观点相一致，正常小鼠血清与酵母聚糖或甘露聚糖包被的孔进行温育时导致了 C4b沉积在孔上，当包被孔与得自MASP-2缺陷型小鼠的血清温育时，这种C4b沉积大大减少(图6A、图6B和图6C)。替代途径除了作为补体活化的独立途径这一被普遍接受的作用之外，还能为最初被经典途径和凝集素途径引发的补体活化提供放大环路(Liszewski，M.K.和J. P.Atkinson, ,散子 Fundamental Immunology,第三版，电 H Paul 编辑，Raven Press,Ltd. , New York ；Schweinie, J. E.等,J. Clin. Invest. 84:1821-1829,1989)。在这种替代途径介导的放大机制中，通过经典或凝集素补体级联活化而产生的C3转化酶(C4b2b)将C3切割成C3a和C3b，从而提供了能够参与形成C3bBb的C3b，C3bBb是替代途径C3转化酶。在MASP-2敲除血清中缺乏替代途径活化可能的解释是，由酵母聚糖、甘露聚糖以及其它推定的替代途径“激活因子”产生的初始的补体活化需要凝集素途径，而替代途径起着放大补体活化的关键作用。换句话说，替代途径是依赖凝集素和经典补体途径用于活化的前馈放大环路，而不是独立的线性级联。补体级联并不是如以前设想的那样通过三条截然不同的途径(经典途径、替代途径和凝集素途径)被激活，我们的结果表明，将补体看成由两个主要系统组成更为准确，大致上相当于补体免疫防御系统的先天性(凝集素)和获得性(经典)的两翼。凝集素(MBP、M-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白)是引发先天性补体系统的特异性识别分子，该系统包括凝集素途径和相关的替代途径放大环路。Clq是引发获得性补体系统的特异性识别分子，该系统包括经典途径和相关的替代途径放大环路。我们将这两个主要的补体活化系统分别称为凝集素依赖性补体系统和Clq依赖性补体系统。除了在免疫防御中的基本作用外，补体系统是造成许多临床疾病的组织损伤的原因。因此，迫切需要开发治疗上有效的补体抑制剂以抑制这些不利作用。如果认识到补体是由两个主要的补体活化系统组成的，则就能够理解我们非常需要的是仅仅特异性抑制引起特定病理的补体活化系统而又不完全停止补体的免疫防御能力。例如，在其中补体活化主要由凝集素依赖性补体系统介导的疾病中，仅特异性抑制该系统将是有利的。这将保持Clq依赖性补体活化系统的完整性以处理免疫复合物加工以及帮助宿主防御感染。在特异性抑制凝集素依赖性补体系统的治疗药物的研发中，优选的作为靶标的蛋白成分是MASP-2。在凝集素依赖性补体系统的所有蛋白成分(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白、MASP-2、C2-C9、B因子、D因子和备解素)中，只有MASP-2是凝集素依赖性补体系统所独有并且是这个系统起作用所必需的。凝集素(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白)也是凝集素依赖性补体系统中独有的成分。然而，这些凝集素成分任一种的丧失并不一定抑制系统活化，这是由于凝集素冗余所致。为了保证抑制凝集素依赖性补体活化系统，抑制所有4种凝集素可能是必要的。此外，由于还已知MBL和纤维胶凝蛋白具有不依赖于补体的调理活性，因此抑制凝集素功能将导致丧失这种有利的抗感染的宿主防御机制。相反，如果MASP-2是抑制靶标的话，这种不依赖于补体的凝集素调理活性会保持完整。MASP-2作为抑制凝集素依赖性补体活化系统的治疗靶的额外好处是，MASP-2的血浆浓度是所有补体蛋白中最低的(约500 ng/ml);因此，为得到完全抑制可能只需要相对低浓度的高亲和性MASP-2抑制剂(Moller-Kristensen，Μ.等，J. Immunol Methods 282:159-167,2003)。III. MASP-2在各种疾病和病症中的作用以及使用MASP-2抑制剂的治疗方法 缺血再灌注损伤
当血流在长期缺血后恢复时会发生缺血再灌注损伤(Ι/R)。它是许多疾病的发病和死亡的共同原因。外科手术患者在主动脉瘤修复术、心肺分流术、与例如器官移植(如心、肺、肝、肾)和/或四肢/指趾再植相关的血管吻合术、中风、心肌梗塞、休克和/或外科手术后的血液动力复苏之后易受其影响。患有动脉粥样硬化疾病的患者易发生心肌梗塞、中风以及血栓诱发的肠和下肢缺血。创伤患者常常遭受四肢一过性缺血。此外，任何原因的大量血液损失都导致全身Ι/R反应。Ι/R损伤的病理生理学是复杂的，至少两个主要因素是造成这个过程的原因补体活化和嗜中性粒细胞刺激和与之相伴的氧自由基介导的损伤。在Ι/R损伤中，补体活化最早记载于30多年前的心肌梗塞期间，并引起了关于补体系统对Ι/R组织损伤的影响的大量研究(Hill，J. H.等，7； Exp. Med. 133:885-900，1971)。目前，不断积累的证据表明，补体是Ι/R损伤中的关键介质。在几种Ι/R动物模型中，补体抑制已经在限制损伤方面获得了成功。在早期的研究中，输注眼镜蛇毒因子之后使得C3耗尽，据报道该C3耗尽在肾脏和心脏的 Ι/R 期间是有利的(Maroko，P. R.等，1978 J Clin Invest. 61:661-670，1978 ;Stein, S. H.等，Miner Electrolyte Me tab. 11:256-61,1985)。然而，可溶形式的补体受体I (sCRl)是用来预防心肌Ι/R损伤的第一种补体特异性抑制剂(Weisman, H. F.等，Science 249:146-51，1990)。心肌Ι/R期间的sCRl治疗减少了梗塞形成，所述梗塞形成与沿冠状内皮沉积的C5b-9复合物的减少和再灌注后的白细胞浸润减少有关。在实验性心肌Ι/R中，在再灌注之前给予Cl酯酶抑制剂(Cl INH)防止了 Clq的沉积并显著减少了心肌坏死面积(Buerke, M.等，Circulation 91:393-402,1995)。遗传上缺失C3的动物在骨骼肌或肠缺血之后，其局部组织坏死较少(Weiser，M. R.等,J.Exp. Med. 183:2343-48,1996)。膜攻击复合物是补体导向的损伤的最后媒介物，C5缺陷型动物的研究表明，I/R损伤模型中局部损伤和较远部位损伤减少(Austen, ff. G. Jr.等，Stfrge/y 126:343-48,1999)。已经证实在鼠肠再灌注开始前后分别给予补体活化抑制剂即可溶性Crry (补体受体相关基因Y)时对于抗损伤是有效的(Rehrig，HJ. Immunol. 167:5921-27，2001)。在骨骼肌缺血模型中，在再灌注开始之后给予时，用可溶性补体受体I (sCRl)同样减少肌肉损伤(Kyriakides, C.等，Am. J. Physiol Cell Physiol. 281: C244-30,2001)。在心肌Ι/R的猪模型中，在再灌注之前用针对过敏毒素C5a的单克隆抗体(“MoAb”)处理的动物显不，梗塞形成减少(Amsterdam, E. A.等，Am J. Physiol. Heart Circ. Physiol.268:H448-57,1995)。用C5 MoAb处理的大鼠证实，心肌中梗塞大小、嗜中性粒细胞浸润和凋亡减少(Vakeva, A.等，Circulation 97:2259-67,1998)。这些实验结果使Ι/R损伤发病机制中补体活化的重要性得到突出。 尚不清楚主要是哪条补体途径(经典、凝集素或替代途径)参与了 Ι/R损伤中的补体活化。Weiser等人根据血管通透性显著降低表明C3和C4敲除小鼠受到保护而免受Ι/R损伤，从而证实了凝集素途径和/或经典途径在骨骼Ι/R期间的重要作用(Weiser，M. R.等，J. Exp. Med. 183:2343-48，1996)。相反，用C4敲除小鼠进行的肾Ι/R实验表明没有显著的组织保护作用，而C3、C5和C6敲除小鼠则受到保护而免受损伤，这表明肾Ι/R损伤期间的补体活化是通过替代途径而发生的(Zhou，I等，J. Clin. Invest.105:1363-71,2000)。Stahl等人最近采用D因子缺陷型小鼠，提供了关于替代途径在小鼠肠 Ι/R 中的重要作用的证据(Stahl, G.等，Am. J. Pathol. 162:449-55，2003)。相反，Williams等人表明C4和IgM (Ragl-/-)缺陷型小鼠中C3的器官染色减少并保护器官免受损伤，从而提出小鼠肠Ι/R损伤开始时经典途径的重要作用(Williams，J. P.等，7； AppLPhysiol. 86:938-42，1999)。在心肌Ι/R模型中，用抗大鼠甘露聚糖结合凝集素(MBL)的单克隆抗体处理大鼠导致缺血后再灌注损伤减轻(Jordan, J. E.等，Circulation 104:1413-18,2001)。MBL抗体还在氧化应激之后，体外减少补体沉积在内皮细胞上，这表明了凝集素途径在心肌I/R 损伤中的作用(Collard, C. D.等，Am. J. Pathol. 156:1549-56，2000)。也有证据表明在一些器官中，Ι/R损伤可能由称为天然抗体的特定类别的IgM以及经典途径的活化所介导(Fleming, S. D.等，/. Immunol. 169:2126-33, 2002 ;Reid, R. R.等，J. Immunol.169:5433-40,2002)。已经开发出几种补体活化抑制剂作为潜在治疗药物，来预防由心肌Ι/R并发症导致的发病率和死亡率。这些抑制剂中有两种即sCRl (TPlO)和人源化抗C5 scFv (培克珠单抗(Pexelizumab))已经完成了 II期临床试验。培克珠单抗还完成了 III期临床试验。尽管TPlO在早期的I/II期试验中具有良好的耐受性，并且对患者有益，但是2002年2月结束的II期试验结果并没有达到初步终点。然而，来自正在进行心内直视手术的高危人群男性患者的数据的亚组分析证实，死亡率和梗塞大小显著降低。在COMA和COMPLY II期试验中，给予人源化抗C5 scFv降低了与急性心肌梗塞有关的总体患者死亡率，但是未能达到初步终点(Mahaffey，K. ff.等，Circulation 108:1176-83，2003)。最近发表了来自最新的抗C5 scFv III期临床试验(PRIM0-CABG)的结果，其用于改进冠状动脉分流术后由手术产生的结果。尽管没有达到此项研究的初步终点，但是此研究证实，术后患者的发病率和死亡率整体下降。
Walsh博士及其同事证实，缺乏MBL、从而缺乏MBL依赖性凝集素途径活化但经典补体途径却充分活化的小鼠受到保护而不受心脏再灌注损伤，结果保护了心脏功能(Walsh等，J. Immunol. 175·· 541-46，2005)。值得注意的是，缺乏经典补体途径识别成分ClqJS是具有完整MBL补体途径的小鼠，无法受到保护而不受损伤。这些结果表明凝集素途径在心肌缺血再灌注损伤的发病机制中具有主要作用。已知补体活化在胃肠缺血再灌注(Ι/R)有关的组织损伤中起着重要作用。Hart及其同事采用GI/R鼠模型的最新研究指出，遗传上缺失MBL的小鼠在胃肠Ι/R后受到保护而不受肠损伤(Hart等，J Immunol. 77^:6373-80，2005)。在胃肠Ι/R后，与未处理MBL缺陷型小鼠相比，在MBL缺陷型小鼠中加入重组MBL显著增加损伤。相比之下，遗传上缺失经典途径识别成分Clq的小鼠，在胃肠Ι/R之后未受到组织损伤的保护。肾Ι/R是急性肾衰竭的重要原因。补体系统似乎基本上参与了肾Ι/R损伤。在最近的一项研究中，de Vries及其同事报道了在实验性肾Ι/R损伤以及临床肾Ι/R损伤进程中凝集素途径被激活(de Vries等，办 . J. Path. 7防:1677-88，2004)。此外，在肾Ι/R进程中，凝集素途径发生在补体C3、C6和C9沉积之前，并且与补体C3、C6和C9沉积共定位。 这些结果表明凝集素途径的补体活化参与了肾Ι/R损伤。因此，本发明的一个方面涉及通过应用药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗经历缺血再灌注的受试者从而治疗缺血再灌注损伤。可通过动脉内、静脉内、颅内、肌内、皮下或其它胃肠外给药，给予受试者MASP-2抑制剂，对于非肽能抑制剂可口服给予，最适合经动脉内或静脉内给药。本发明的MASP-2抑制剂组合物适于在缺血再灌注事件后立即或尽快开始给予。在受控环境下发生再灌注的情况下(例如在主动脉瘤修复术、器官移植或断肢或断指趾或者受伤四肢或指趾的复置术后)，可以在再灌注之前和/或期间和/或之后给予MASP-2抑制剂。为达到最佳治疗效果，可按照医师规定定期重复给药。动脉粥样硬化
有相当多的证据表明，补体活化参与人体动脉粥样化的形成。多项研究令人信服地表明，尽管在正常动脉中没有发生显著的补体活化，但是补体在动脉粥样硬化病变中被大量活化，在易受损和破裂的斑块中尤其突出。在人动脉粥样化中，经常发现末端补体途径的成分(Niculescu, F.等，Mol. Iimunol. 36:949-55. 10-12,1999 ;Rus, H. G.等，ImmunoI.Lett. 20:305-310,1989 ；Torzewski, Μ.等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.18:369-378，1998)。还发现在动脉病变中有C3和C4沉积(Hansson, G. K.等,Acta Pathol.Microbiol. Immunol. Scand. (A) 92:429-35,1984)。C5b_9 沉积的程度与损伤的严重性有关(Vlaicu, R.等，Atherosclerosis 57:163-77,1985)。补体 iC3b、而不是 C5b_9 沉积在破裂和易损斑块上的情况特别严重，这表明补体活化可能是急性冠状动脉综合征的一个因素(Taskinen S.等，Biochem. J. 367:403-12，2002)。在兔实验性动脉粥样化中发现了补体活化先于病变发生前(Seifer, P. S.等，Lab Invest. 60:747-54,1989)。在动脉粥样硬化病变中，补体通过经典途径和替代途径被激活，但是至今还几乎没有补体活化是通过凝集素途径的证据。动脉壁的几个成分可能引发补体活化。可能通过与酶降解LDL结合的C反应蛋白(CRP)来激活补体的经典途径(Bhakdi，S.等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19:2348-54,1999)。与此观点一致的发现是，末端补体蛋白与早期人病变内膜中的CRP共定位(Torzewski, J.等，Arterioscler. Thromb.Vase. Biol. 18:1386-92,1998) o同样地，对病变内的氧化LDL特异性的免疫球蛋白IgM或IgG抗体可能激活经典途径(Witztum, J. L. , Lancet 344:793-95,1994)。从人动脉粥样硬化病变中分离的脂质具有高含量的未酯化的胆固醇，并且能够激活替代途径(SeifertP. S.等，J Exp. Med. 172:547-57,1990)。常常与动脉粥样硬化病变相关的革兰氏阴性菌肺炎衣原体{Chlamydia pneumoniae)也可激活补体替代途径(Campbell L. A.等，J.Infect. Dis. 172:585-8，1995)。动脉粥样硬化病变中存在的其它潜在的补体活化因子包括胆固醇结晶和细胞碎片，这两者都可激活替代途径(Seifert，P. S.等，#o7. Immunol.24:1303-08,1987)ο已知补体活化的副产物具有许多能够影响动脉粥样硬化病变发展的生物学性质。局部补体活化可能诱导细胞裂解并且产生至少一些在晚期病变坏死核心中发现的细胞碎片(Niculescu, F.等，Mol. Immunol. 36:949-55. 10-12,1999) 亚裂解补体活化可能是造成平滑肌细胞增殖以及动脉粥样化形成期间单核细胞浸润到动脉内膜上的重要因素(Torzewski J.等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18:673-77,1996)。补体的持续活化可能是有害的，因为它可能引发炎症并使炎症持续。除了血浆补体成分的浸润夕卜，动脉细胞表达了补体蛋白信使RNA，各种补体成分的表达在动脉粥样硬化病变中被上调 (Yasojima, K.等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21:1214-19，2001)。已经报道的关于补体蛋白缺乏对动脉粥样化形成的影响的研究数量有限。实验动物模型中的结果也不一致。在大鼠中，通过有毒剂量的维生素D诱发的动脉粥样硬化样病变的形成在缺乏补体的动物体内减少(Geertinger P.等，Acta. Pathol.Microbiol. Scand. (A) 78:284-88，1970)。此外，在胆固醇喂养兔中，通过遗传性C6缺乏
(Geertinger, P.等，Artery 1:177-84,1977 ；Schmiedt, ff.等，Arterioscl. Thromb.Vase. Biol. 18:1790-1795，1998)或者通过抗补体药物 K-76 COONa (Saito, Ε·等，J. Drug Dev. 3:147-54，1990)引起的补体抑制，抑制了动脉粥样硬化的发展而又不影响血清胆固醇水平。相反，最近的研究报道了脱脂载脂蛋白E (ApoE)缺陷型小鼠中，C5缺乏不减缓动脉粥样硬化病变的发展(Patel, S.等，Biochem. Biophys. Res. Commun.286:164-70,2001) ο然而在另一项研究中，在存在或不存在下C3缺乏的情况下，对LDLR缺陷型(Idlr-)小鼠的动脉粥样硬化病变的发展进行了评价(Buono, C.等，Circulation105:3025-31，2002)。他们发现动脉粥样化到动脉粥样硬化样病变的成熟部分取决于完整补体系统的存在。因此，本发明的一个方面涉及通过应用药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂来治疗患有或易患动脉粥样硬化的受试者从而治疗或预防动脉粥样硬化。可以通过动脉内、静脉内、鞘内、颅内、肌内、皮下或其它胃肠外给药而给予受试者MASP-2抑制剂，对于非肽能抑制剂可口服给予。可以在受试者诊断出动脉粥样硬化后开始给予或者在发生该病的高危受试者中预防性地给予MASP-2抑制剂组合物。为达到最佳治疗效果，可按照医师规定定期重复给药。其它血管疾病和病症
内皮很大程度上暴露于免疫系统，特别容易受到存在于血浆中的补体蛋白的攻击。研究表明补体介导的血管损伤是心血管系统中若干疾病的病理生理学原因，所述疾病包括动脉粥样硬化(Seifert, P. S.等，Atherosclerosis 73:91-104,1988)、缺血再灌注损伤(ffeisman, H. F. , Science 249:146-51,1990)和心肌梗塞(Tada, T.等，Virchows Arch430:327-332，1997)。有证据表明，补体活化可能扩展到其它血管病中。例如，有证据表明，补体活化是多种形式的血管炎的发病机制的原因之一，包括亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎、与系统性红斑狼疮相关的血管炎、与类风湿性关节炎相关的血管炎(亦称恶性类风湿性关节炎)、免疫复合物型血管炎和无脉症。亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎是具有免疫发病机制的小血管系统性血管炎的一种形式，其中补体通过凝集素途径活化导致C5b_9诱导的内皮损伤被认为是一个重要的机制(Kawana, S.等，Arch. Dermatol.Res. 282:183-7,1990 ；Endo, I 等，Am J. Kidney Dis. 35:401-7，2000)。系统性红斑狼疮(SLE)是影响多种器官的全身性自身免疫性疾病的实例，包括皮肤、肾、关节、浆膜表面和中枢神经系统，常常与严重血管炎有关。在患有活动性SLE患者的血清中存在IgG抗内皮抗体和能够结合内皮细胞的IgG复合物，并且在患有SLE血管炎患者的血管壁上发现了 IgG 免疫复合物和补体的沉积(Cines, D. B.等，J. Clin. Invest. 73:611-25,1984)。与血管炎有关的类风湿性关节炎(亦称恶性类风湿性关节炎)(Tomooka, K. , FukuokaIgaku Zasshi 80:456-66，1989)、免疫复合物型血管炎、与甲型肝炎有关的血管炎、破白细胞性血管炎以及被称为无脉症的动脉炎，构成了另一多型组别的人类疾病，其中针对内皮细胞和其它细胞类型的补体依赖的细胞毒性起着已证实的作用(Tripathy，N. K.等，J.Rheuma to I. 28:805-8,2001)。还有证据表明了补体活化在扩张型心肌病中起作用。扩张型心肌病是以心脏肥大和心脏收缩功能受损为特征的综合征。最新数据表明，心肌中正在发生的炎症可能是疾病发生的原因。已知补体的末端膜攻击复合物C5b_9与免疫球蛋白沉积和TNF-a的心肌表达显著相关。在28名患有扩张型心肌病患者的心肌活检样品中，证实了 C5b-9的心肌积累，这就表明心肌中慢性免疫球蛋白介导的补体活化可能是部分促成扩张型心肌病进程的原因(Zwaka, T.P 等，办 . J. Pathol. 161 (2) :449-57，2002)。因此，本发明的一个方面涉及通过给予包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物 载体中的组合物来治疗血管病，所述血管病包括心血管病、脑血管病、外周(如肌肉骨骼)血管病、肾血管病和肠系膜/肠血管病。认为本发明适用的疾病包括但不限于血管炎，包括亨诺赫一舍恩莱因紫癜肾炎、与系统性红斑狼疮相关的血管炎、与类风湿性关节炎相关的血管炎(亦称恶性类风湿性关节炎)、免疫复合物型血管炎和无脉症；扩张型心肌病；糖尿病性血管病；川崎病(动脉炎)和静脉气体栓塞(VGE)。同样，如果补体活化的发生是作为与心血管介入手术相关的内腔创伤和异物炎症反应的结果，则认为本发明的MASP-2抑制剂组合物还可以单独或与其它再狭窄抑制剂组合，用于抑制支架放置后再狭窄、动脉粥样硬化斑旋切术后再狭窄和/或经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄，所述其它再狭窄抑制剂公开于Demopulos的美国专利第6，492，332号。可以通过动脉内、静脉内、肌内、鞘内、颅内、皮下或其它胃肠外给药给予受试者MASP-2，对于非肽能抑制剂可口服给予。为达到最佳治疗效果，可按照医师规定定期重复给药。对于抑制再狭窄，可以在安置支架或者动脉粥样硬化斑切除术或者血管成形手术之前和/或期间和/或之后给予MASP-2抑制剂组合物。或者，可将MASP-2抑制剂组合物涂敷在支架上或掺入支架中。胃肠疾病溃疡性结肠炎和克罗恩病是炎性肠病(IBD)类别下的慢性肠炎疾病。IBD的特征是未知起因自发发生的慢性复发性炎症。尽管在人体和实验动物两者中对该病都进行了广泛深入研究，但是确切的病理学机制仍有待阐明。然而，有研究认为补体系统在IBD患者中被激活，而且认为补体系统在疾病发病机制中发挥作用(Kolios，G.等，Hepato-Gastroenterology 45:1601-9，1998 ;Elmgreen，J. , Dan. Med. Bull. 33:222，1986)o研究表明，在IBD患者的表层上皮细胞内腔面(luminal face)以及粘膜肌层和粘膜下层血管中发现了 C3b和其它活化的补体产物(Halstensen, T. S.等，Immunol.Res. 10:485-92,1991 ;Halstensen, T. S.等，Gastroenterology 98:1264,1990)。此外，在炎性肠病中发现了特有的多形核细胞浸润，这通常是C5a产生的结果(Kohl，J. , Mol.Immunol. 38:175,2001)。还有报道指出在小型临床研究中(Kitano, A.等，Dis. ColonRectum 35:560,1992)以及在角叉菜聚糖诱发的结肠炎兔模型中(Kitano, A.等，Clin. Exp. Immunol. 94:348-53，1993)，多功能补体抑制剂K-76使溃疡性结肠炎的症状得到改
盡
口 o已表明，一种新的人C5a受体拮抗剂保护大鼠IBD模型免于疾病病理(Woodruff，T.M.等，J. Immunol. 171:5514-20，2003)。将遗传上缺失衰变加速因子(DAF，一种膜补体调控蛋白)的小鼠用于IBD模型中，表明DAF缺乏导致明显更多的组织损伤，而且促炎细胞因子的产生增加(Lin, F.等，7； Immunol. 172:3836-41，2004)。因此，补体调控在肠稳态调节中十分重要，可能是参与IBD发生的主要发病机制。因此，本发明提供用于抑制患有炎性胃肠疾病的受试者的MASP-2依赖性补体活化的方法，该方法通过给予患有这些疾病的患者包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物实施，所述胃肠疾病包括但不限于胰腺炎、憩室炎和肠病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和过敏性肠综合征。可通过动脉内、静脉内、肌内、皮下、鞘内、颅内或其它胃肠外给药来给予受试者MASP-2抑制剂，对于非肽能抑制剂可口服给予。可按照医师的规定适当地定期重复给药以控制待治疗疾病的症状。肺部疾病
许多肺部炎性疾病的发病机制中涉及补体，所述疾病包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(Ware，I 等，况 Engl. J. Med. 342:1334-49，2000);输血相关性急性肺损伤(TRALI)(Seeger, W.等，Blood 76:1438-44,1990);缺血 / 再灌注急性肺损伤(Xiao, F.等，J.Appl. Physiol. 82:1459-65，1997);慢性阻塞性肺病(COPD) (Marc, VLl 等，Am. J.Respir. Cell Mol. Biol.(印刷前的电子出版物)，2004年3月23日)；哮喘(Krug,
I等’Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164:1841-43，2001);韦格纳肉芽肿病(Kalluri,R 等J Am. Soc. Nephrol. 8:1795-800，1997);和抗肾小球基底膜病(古德帕斯彻病)(Kondo, C.等，Clin. Exp. Immunol. 124:323-9,2001)。目前普遍接受的是，许多ARDS的病理生理学涉及炎症级联失调，这种炎症级联开始是作为对感染或其它刺激性事件的正常反应，但是最终引起了宿主显著的自体损伤(Stanley, T. P. ,Emerging Therapeutic Targets 2:1-16,1998)。ARDS 患者几乎全都显不大范围补体活化的证据(补体成分C3a和C5a的血浆水平升高)，补体活化的程度与ARDS的发生和结果有关(Hammerschmidt, D. F.等，Lancet 1:947-49，1980 ;Solomkin, J. S.等，J. Surgery 97:668-78,1985)。各种实验数据和临床数据表明补体活化在ARDS病理生理学中的作用。在动物模型中，补体的系统活化导致急性肺损伤，其组织病理学与在人ARDS中发现的类似(Till，G.Q 等，Am J. Pathol. 129:44-53,1987 ；ffard, P. A. , Am. J. Pathol. 149:1081-86，
1996)。通过一般性补体耗竭或者通过特异性抑制C5a从而抑制补体级联，为急性肺损伤动物模型提供了保护作用(Mulligan, M.S.等，J. Clin. Invest. 98:503-512,1996) 在大鼠模型中，sCRl在补体介导的肺损伤和嗜中性粒细胞介导的肺损伤中具有保护作用(Mulligan, M. S.、Yeh 等，J Immunol. 148:1479-85,1992)。此外，所有补体成分实际上都可通过II型肺泡细胞、肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞在肺中局部产生(Hetland，Os 等，Scand. J. Immunol. 24:603-8,1986 ;Rothman, B. I 等,J Immunol. 145:592-98,
1990)。因此，补体级联定位准确从而显著引起肺部炎症，因此在ARDS中导致肺损伤。哮喘本质上是炎性疾病。变应性哮喘最重要的特征包括对各种特异性和非特异 性刺激的气道高反应性、气道粘液过度产生、肺部嗜酸粒细胞增多以及血清IgE浓度升高。尽管哮喘的起因是多因子的，不过一般认为，它是在遗传易感个体中作为对普通环境抗原不当免疫应答的结果而产生的。文献中大量记载了人哮喘性肺中补体系统被高度激活这一事实(Humbles, A. A.等，Nature 406:998-01, 2002 ;van de Graf, E. A.等，J.Immunol. Methods 147:241-50，1992)。此外，得自动物模型和人体的最新的数据为补体活化是导致疾病发病机制的重要机制提供了证据(Karp, C. L.等,舱t Immunol. 1:221-26,2000 ；Bautsch, W.等，J. Tmmuno/. 165:5401-5, 2000 ;Drouin, S. M.等，J. Tmmunnl.169:5926-33,2 002 ；ffalters, D.M 等，办 . J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:413-18，
2002)。使用慢性真菌性哮喘鼠模型的研究支持凝集素途径在哮喘中的作用。在该哮喘模型中，甘露聚糖结合凝集素的遗传缺陷型小鼠与正常动物相比，气道高反应性发生改变(HogabOam, C. M.等，J. Leukoc. Biol. 75:805-14,2004)。在哮喘中，可通过几种途径激活补体，包括(a)作为变应原抗体复合物形成的结果通过经典途径而被活化；(b)变应原表面上的替代途径活化；(C)凝集素途径通过变应原上结合糖类结构而被活化；以及(d)通过从炎性细胞释放出的蛋白酶切割C3和C5。尽管在哮喘中，还有很多有关由补体所起的复合物作用的方面尚待研究，但是鉴定变应性哮喘发生中所涉及的补体活化途径，可以为开发这种日趋重要的疾病的新治疗策略提供方向。使用动物模型的多项研究证实，C3及其裂解产物C3a在变应型表型发生中的关键作用。Drouin及其同事在卵清蛋白(OVA)/烟曲霉(Aspergillus fumigatus)哮喘模型中使用了 C3缺陷型小鼠(Drouin等，7； Immunol. 167:4141-45，2001)。他们发现，C3缺陷型小鼠当用变应原攻击时，与匹配的野生型对照小鼠相比，AHR和肺嗜酸粒细胞增多的减少。此夕卜，这些C3缺陷型小鼠显著地减少产生IL-4的细胞的数目，并且削弱Ag特异型IgE和IgGl应答。Taube及其同事在OVA哮喘模型中，通过使用可溶性重组形式的小鼠补体受体Crry，在C3和C4水平阻断补体活化方面,得到了类似的结果(Taube等，J. Respir. Crit.Care Med. 168:1333-41，2003)。Humbles及其同事在小鼠中剔除了 C3aR以检查C3a在嗜酸性粒细胞功能中的作用(Humbles等，形:998-1001，2000)。他们使用OVA哮喘模型，观察到对于气溶胶化乙酰甲基胆碱几乎得到完全保护而不发生AHR。Drouin及其同事(2002)曾在OVA/烟曲霉哮喘模型中使用C3aR缺陷型小鼠，并且证实变应性反应的减弱与肺中AHR减轻、嗜酸性粒细胞募集、TH2细胞因子产生和粘液分泌减少以及Ag特异型IgE和IgGl应答减弱的C3缺陷型动物非常相似(Drouin等，J. Immunol. 7你:5926-33，2002)。Bautsch及其同事使用天然缺失C3aR的豚鼠品系进行了研究(Bautsch等，7； Immunol.7^:5401-05,2000)。他们使用OVA变应性哮喘模型，观察到在抗原攻击后受到显著保护而免于气道支气管收缩。近来多项使用动物模型的研究证实了 C5及其裂解产物C5a在变应型表型发生中的关键作用。Abe及其同事报道了 C5aR活化与气道炎症、细胞因子产生和气道反应性相关的证据(Abe等，J. Immunol. 7^7:4651-60,2001)。在他们的研究中，通过可溶性CRl、(补体活化抑制剂)futhan或合成的六肽C5a拮抗剂来抑制补体活化，阻断了炎症反应和对乙酰甲基胆碱的气道反应性。在采用阻断抗C5单克隆抗体的研究中，Peng及其同事发现在OVA哮喘模型中，C5活化基本上是造成气道炎症和AHR的原因(Peng等，J. Clin.Invest. 775:1590-1600,2005)。Baelder及其同事同样也报道了 C5aR的阻断基本上减轻了烟曲霉哮喘模型的 AHR (Baelder 等，7； Immunol. 77^:783-89,2005) 此外，C3aR 和 C5aR两者的阻断显著减轻了气道炎症，如BAL中嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数目减少所证实 的一样。尽管以上罗列的研究突出了补体因子C3和C5及其裂解产物在实验性变应性哮喘发病机制中的重要性，但是这些研究没有提供有关三条补体活化途径中每一条所起作用的资料，因为C3和C5是所有三条活化途径共有的。然而，Hogaboam及其同事的最新研究表明，凝集素途径可能在哮喘发病机制中具有主要作用(Hogaboam等，7； Leukocytye Biol.75:805-814，2004)。这些研究使用甘露聚糖结合凝集素-A (MBL-A，一种起着凝集素补体途径活化识别成分的作用的糖结合蛋白)遗传缺陷型小鼠。在慢性真菌性哮喘模型中，在用烟曲霉分生孢子i. t.攻击后的第4天和第48天，检查MBL-A (+/+)和MBL-A (-/-)烟曲霉敏化小鼠。与敏化MBL-A (+/+)组相比，敏化MBL-A (-/-)小鼠在分生孢子攻击后的两个时间段上，AHR都显著减缓。他们发现与野生型动物组相比，烟曲霉敏化MBL-A(-/-)小鼠肺中的TH2细胞因子水平(IL-4、IL-5和IL-13)在分生孢子攻击后第4天显著降低。他们的结果表明，在慢性真菌性哮喘期间MBL-A和凝集素途径在AHR的发生和持续中具有主要作用。最新的特异性MBL多态性与哮喘发生之间相关性的临床研究的结果进一步为凝集素途径可能在该病中起着重要病理作用提供了证据(Kaur等，ExperimentalImmunol. 7幻:414-19，2006)。个体间MBL的血浆浓度变化很大，这主要归结于MBL基因内的遗传多态性。他们发现携带至少一个拷贝的使MBL表达上调2-4倍的特异性MBL多态性的个体，发生支气管哮喘的风险增加了几乎5倍。在携带该MBL多态性的支气管哮喘患者中，这也是疾病严重性增强的标志。因此，本发明的一方面提供用于治疗肺部疾病的方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有肺部疾病的受试者实施，所述疾病包括但不限于急性呼吸窘迫综合征、输血相关性急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、慢性阻塞性肺病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(古德帕斯彻病)、胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、烧伤继发性急性肺损伤、非心源性肺水肿、输血相关的呼吸抑制和肺气肿。可以全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或者其它胃肠外给药，或者对于非肽能药物可通过口服给药。MASP-2抑制剂组合物可以与一种或多种另外的治疗药物组合，另外的治疗药物包括抗炎药、抗组胺药、皮质类固醇或者抗微生物药。可按照医师规定重复给药直到疾病消退。体外循环
有许多医学手术在其实施期间要从患者循环系统转移血液(体外循环系统或ECC)。这些手术包括血液透析法、血浆除去法、白细胞除去法、体外膜式氧合(ECMO)、肝素诱导的体外膜式氧合LDL沉淀(HELP)和心肺分流术(CPB)。这些手术将血液或血液产物暴露给可能改变正常细胞功能和止血的外源表面。在最早的研究中，Craddock等人鉴定出补体活化是血液透析期间粒细胞减少的可能原因(Craddock, P. R.等，N. Engl. J. Med.296:769-74,1977) 0从1977年到现在，无数研究结果表明，进行血液透析或CPB的患者所经受的许多不良事件是由补体系统活化引起的(Chenoweth, D. E. , Ann. N. Y. AcadScL 516:306-313，1987 ;Hugli，^,Complement 3:111-127，1986 ;Cheung，A. K. ,J. Am.Soc. Nephrol. 1:150-161，1990 ;Johnson，R. J. , Nephrol. Dial. Transplant 9:36-45 1994)。例如，已经表明补体活化潜力是确定血液透析器与肾功能恢复、易感染性、肺功能障碍、肾衰竭患者的发病率和存活率方面的生物相容性的重要标准(Hakim，R. M.，KidneyInt. 44:484-4946,1993)。在很大程度上认为，通过血液透析膜的补体活化是通过替代途径机制而发生的，这是由于 C4a 产生很少(Kirklin, J. K.等，J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 86:845-57,1983 ；Vallhonrat, H.等，J. 45:113-4，1999)，但是最新研究提出可能还包括经典途径(ffachtfogeI, Y.T.等,Blood 73:468-471,1989)。然而，对启动和控制人工表面(包括生物医药用聚合物)上补体活化的因素了解得仍然不够。例如，已将用于血液透析中的铜仿膜(Cuprophan membrane)归类为非常有效的补体活化因子。尽管不希望受理论束缚，但是本发明的发明人还是推测这也许可部分通过其多糖性质来解释。在本专利中所鉴定的MASP-2依赖性补体活化系统提供了一种机制，由此凝集素途径的活化便引发了替代途径活化。在CPB期间进行ECC的患者遭受全身性炎症反应，这部分是由血液暴露于体外环路的人工表面而引起的，但也是由不依赖于表面的因素象外科创伤和缺血再灌注损伤引起的(Butler, J.等，Ann. Thorac. Surg. 55:552-9,1993 ;Edmunds, L. H. , Ann. Thorac.Surg. 66 (增刊)S12-6，1998 ;Asimakopoulos，G. , Perfusion 14:269-77，1999)。CPB引发的炎症反应可能导致术后并发症，一般称为“灌注后综合征”。在这些术后事件中有认知缺陷(Fitch, J.等，Circulation 100 (25) : 2499-2506，1999)、呼吸衰竭、出血性疾病、肾功能障碍，最严重的情况下为多器官衰竭(Wan，S.等，Chest 112:676-692，1997)。与没有CPB但是有相应程度外科创伤的手术相比，有CPB的冠状旁路手术导致了更多的补体活化(E. Fosse, 1987).因此，这些CPB相关问题主要的疑似因素是旁路手术期间的补体活化不当(Chenoweth, K.等，况 Engl. J. Med. 304:497-503,1981 ;Haslam. P等，Anaesthesia 25:22-26,1980 ；J. K. Kirklin 等，J. Thorac. Cardiovasc. Surg.86:845-857,1983 ；Moore, F. D.等，Ann. Surg 208:95-103,1988 ；Steinberg. J 等，J.Thorac. Cardiovasc. Surg 106:1901-1918,1993) 在 CPB 环路中，替代补体途径在补体活化中发挥了主要作用，这是血液与CPB环路人工表面之间相互作用的结果(Kirklin，J. K.等，/ Thorac. Cardiovasc. Surg. ,86:845-57,1983 ；Kirklin, J. K.等，Ann.Thorac. Surg. 41:193-199，1986 ;Vallhonrat H 等，7； 45:113-4，1999)。然而，也有证据表明CPB期间经典补体途径被激活(Wachtfogel，Y. T.等，Blood 73:468-471，1989)。主要的炎症物质是在补体系统活化后产生的，包括过敏毒素C3a和C5a、调理素C3b和膜攻击复合物C5b-9。C3a和C5a是嗜中性粒细胞、单核细胞和血小板的有效刺激物(Haeffner-Cavai I Ion, N.等，J. Immunol. , 139:794-9,1987 ;Fletcher, M. P.等，Am. J. Physiol. 265:H1750-61,1993 ；Rinder, C. S 等，7； Clin. Invest. 96:1564-72，1995 ；Rinder, H 等，Circulation 100:553-8,1999) 这些细胞的活化导致促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF a )、氧自由基和蛋白酶的释放(Schindler, R 等，Blood 76:1631-8,1990 ；Cruickshank, A.M.等，Clin ScL (Lond) 79:161-5,1990 ；Kawamura, T.等，Can. J. Anaesth. 40:1016-21,1993 ；Steinberg, J. B.等，J. Thorac.Cardiovasc. Surg. 106:1008-1,1993 ;Finn, A.等，J. Thorac. Cardiovasc. Surg.105:234-41,1993 ；Ashraf, S. S.等，J. Cardiothorac. Vase. Anesth. 11:718-22,1997)。已经表明C5a使多形核细胞(PMN)中Mac-I的粘着分子⑶Ilb和⑶18上调，并诱导 PMN脱粒以释放促炎酶(Rinder, C.等，Cardiovasc Pharmacol. 27 (增刊 I) : S6-12,1996 ；Evangelista, V.等，93:876-85,1999 ;Kinkade, J. M. , Jr.等，Biochem. Biophys.Res. Commun. 114:296-303，1983 ;Lamb，N. J 等，frit Care Med. 27:1738-44,1999 ；Fujie, K 等，及/r. J. Pharmacol. 374:117-25，1999)。C5b_9 诱导血小板上的粘着分子 P选择蛋白(CD62P)的表达(Rinde, C. S.等，J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:460-6,
1999)，而C5a和C5b-9两者都诱导内皮细胞上P选择蛋白的表面表达(Foreman, K. E.等，J. Clin. Invest. 94:1147-55，1994)。这些粘着分子参与白细胞、血小板和内皮细胞之间的相互作用。粘着分子在活化内皮细胞上的表达是活化白细胞汇集的原因，然后介导组织炎症和损伤(Evangelista, V. , Blood 1999 ；Foreman, K. E. , ^ Clin. Invest. 1994 ；Lentsch, A. B.等，J. Pathol. 190:343_8，2000)。正是这些补体活化产物对嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板和其它循环细胞的作用才可能导致在CPB后出现各种问题。正在研究若干补体抑制剂在CPB中的潜在应用。它们包括可溶性重组补体受体 I (sCRl) (Chai,等，Circulation 101:541-6，2000)、人源化单链抗 C5 抗体(h5Gl. 1-scFv 或培克珠单抗)(Fitch, J. C. K.等，Circulation 100:3499-506，
1999)、人膜辅因子蛋白和人衰变加速因子的重组融合杂合体(CAB-2) (Rinde, C. S.等，Circulation 100:553-8,1999)、13 个残基的 C3 结合环妝(Compstatin) (Nilsson, B 等，Blood 92:1661-7,1998)和抗 D 因子 MoAb (Fung, M.等，J. Thoracic Cardiovasc.Surg. 122:113-22，2001)。SCRl和CAB-2在C3和C5活化步骤抑制经典和替代补体途径。Compstatin在C3活化步骤抑制两条补体途径,而h5Gl. 1-scFv仅在C5活化步骤抑制两条补体途径。抗D因子MoAb在C3和C5活化步骤抑制替代途径。然而，这些补体抑制剂都不会特异性抑制本专利所鉴定的MASP-2依赖性补体活化系统。已经报道了大有希望的III期临床研究的结果，研究人源化单链抗C5抗体(h5Gl. 1-scFv,培克珠单抗(pexelizu mab))在降低围手术期MI和冠状动脉旁路移植(CABG)手术死亡率中的功效和安全性(Verrie, E. D.等JAJM 291:2319-27，2004)。与安慰剂相比，培克珠单抗(pexelizu mab)与已实施CABG手术的2746名患者中的最终死亡或MI混合风险的显著降低没有关联。然而，在进行包括或不包括瓣膜手术的CABG手术的所有3099名患者中，术后30天有统计学上的显著降低。由于培克珠单抗(pexelizu mab)在C5活化步骤抑制C5a和sC5b-9的产生，但是对其它两种有效的补体炎性物质C3a和调理素C3b的产生没有影响，亦知C3a和C3b是CPB引发的炎症反应的原因。因此，本发明的一个方面涉及通过应用包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物来治疗进行体外循环手术的受试者，从而预防或治疗体外暴露所引发的炎症反应，所述受试者包括进行血液透析、血浆除去法、白细胞除去法、体外膜式氧合(ECMO)、肝素诱导的体外膜式氧合LDL沉淀(HELP)和心肺分流术(CPB)的患者。认为按照本发明方法的MASP-2抑制剂治疗可用于降低或预防有时由CPB手术引起的认知功能障碍。可在手术之前和/或手术之中和/或手术之后，通过例如动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药给予受试者MASP-2抑制剂。或者，可在体外循环期间将MASP-2抑制剂引入受试者血流中，例如通过将MASP-2抑制剂注射到血液通过或流过其进行循环的管或膜中，或者通过使血液与涂敷有MASP-2抑制剂的表面例如管、膜的内壁或其它表面如CPB装置相接触。
炎性关节炎和非炎性关节炎以及其它肌肉骨骼疾病
各种各样的风湿性疾病的发病机制中涉及补体系统的活化；包括类风湿性关节炎(Linton, S.l 等,Molec. Immunol. 36:905-14,1999)、青少年类风湿性关节炎(Mollnes,T. E.等，Arthritis Rheum. 29:1359-64,1986)、骨关节炎(Kemp, P. A.等，J. Clin.Lab. Immunol. 37:147-62,1992)、系统性红斑狼疮(SLE) (Molina, H. ,Current Opinionin Rheuma to I. 14:492-497, 2002)、贝赫切特综合征(Behcet’s syndrome) (Rumf eld,ff. R.等,Br. J. Rheuma to I. 25:266-70,1986)和斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)(Sanders, M. E.等，J. Tmmuno/. 138:2095-9,1987)。很有说服力的证据表明，免疫复合物引发的补体活化是造成类风湿性关节炎(RA)组织损伤的主要病理机制。许多出版物记载了 RA患者血浆中补体活化产物增加(Morgan, B. P.等，Clin. Exp. Immunol， 73:473-478,1988 ;Auda, G.等，RheumatoI.Int. 10:185-189,1990 ；Rumfeld, IR 等，Br. J. Rheumatol. 25:266-270，1986)。还在发炎的风湿性关节中发现了如C3a、C5a和sC5b_9的补体活化产物，并且已经确定补体活化程度和 RA 严重性之间正相关(Makinde，V.A.等，如/ . Rheum. Dis. 48:302-306，1989 ;Brodeu, J. P.等，Arthritis Rheumatism 34:1531-1537,1991)。在成人和青少年类风湿性关节炎中，替代途径补体活化产物Bb的血清和滑液水平比C4d (经典途径活化的标记)的高，表明补体活化主要是由替代途径介导的(El-Ghobarey, A. F.等，J. Rheumatology1:453-460,1980 ；Agarwal, A.等，Rheumatology 39:189-192,2000)。补体活化产物可直接损伤组织(通过C5b-9)或者经过敏毒素C3a和C5a募集炎性细胞而间接介导炎症。实验性关节炎的动物模型已被广泛用来研究补体在RA发病机制中的作用。在RA动物模型中，通过眼镜蛇毒因子耗尽补体防止了关节炎的发生(Morgan，K. ArthritisRheumat. 24:1356-1362，1981 ;Van Lent, P. L.等，Am. J. Pathol. 140:1451-1461，1992)。将可溶形式的补体受体I (sCRl，一种补体抑制剂)注射到关节内，抑制了 RA大鼠模型中的炎症(Goodfellow, R. M.等，Clin. Exp. Immunol. 110:45-52,1997)。此外，sCRl抑制大鼠胶原诱发性关节炎的发生和进程(Goodfellow,R. M.等,Clin Exp. Immunol.119:210-216,2000)。可溶性CRl在替代途径和经典途径的C3和C5活化步骤抑制经典和替代补体途径，从而抑制C3a、C5a和sC5b_9的产生。1970年代后期，认识到用异种II型胶原(CII ;人关节软骨的主要胶原成分)免疫啮齿动物导致十分类似于人RA的自身免疫性关节炎(胶原诱发性关节炎，或者CIA)的发生(Courtenay, J. S.等，Nature 之幻666-68,1980 ;Banda 等，J of Immunol. 171:2109-2115 (2003))。在易感动物中，自身免疫应答涉及各因素的复杂组合，包括特定的主要组织相容性复合物(MHC)分子、细胞因子和CII特异性的B细胞和T细胞应答(有关综述见Myers, L. K.等，Life Sciences汾1861-78，1997)。几乎40%的近交系小鼠的补体成分C5完全缺乏的观察结果(Cinade，B.等，7； Exp. ifed 7%: 897-902，1964)，为通过对C5缺陷型与C5充足型品系之间进行CIA比较从而研究补体在该关节炎模型 中的作用提供了间接的机会。这些研究结果表明，足够的C5绝对是CIA发生所必需的(Watson等，1987 ;Wang, Y.等,J.4340-4347, 2000)。通过使用抗 C5 单克隆抗体(MoAb)还为C5和补体在RA中的重要性提供了进一步的证据。在鼠CIA模型中经腹膜内预防性给予抗C5MoAb几乎完全防止了疾病的发生，而在活动性关节炎期间的治疗则产生显著的临床益处和更轻微的组织学疾病(Wang, Y 等，Proc_ Natl. Acad. Sci. USA 92:8955-59,1995) 通过使用最近开发出的一种炎性关节炎模型K/BxN T细胞受体转基因小鼠的研究，提供了关于补体活化在疾病发病机制中的潜在作用的更深入的认识(Korganow，A. S.等，Immunity 70:451-461，1999)。所有K/BxN动物都自发产生自身免疫性疾病，该病具有人RA的大多数(尽管不是全部)临床、组织学和免疫学特征。此外，将患关节炎的K/BxN小鼠的血清转移到健康动物中，通过关节炎形成免疫球蛋白(arthritogenicimmunoglobulin)的转移在几天之内便引起关节炎。为了鉴定疾病发生所需要的特定补体活化步骤，将关节炎K/BxN小鼠的血清转移到各种遗传上缺失特定补体途径产物的小鼠中(Ji, H.等，J遞KWi汴7仏157-68，2002)。有趣的是，研究结果证明替代途径活化是至关重要，而经典途径活化则可有可无。此外，C5a的形成至关重要，因为C5缺陷型小鼠和C5aR缺陷型小鼠均受到保护免于发病。与这些结果相一致的是，以前的研究曾报道了 C5a受体表达的遗传缺失保护小鼠不患关节炎(Grant, E. P 等，7； Exp. Med. 7^:1461-1471,2002) 美国康涅狄格州纽黑文市的Alexion Pharmaceuticals公司正在开发防止人补体成分C5裂解成其促炎成分的人源化抗C5 MoAb (5G1. I)，作为RA的潜在治疗方法。两个研究小组独立地提出，凝集素途径通过MBL与特异性IgG糖形(glycoform)的相互作用促进 RA 患者的炎症(Malhotra 等，Tfet Med. 1:237-243,1995 ；Cuchacovich等，J. Rheuma to I. 23:44-51,1996)。RA与分子的Fe区缺乏半乳糖的IgG糖形(称作IgGO糖形)的显著增加有关(Rudd 等,Biotechnology 忽:524-30, 2004)。IgGO 糖形的百分比随疾病进程而增加，并且当患者进入缓解期时回复到正常。在患RA的个体中，IgGO体内沉积在滑膜组织上，MBL则以高水平存在于滑液中。聚集在与RA有关的成簇IgG上的无半乳糖IgG (IgGO)，可以与甘露糖结合凝集素(MBL)结合并激活补体的凝集素途径。此夕卜，着眼于RA患者中的MBL等位变体的最新临床研究的结果表明，MBL在该病中可具有促炎作用(Garred等，J Rheumatol. 27:26-34,2000) 因此，凝集素途径在RA发病机制中可具有重要作用。系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因不明的自身免疫性疾病，它导致产生自身抗体、形成循环免疫复合物以及暂时不受控制地激活补体系统。尽管SLE中自身免疫性的起因仍然令人困惑，但是现在有相当多的资料表明补体活化是造成该病血管损伤的重要机制(Abramson, S. B.等，Hospital Practice 107-122,1998)。该病中涉及补体的经典途径和替代途径两者的活化，C4d和Bb都是中度至严重狼疮疾病活性的敏感标志(Manzi，
S.等,Arthrit. Rheumat. 39:1178-1188,1996^妊娠期间替代补体途径的活化伴有系统性红斑狼疮疾病突发(Buyon，J. P.等,Arthritis Rheum.忍:55-61，1992)。此外，凝集素途径可能也是引起疾病发生的原因，因为最近在SLE患者的血清中鉴定出针对MBL的自身抗体(Seelen, M. A.等，Cl in Exp. Immunol. 335-343, 2003)。认为通过经典途径的免疫复合物介导的补体活化是SLE患者中发生组织损伤的一种机制。然而，经典途径补体成分在遗传上的缺乏增加了狼疮和狼疮样疾病的风险(Pickering, M. C.等，Adv. Immunol.炻:227-324，2000)。80% 以上发生 SLE 或相关综合征的人完全缺乏Clq、Clr/Cls、C4或C3。这表示狼疮中协调补体有害效应与保护性效应时存在明显的相互矛盾。
经典途径的重要活性似乎是促进免疫复合物通过单核吞噬系统而从循环和组织中去除(Kohler, P. R等，A/s. J. Med.紐:406_11，1974)。此外，最近发现在凋亡小体的去除和处理中具有重要作用的补体(Mevorarch, D 等，7； Exp. ifetZ 7泌:2313-2320，1998)。经典途径功能的缺乏可能使得形成一种循环使得受试者容易发生SLE，在这种循环中，免疫复合物或凋亡细胞在组织中累积，引起炎症并释放自身抗原，继而又刺激自身抗体和更多免疫复合物的产生，从而引起自身免疫应答(Botto，I等，Nat. Genet. 7义56-59，1998 ;Botto, M. , Arthritis Res. J: 201-10, 2001) 然而，经典途径成分的这种“完全”缺乏状态只存在于大约百分之一的SLE患者中。因此，在绝大多数SLE患者中，经典途径成分的完全缺乏并不对疾病病因产生影响，补体活化可能是导致SLE发病机制的重要机制。很少有遗传上永久缺失经典途径成分的个体经常在他们生命中的某个时间发生SLE，这一事实证明冗余机制能够引起疾病。SLE动物模型的结果支持补体活化在疾病发病机制中的重要作用。使用阻断抗C5MoAb来抑制C5活化，减轻了 SLE小鼠模型NZB/NZW Fl小鼠的蛋白尿和肾病(Wang Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. 1/SA93:8563-8,1996) 此外，与未治疗对照相比，用抗 C5 MoAb治疗植入抗DNA抗体分泌细胞的患有严重联合免疫缺陷病的小鼠，导致了蛋白尿和肾组织学图像的改善，并伴有存活率相关益处(Ravirajan, C. T.等，Rheumatology ^:442-7,2004)。替代途径也在SLE的自身免疫性疾病表现上具有重要作用，因为将B因子缺陷型小鼠与SLE的MRL/lpr模型回交时，显示缺乏B因子减轻了血管炎、肾小球病，降低了常见于这种模型的C3消耗和IgG3 RF水平，而不改变其它自身抗体水平(Watanabe，H.等，J.Immunol. 7^4:786-794，2000)。作为SLE潜在治疗手段的人源化抗C5 MoAb正在研究之中。这种抗体防止将C5裂解成C5a和C5b。在I期临床试验中，没有发现严重不利作用，为了确定其在SLE中的功效，更多的人体试验正在进行之中(Strand, V. , Lupus 10:216-221，2001)。人和动物研究的结果都支持补体系统是直接引起肌营养不良发病机制的原因的可能性。人营养不良肌活检样品(dystrophic biopsies)的研究表明，C3和C9沉积在营养不良肌肉坏死和未坏死的纤维上(Cornelio和Dones,J/ / . Neurol. 7^:694-701,1984 ；Spuler 和 Engel, A. G. ,Neurology50:41-46,1998) oPorter 及其同事米用 DNA微阵列方法，观察到在符合营养不良疾病发生的肌养蛋白缺陷型imdx)小鼠中，多数补体相关的mRNA的基因表达显著增加(Porter 等，及皿 Mol. Genet. 77:263-72，2002)。Adysferlin (—种跨膜肌肉蛋白)编码基因的突变，已被鉴定为两种形式的骨骼肌肉疾病，即肢带肌营养不良(LGMD)和Miyoshi肌病的主要风险因素(Liu等，舱tGenet. ^:31-6,1998)。已经研发出几个具有dysferlin突变的小鼠模型，并且它们还发生进行性肌营养不良。已经在一些LGMD患者的未坏死肌肉纤维表面上鉴定出补体级联的活化(Spuler和Engel. ,7^^/^7(^75^:41-46,1998^在近期的研究中，Wenzel及其同事证实，鼠和人缺乏dysferlin的肌肉纤维均缺乏补体抑制因子⑶33/DAF,该抑制因子是一种 特异性 C5b-9 MAC (膜攻击复合物)抑制剂(Wenzel 等,J. Immunol. 77^:6219-25, 2005)。因而，缺乏dysferlin的未坏死肌肉细胞更易受补体介导的细胞裂解的影响。Wenzel及其同事提出，骨骼肌肉细胞的补体介导的裂解可能是参与在患者中发生LGMD和Miyoshi肌病的主要病理机制。Connolly及其同事研究了补体C3在严重先天性营养不良模型dy-l_小鼠的发病机制中的作用，该小鼠缺乏层粘连蛋白ct 2 (Connolly等，7； Neuroiwmunol.
80-7，2002)。他们开发出遗传上缺乏C3和层粘连蛋白a 2两者的动物，并且发现缺乏C3延长了肌营养不良的dy-1-模型的存活。此外，双敲除(C3-7-，办-7-)小鼠比dy-1-小鼠表现出更强的肌肉力量。该项研究表明，补体系统可能直接促成先天性营养不良这种形式的发病机制。因此，本发明的一个方面涉及通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有炎性和非炎性关节炎以及其它肌肉骨骼疾病的受试者来预防或治疗这些疾病，所述疾病包括但不限于骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经病性关节病、银屑病性关节炎、关节强硬性脊椎炎或其它脊椎关节病以及结晶性关节病、肌营养不良或系统性红斑狼疮(SLE)。可以全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能药物可通过口服给药。或者，可通过局部递药，例如通过关节内注射。可以在一段长的时间内定期给予MASP-2抑制剂，以治疗或控制慢性病，或者可以在包括进行关节外科手术在内的急性创伤或损伤之前、期间和/或之后的一段时间单次或重复给药。肾疾病
各种各样的肾疾病的发病机制中涉及补体系统的活化，包括肾小球系膜增生性肾小球肾炎(IgA肾病、贝惹病(Berger’s disease)) (Endo, M.等，Clin.
185-191, 2001)、膜性肾小球肾炎(Kerjashki, D. , Arch B Cell Pathol.^:253-71,1990 ；Brenchley, P. E.等，心办印W : 933-7，1992 ;Salant, D. J.等，
Kidney Int. ^:976-84,1989)、膜增生性肾小球肾炎(肾小球系膜毛细血管性肾小球肾炎)(Bartlow，B. G 等，心办印 75:294-300,1979 ;Meri, S 等 J Exp. Med. 77^:939-50,1992)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎(Ohsawa, I.等，Clin Immunol. 7(97 :59-66, 2001)、狼疮肾炎(Gatenby, P. A.,Autoimmunity 77 :61-6,1991)和亨诺赫-舍恩莱因紫癒肾炎(Endo, M.等，Am. J. KidneyDis. ^:401-407,2000)。对肾疾病中所涉及的补体的认识已有几十年，但是有关它在肾疾病的发作、进展和消退期的确切作用仍存在较多争议。在正常条件下，补体的影响对宿主是有利的，但是补体的不当活化和沉积可能引起组织损伤。有充分的证据表明，肾小球炎症即肾小球肾炎常常是由于免疫复合物沉积在肾小球或肾小管结构上引发的，继而又引发了补体活化、炎症和组织损伤。Kahn和Sinniah证实，取自各种形式肾小球肾炎患者的活检组织的肾小管基底膜上，C5b-9的沉积增加(Kahn，T. N. Histopath. 26:351-6,1995) 在 IgA 肾病患者的研究中(Alexopoulos, A.等，Nephrol. Dial. Transplant 切1166-1172，1995)，C5b_9 在肾小管上皮 / 基底膜结构上的沉积与血浆肌酸酐水平相关。另一项膜性肾病的研究证实了临床结果与尿sC5b-9水平之间的关系(Kon, S. P.等，Kidney Int. 48:1953-58,1995)。sC5b_9 水平升高与预后不良呈正相关。Lehto等人测得膜性肾小球肾炎患者尿中⑶59以及C5b-9水平升高(Lehto，T.等，Kidney Int. 47:1403-11，1995)，⑶59是一种抑制质膜中膜攻击复合物的补体调节因子。取自这些相同患者的活检组织样品的组织病理学分析证实，C3和C9蛋白在肾小球中沉积，而C59在这些组织中的表达比正常肾组织的表达减少。这些不同的研究表明，正在发生补体介导的肾小球肾炎导致尿中排泄出补体蛋白，这与组织损伤程度和疾病预后的程度相互关联。
抑制各种肾小球肾炎动物模型的补体活化也证实了该病病因中补体活化的重要性。在膜增生性肾小球肾炎(MPGN)模型中，C6缺陷型大鼠(不能形成C5b-9)中输注抗Thyl抗血清导致肾小球细胞增殖减少90%，血小板和巨噬细胞浸润降低80%，IV型胶原合成减少(肾小球基质扩展的标志)以及蛋白尿比C6 +正常大鼠的少50% (Brandt, J.等，Kidney J/ t ￥义335-343，1996)。这些结果表明在这种大鼠抗胸腺细胞血清模型中，C5b_9是补体导致的组织损伤的主要介质。在另一种肾小球肾炎模型中，输注分级剂量的兔抗大鼠肾小球基底膜，产生了多形核白细胞(PMN)剂量依赖性地流入，这种多形核白细胞流入通过预先用眼镜蛇毒因子处理(消耗补体)而被减弱(Scandrett，k丄等，Am. J.Physiol. ^:F256-F265,1995)。眼镜蛇毒因子处理的大鼠也显示出组织病理减轻、长期蛋白尿减少以及肌酸酐水平比对照大鼠的降低。Couser等人采用三种GN大鼠模型(抗胸腺细胞血清、Con A抗Con A和被动性海曼肾炎(passive Heymann nephritis)),证实使用重组sCRl蛋白抑制补体这类方法的潜在治疗功效(Couse, W. G.等,7； Am. Soc. Nephrol.5-. 1888-94，1995)。比起对照大鼠，用sCRl处理的大鼠则出现PMN、血小板和巨噬细胞流入显著减少、肾小球系膜裂解(mesangiolysis)和蛋白尿减少。通过在NZB/W Fl小鼠模型中使用抗C5 MoAb，为补体活化在肾小球肾炎中的重要性提供了进一步的证据。抗C5 MoAb抑制C5的裂解，从而阻断C5a和C5b-9的产生。用抗C5 MoAb连续治疗6个月，导致肾小球肾炎进程显著改善。美国康涅狄格州纽黑文市的Alexion Pharmaceuticals公司正在开发一种防止人补体成分C5裂解成其促炎成分的人源化抗C5 MoAb单克隆抗体(5G1. I)，作为肾小球肾炎潜在的治疗方法。通过对遗传上缺失特定补体成分的患者的研究，为补体在肾脏损伤中的病理学作用提供了直接证据。许多报道证明了肾疾病与补体调节因子H缺乏有关(Ault，B.H.，Nephrol. 7^:1045-1053,2000 ；Levy, M.等，心办印 // (如949_56，1986 ;Pickering,M. C.等，Nat. Genet. :424-8, 2002)。H因子的缺乏导致B因子和C3的低血浆水平以及C5b-9的消耗。非典型性膜增生性肾小球肾炎(MPGN)和特发性溶血性尿毒症综合征(HUS)都与H因子的缺乏有关。H因子缺陷型猪(Jansen, J. H.等,Kidney Int.幻:331-49，1998)和H因子敲除小鼠(Pickering, M. C.，2002)都表现出MPGN样症状，这就证实了 H因子在补体调节中的重要性。其它补体成分的缺乏与系统性红斑狼疮(SLE)发生后的继发性肾病有关(Walport, M. J. ,Davies 等,Ann. N. Y. Acad. Sci. 267-81,1997)。Clq、C4 和 C2的缺乏使得非常容易通过与缺乏清除免疫复合物和凋亡物质有关的机制而发生SLE。在这些SLE患者中许多发生了狼疮肾炎，其特征在于免疫复合物沉积在整个肾小球中。通过鉴定患者体内针对补体成分的自身抗体(其中一些与肾疾病直接相关)，为补体活化与肾疾病关联提供了进一步的证据(Trouw,L. A.等，Mol. Immunol. 38\ 199-206,2001)。这些自身抗体的许多种与肾疾病的关联性如此高，以致于引入了术语肾炎因子(NeF)来表示这种活性。在临床研究中，肾炎因子阳性患者中大约有50%发生MPGN(Spitze, R. E.等,Clin. Immunol. IwmunopathoI. 64\ 177-83,1992) C3NeF 是针对替代途径C3转化酶(C3bBb)的自身抗体，它使这种转化酶稳定，从而促进替代途径活化(Daha，M. R.等，J. Immunol. 116:1-7,1976)。同样地，对经典途径C3转化酶(C4b2a)具有特异性的自身抗体(称为C4NeF)使该转化酶稳定，从而促进经典途径活化(Daha，M. R.等，JImmunol. 7^:2051-2054,1980 ；Halbwachs, L.等，J. Clin. 7/71^5^.^^:1249-56,1980)0 已表明，抗Clq自身抗体与SLE患者的肾炎有关(Hovath, L.等，Clin. Exp. Rheuma to I.7^:667-72,2001 ；Siegert, C 等，7； Rheumatol. 7^:230-34,1991 ；Siegert, C 等，
Exp. Rheumatol. 10:19-23，1992)，还有报道指出这些抗Clq自身抗体的效价升高被用来预测肾炎的突发(Coremans, I. E 等J. Kidney Dis.激:595-601,1995)。从SLE患者尸检肾洗脱出的免疫沉积物揭示这些抗Clq自身抗体的累积(Mannick，M.等，ArthritisRheumatol.勿1504-11，1997)。所有这些事实都指向这些自身抗体的病理学作用。然而，并不是所有具有抗Clq自身抗体的患者都发生肾病，一些健康个体中也有低效价的抗Clq自身抗体(Siegert, C. E.等，Clin. Immunol. Immunopathol. 67:204-9,1993) 除了补体活化的替代途径和经典途径以外，凝集素途径在肾疾病中也有重要的病理学作用。通过免疫组织化学技术，从获自诊断为患有几种不同肾病的患者的肾活检材料中，检测出高水平的MBL、MBL相关的丝氨酸蛋白酶及补体活化产物，这些肾病包括亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎(Endo, M.等，Am. J. Kidney Dis. 401-407，2000)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎(Ohsawa, I.等，Clin. Immunol. 7似59-66，2001)以及IgA肾病(Endo, I等,Clin. Nephrology 55:185-191, 2001)。因此,尽管已经清楚补体与肾病之间的相关性这一事实几十年，但是关于补体如何确切影响这些肾病的数据仍远远不够完整。因此，本发明的一个方面涉及通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物，给予患有肾病的受试者以治疗这类疾病，所述疾病包括但不限于肾小球系膜增生性肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎(肾小球系膜毛细血管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮肾炎、亨诺赫-舍恩莱因紫癜肾炎或者IgA肾病。可以全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能药物可通过口服给药。可以在一段长的时间内定期给予MASP-2抑制剂，以治疗或控制慢性病，或者可以在急性创伤或损伤之前、期间或之后的一段时间单次或重复给药。皮肤疾病
银屑病是慢性虚弱性皮肤病，累及数百万人，是遗传和环境因素两者的结果。一般认为局部用药以及UVB和PUVA光线疗法是银屑病的一线治疗方法。然而，对于遍及全身的或更大范围的疾病来说，全身性治疗指示为初步治疗，或者在一些情况下用以增强UVB和PUVA治疗。各种皮肤疾病(例如银屑病)的潜在病因支持免疫和促炎过程(包括补体系统的参与)的作用。此外，已经确定了补体系统作为重要的非特异性皮肤防御机制的作用。它的活化导致不仅有助于维持正常的宿主防御、而且还介导炎症和组织损伤的产物的产生。补体的促炎产物包括具有调理活性和细胞刺激活性的C3大片段(C3b和C3bi)、低分子量的过敏毒素(C3a、C4a和C5a)和膜攻击复合物。其中，C5a或其降解产物脱Arg的C5a似乎是最重要的介质，因为它发挥对炎性细胞的有效趋化效应。真皮内给予C5a过敏毒素诱导的皮肤变化与通过免疫复合物介导的补体活化而发生的皮肤超敏血管炎中所观察到的变化十分相似。补体活化参与了自身免疫性大疱性皮肤病中炎症变化的发病机制。由表皮天疱疮抗体引起的补体活化似乎是称为嗜酸细胞性海绵样水肿这一特征性炎症变化发生的原因。在大疱性类天疱疮(BP)中，基底膜区抗原与BP抗体之间的相互作用导致了补体活化，似乎与嵌入真皮表皮接界的白细胞有关。所产生的过敏毒素不仅激活浸润性白细胞，而且还诱 导肥大细胞脱粒，这就促使真皮表皮分离和嗜酸性粒细胞浸润。同样地，补体活化似乎在获得性大疱性表皮松解和妊娠疱疹中所观察到的真皮表皮分离中发挥更直接的作用。补体参与银屑病的证据来自于文献中记载的涉及银屑病和相关疾病的炎症变化的病理生理学机制的最新实验发现。越来越多的证据表明，T细胞介导的免疫力在银屑病病变的引发和维持中起着重要作用。有研究显示，银屑病病变中由活化T细胞产生的淋巴因子对表皮增殖具有强大的影响力。在银屑病病变的严重发炎部位能够观察到角质层下的特征性嗜中性粒细胞累积。通过由受刺激的角质形成细胞释放的趋化因子、IL-8和Gro-a的协同作用，特别是通过替代补体途径活化所产生的C5a/脱arg的C5a，化学趋化性地吸引并激活嗜中性粒细胞(Terui, T. , TahokuJ. Exp. Med. 7^:239-248,2000 ；Terui, T.，Exp. Dermatol. 9\1-10,2000)。银屑病鳞屑提取物含有独特的趋化肽部分，它可能参与诱导节律性经表皮的白细胞趋化反应。最新研究鉴定出该部分中存在两种不相关的趋化肽，即C5a/脱Arg的C5a和白介素8 (IL-8)及其相关细胞因子。为研究它们对经表皮白细胞迁移的相对影响以及它们在银屑病病变中的相互关系，对银屑病病变鳞屑提取物和相关的无菌脓疱皮肤病提取物中的免疫反应性C5a/脱Arg的C5a和IL-8浓度进行了定量。发现病变皮肤角质组织提取物中的C5a/脱Arg的C5a和IL-8的浓度比非炎性正常角质皮肤(orthokeratotic skin)的浓度显著增加。C5a/脱Arg的C5a浓度的增加是病变鳞屑提取物特有的。根据这些结果，似乎C5a/脱Arg的C5a仅在优先利于补体活化的特定情况下在炎性病变皮肤中产生。这就为使用补体活化抑制剂改善银屑病病变提供了理论基础。虽然有研究显示补体系统的经典途径在银屑病中被激活，但是仍有少量关于替代途径参与银屑病炎症反应的报道。在补体活化途径的传统观点范围内，补体片段C4d和Bb分别在经典途径和替代途径活化时被释放。因此，C4d或Bb片段的存在表示通过经典途径和/或替代途径进行的补体活化。一项研究使用酶免疫测定技术测定了银屑病鳞屑提取物中C4d和Bb的水平。这些皮肤病鳞屑含有的用酶免疫测定法可检测到的C4d和Bb水平比非炎性皮肤角质层中的高(Takematsu, H.等，Dermatologica 767:289-292,1990)。这些结果表明在银屑病的病变皮肤中除补体的经典途径之外，替代途径也被激活。通过对患有特应性皮炎(AD)的35名患者和患有轻微至中度银屑病的24名患者的外周血中的正常补体成分和活化产物进行测定，获得补体参与银屑病和特应性皮炎的额外证据。血清中C3、C4和Cl钝化物(Cl INA)的水平用放射免疫扩散测定，而C3a和C5a水平则用放射免疫测定法测定。观察到与健康的非特应性对照相比，两种疾病中的C3、C4和Cl INA的水平都显著增加。在AD中，C3a水平趋于升高，而在银屑病中，C3a水平则显著提高。这些结果表明，在AD和银屑病中，补体系统都参与了炎症过程(Ohkonohchi，K.等，Derma to Iogi ca 7Z9:30-34,1989)。银屑病的病变皮肤中补体活化还导致末端补体复合物在表皮内沉积，如通过测定银屑病患者的血浆和角质组织中的SC5b_9水平所显示的一样。已经发现银屑病血浆中的SC5b_9水平显著高于对照或者特应性皮炎患者的水平。得自病变皮肤的总蛋白提取物的研究显示，尽管在非炎性角质组织中无法检测到SC5b-9，但在银屑病的病变角质组织中有高水平的SC5b-9。通过使用抗C5b-9新抗原的单克隆抗体的免疫荧光法，仅在银屑病皮肤的 角质层中观察到C5b-9的沉积。总的来说，在银屑病的病变皮肤中，补体系统被激活，补体活化一直进行到终端步骤，产生了膜攻击复合物。近来，新的选择性靶向免疫系统的生物药物已经可用来治疗银屑病。目前已被美国FDA批准或者处于III期研究的四种生物药物是阿来西普(alefacept)(艾默(Amevivee)HPefalizuMoAb (依法珠单抗(Raptiva) )(它们是T细胞调节剂)；依那西普(etanercept)(恩利(Enbrel ))(它是可溶性TNF受体)；以及 inf IixiMoAb (Remicade )(它是抗TNF单克隆抗体)。依法珠单抗(Raptiva)是免疫应答调节剂,其中作用的祀向机制是阻断淋巴细胞上的LFA-I与抗原呈递细胞和血管内皮细胞上的ICAM-I之间的相互作用。通过依法珠单抗(Raptiva)结合⑶IIa使淋巴细胞上可用的⑶IIa结合位点饱和，使淋巴细胞上细胞表面⑶IIa的表达下调。这种作用机制抑制了 T细胞活化、细胞至真皮和表皮的迁移以及T细胞再活化。因此，大量科学证据表明了补体在皮肤的炎性疾病状态中的作用，最新制药方法现已针对免疫系统或特定的炎症过程。然而，还没有研究将MASP-2视作靶向目标。根据本发明的发明人对MASP-2在补体活化中的作用的新认识，本发明的发明人认为MASP-2是治疗银屑病和其它皮肤病的有效靶标。因此，本发明的一个方面涉及治疗银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸细胞性海绵样水肿、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解、特应性皮炎、妊娠疱疹和其它皮肤病，以及用于治疗热烧伤和化学烧伤，包括由此引起的毛细血管渗漏，即通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有所述皮肤病的受试者进行治疗。MASP-2抑制剂可以通过应用含有MASP-2抑制剂的喷雾剂、洗剂、凝胶剂、糊剂、软膏剂或灌洗溶液剂，局部给予受试者，或者例如通过动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药等全身性给予，或者对于非肽能药物可通过口服给药。对于急性病，治疗可包括单次给药或重复用药或给药，或者对于控制慢性病，则包括定期用药或给药。移植
补体系统的活化显著地促进了实体器官移植后的炎症反应。在同种异体移植中，补体系统可被缺血/再灌注激活，并且可能被针对移植物的抗体激活(Baldwin, ff. M.等，Springer Seminol Immunopathol. 25:181-197,2003)。从非灵长类至灵长类的异种移植中，补体的主要激活因子是预先存在的抗体。动物模型中的研究表明使用补体抑制剂可显著延长移植物的存活(参见下文)。因此，补体系统在器官移植后的器官损伤中有着明确的作用，从而本发明的发明人认为使用针对MASP-2的补体抑制剂可预防同种异体移植或异种移植后对移植物的损伤。先天免疫机制、特别是补体在针对移植物的炎症反应和免疫应答中所起的作用比以前所认识的作用要大。例如，替代补体途径活化似乎介导了肾缺血/再灌注损伤，近端小管细胞可能是这种环境中补体成分的来源兼攻击部位。肾脏内局部产生的补体也在针对移植物的细胞和抗体介导的免疫应答两者的发生中都发挥着作用。C4d是活化补体因子C4的降解产物，C4是经典途径和凝集素依赖途径的成分。C4d染色已经成为急性病和慢性病环境中体液排斥的有用标记，重新引起对抗供体抗体形成的重要性的关注。C4d和急性细胞排斥的形态学标志之间的关联性具有统计显著性。在24-43%的I型发作、45%的II型排斥和50%的III型排斥中观察到C4d (Nickeleit, V.等，J. Am. Soc. Nephrol. 7J: 242-251,2002 ;Nickeleit, N.等,NephroI. Dial. Transplant7^:2232-2239, 2003)。正在开发抑制补体或降低局部合成作为移植后达到改善临床结果的 手段的多种治疗方法。补体级联活化是由于移植期间的许多过程而发生的。目前的疗法尽管在限制细胞排斥方面是有效的，但是并不能完全应付所面临的所有障碍。这些障碍包括体液排斥和慢性同种异体移植肾病或功能障碍。尽管对移植器官的总体反应是宿主方许多效应机制的结果，不过补体可能在其中一些方面起着关键作用。在肾移植环境下，近端小管细胞的局部补体合成似乎特别重要。补体特异性抑制剂的可获得性可能为改善器官移植后的临床结果提供了机会。通过阻滞补体攻击的机制起作用的抑制剂可能是特别有用的，因为它们有望提高功效，并且避免无免疫应答接受者的系统性补体耗尽。补体在异种移植排斥中也起着关键作用。因此，有效的补体抑制剂作为潜在的治疗药是非常令人关注的。在猪一灵长类器官移植中，超急性排斥(HAR)是由抗体沉积和补体活化引起的。已经对预防猪一灵长类组合中超急性异种移植物排斥的多项策略和目标进行了试验。这些方法通过去除天然抗体、用眼镜蛇毒因子耗尽补体、或者用可溶性补体抑制剂sCRl防止C3活化得以实现。此外，补体活化阻断剂(CAB-2)，一种源自人衰变加速因子(DAF)和膜辅因子蛋白的重组可溶性嵌合蛋白，抑制经典途径和替代途径两者的C3和C5转化酶。CAB-2减少用人血离体灌注猪心的补体介导的组织损伤。将猪心异位移植到未接受任何免疫抑制的猕猴中时对CAB-2功效的研究表明，在接受CAB-2的猴中，移植物存活期显著延长(Salerno, C. T.等，Xenotransplantation 9:125-134, 2002) CAB-2 显著抑制补体活化，体现在C3a和SC5b-9的产生急剧减少。在移植排斥时，iC3b、C4和C9的组织沉积与对照的沉积类似或者略微有减少，IgG、IgM、Clq和纤维蛋白沉积没有变化。因此，这种补体抑制方法消除了移植到猕猴体内的猪心的超急性排斥。这些研究证实了补体抑制对存活的有益效果，本发明的发明人认为MASP-2抑制剂还可用于异种移植。另一种方法集中在确定抗补体5 (C5)单克隆抗体能否在大鼠一预敏化小鼠心脏移植模型中防止超急性排斥(HAR)，以及这些MoAb与环孢菌素(cyclosporine)和环磷酰胺联用能否实现移植物的长期存活。研究表明抗C5 MoAb预防HAR (Wang, H.等，Transplantation 68\ 1643-1651,1999)。因此本发明的发明人认为，补体级联中的其它革巴(例如MASP-2)对于在未来的临床异种移植中防止HAR和急性血管排斥也可能是有价值的。虽然补体在见于异种移植的超急性排斥中的关键作用已经非常确定，但是在同种异体移植中的不太明显的作用开始显现。早已清楚补体和获得性免疫应答之间的联系，其中发现缺乏补体的动物在抗原刺激后产生低于正常的抗体应答。研究表明抗原用补体裂解产物C3d的调理作用极大地增加了抗原呈递到B细胞的有效性，并且表明是通过2型补体受体连接到某些B细胞上而起作用的。这项工作已经延伸到小鼠皮肤移植模型中的移植环境，其中C3和C4缺陷型小鼠在同种抗体的产生方面具有明显的缺点，这是由于类别转换成高亲和性IgG失败所致。由于抗供体抗体和体液排斥的重要性，因此这些机制在肾移植中的重要性随之增加。以前的工作已证实，在肾脏移植之后的同种异体移植物排斥期间，近端小管细胞的C3合成上调。在小鼠肾脏移植模型中，已对局部合成补体的作用进行了研究。与C3阳性供体的对照移植物相比，将C3阴性供体的移植物移植到C3充足的受体中，显示其存活期 延长(>100天)，而对照移植物14天内就被排斥。此外，与对照的相比，C3阴性移植物的接受者体内抗供体T细胞增值应答显著降低，这表明局部合成的C3对T细胞初敏的作用。这些观察结果表明这样的可能性，即供体抗原暴露于T细胞首先是在移植物中发生的，而且局部合成的补体通过供体抗原的调理作用或者通过向抗原呈递细胞或T细胞提供另外的信号而增强了抗原呈递。在肾脏移植环境下，产生补体的肾小管细胞也表明补体沉积在它们的细胞表面上。因此，本发明的一个方面涉及通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予移植受体，来预防或治疗由组织或实体器官移植引起的炎症反应，所述移植受体包括已接受完整器官(例如肾、心、肝、胰腺、肺、角膜等)或移植物(如瓣膜、腱、骨髓等)的同种异体移植或异种移植的受试者。可以通过动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药给予受试者MASP-2抑制剂，或者对于非肽能抑制剂可口服给予。给药可发生在移植后的急性期和/或作为长期移植后疗法。附加于移植后给药或者代替移植后给药，可在移植之前和/或移植手术期间用MASP-2抑制剂治疗受试者，和/或用MASP-2抑制剂预处理待移植的器官或组织。器官或组织的预处理可能需要将含有MASP-2抑制剂的溶液剂、凝胶剂或糊剂经喷雾或冲洗表面而应用到器官或组织表面，或者可将器官或组织浸泡在含有MASP-2抑制剂的溶液中。中枢与外周神经系统疾病和损伤
各种中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)疾病或损伤的发病机制涉及补体系统的活化，所述疾病或损伤包括但不限于多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、急性热病性多神经炎、中风后再灌注、椎间盘退行性疾病、脑外伤、帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)。补体蛋白在包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的CNS细胞中合成的初步测定，以及对补体活化之后在CNS中产生的过敏毒素能改变神经元功能的认识，揭示了补体在CNS疾病中的潜在作用(Morgan，B. P.等，Immunology Today 77:10: 461-466,1996)。现已表明，C3a受体和C5a受体存在于神经兀上，并广泛分布在感觉、运动和边缘脑系统的各个不同部分上(Barum, S. R. , ImmunologicResearch ^:7-13,2002)。而且，已表明，过敏毒素C5a和C3a改变啮齿动物的饮食习惯，并能诱导小胶质细胞和神经元的钙信号转导。这些发现增加了有关在各种CNS炎性疾病中抑制补体活化的治疗效用的可能性，所述疾病包括脑外伤、脱髓鞘、脑膜炎、中风和阿尔茨
海默病。脑外伤或脑出血是常见的临床问题，补体活化可能产生并加重所形成的炎症和水肿。已在大鼠脑外伤模型中对补体抑制作用进行了研究(Kaczorowski等,J Cereb. BloodFlow Metab. 7^:860-864,1995)。在临脑损伤之前给予sCRl显著抑制嗜中性粒细胞浸润到受伤区域，这表明了补体对于吞噬细胞募集的重要性。同样地，血浆和脑脊液(CSF)中高水平的多种补体活化产物的存在清楚表明了脑出血之后患者中的补体活化。补体活化和C5b-9复合物染色增加在隔离的腰椎间盘组织中得到证实，可能表明了在椎间盘突出组织诱发的坐骨神经痛中的作用(Gronb I ad, M. Spine ^(2) : 114-118, 2003) MS(多发性硬化)的特征在于CNS内将轴突包鞘并绝缘的髓磷脂逐渐丧失。尽管尚不清楚最初的原因，不过有大量证据表明涉及到免疫系统(Prineas，J. ff.等，LabInvest. ^:409-421,1978 ；Ryberg, B. , J. Neurol. Sci. 239-261，1982)。还有明 确的证据表明，补体在CNS或PNS脱髓鞘疾病的病理生理学中起着突出作用，这些疾病包括MS、急性热病性多神经炎和米勒一费希尔综合征(Gasque, P.等，Immunopharmacology^:171-186,2000 ；Barnum, S. R. in Bondy S.等(主编)Tnflammatory events inneurodegeneration, Prominent Press, pp. 139-156, 2001)。补体是引起组织破坏、发炎、髓磷脂碎片的清除甚至是轴突髓鞘再形成的原因。尽管补体参与证据确凿，但是补体治疗性靶的鉴定目前仍只是在实验性变应性脑脊髓炎(EAE)(—种多发性硬化的动物模型)中进行评价。研究表明，与EAE对照小鼠相比，缺乏C3或B因子的EAE小鼠脱髓鞘作用减弱(Barnum, Immunologic Research 26:7-13, 2002) 使用称为 “sCrry” 的可溶形式的补体抑制剂和C3-/-以及B因子-I-的EAE小鼠研究证实补体是疾病模型在若干水平上发生和发展的原因。此外，B因子-/-小鼠中的EAE严重性的显著降低，这为补体替代途径在EAE中的作用提供了进一步的证据(Nataf 等Immunology 7^5": 5867-5873, 2000)。MG(重症肌无力)是乙酰胆碱受体丧失和运动终板破坏的神经肌肉接头疾病。sCRl在MG动物模型中非常有效，这进一步表明了补体在该疾病中的作用(Piddelesden等，J. Neuroimmunol. 1997)。神经退行性疾病AD(阿尔茨海默病)的组织学标志是老年斑和神经纤维原缠结(McGeer等，Wes. Immunol. 7幻:621-630,1992)。这些病理学标记对于补体系统成分也是强染色的。证据指向导致神经元死亡和认知功能障碍的局部神经炎症状态。老年斑含有异常的淀粉样P肽(AP，这是一种源自淀粉样前体蛋白的肽。研究表明々@结合 Cl 并能引发补体活化(Rogers 等，Res. Immunol. 7^:624-630,1992)。此外，AD 的显著特征是与经典补体途径从Clq到C5b_9的活化蛋白相关，观察到它们高度定位于神经炎斑中(Shen, Y.等，Brain Research 7你:391-395,1997 ;Shen, Y.等，Neurosci.Letters305( ,) : 165-168, 2001) 因此，AP不但启动了经典途径，而且所产生的连续炎症状态可能是神经元细胞死亡的原因。而且，AD中补体活化已经进行到末端C5b-9阶段的这一事实表明，补体系统的调节机制仍不能终止补体活化过程。有研究提出了几种补体途径抑制剂作为潜在的AD治疗手段，包括作为ClQ结合抑制剂的蛋白聚糖、作为C3转化酶抑制剂和C5活化阻断剂或C5a受体抑制剂的萘莫司他(Nafamstat) (Shen, Y.等，Progress in Neurobiology，7^:463-472,2003)。MASP-2 作为先天补体途径起始步骤以及用于替代途径活化的作用，提供了可能的新的治疗手段，这得到了表明补体途径参与AD的大量数据的支持。同其它CNS退行性疾病一样，在ro(帕金森病)患者脑的受损区域存在炎症的证据，所述炎症的特征在于神经胶质反应(特别是小胶质细胞反应)，以及HLA-DR抗原、细胞因子和补体成分的表达增加。这些观察结果表明，免疫系统机制参与了 ro中神经元损伤的发病机制。然而，还没有阐明ro中的原发性损伤的细胞机制，但是，有可能是线粒体突变、氧化应激和细胞凋亡在起作用。此外，ro中由纹状体和黑质的神经元损伤引起的炎症可能加重病程。这些观察结果表明，用补体抑制药治疗可能起着减缓ro进程的作用(Czlonkowska, A.等，Med. Sci. Monit. 8:165-177, 2002) 因此，本发明的一个方面涉及通过应用包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物来治疗患有外周神经系统(PNS)疾病或损伤和/或中枢神经系统(CNS)疾 病或损伤的受试者，来治疗这些疾病或损伤。认为可根据本发明治疗的CNS和PNS疾病和损伤包括但不限于多发性硬化(MS)、重症肌无力(MG)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、急性热病性多神经炎、中风后再灌注、椎间盘退行性疾病、脑外伤、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、米勒一费希尔综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘，还可为脑膜炎。对于治疗CNS疾病和脑外伤来说，可以通过鞘内、颅内、脑室内、动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药给予受试者MASP-2抑制剂，对于非肽能抑制剂可口服给予。可通过全身给药途径或者通过局部给予功能障碍或创伤部位来治疗PNS疾病和脑外伤。可按照医师的规定定期重复给予本发明的MASP-2抑制剂组合物，直到症状得到有效缓解或控制。血液病
脓毒症是由于患者对侵入微生物的过度反应而引起的。补体系统的主要功能是配合对侵入细菌和其它病原体的炎症反应。与这种生理作用相一致，许多研究显示补体活化在脓毒症的发病机制中具有主要作用(Bone, R. C. ,Annals. Internal. Med. 77^:457-469,
1991)。脓毒症临床表现的定义在不断发展中。通常将脓毒症定义为对感染的系统性宿主应答。然而，在许多情况下，有脓毒症症状的患者中没有发现感染的临床证据(如血液培养细菌阳性)。这种矛盾之处最早是在1992年的共识会议上确定术语“全身炎症反应综合征”(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)时被注意到的，SIRS不需要确定的细菌感染的存在(Bone, H等,Crit. Care Med.及 :724-726，1992)。目前普遍认为，伴随脓毒症和SIRS的是不能调控炎症反应。出于该简述的目的，我们会考虑脓毒症的临床定义还包括严重脓毒症、败血症性休克和SIRS。在1980年代末期之前，脓毒症患者的主要感染源是革兰氏阴性菌。已知革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS)刺激炎症介质从各种细胞类型中释放出来，并且当注射到动物体内时诱导急性感染症状(Haeney, M. R.等，Antimicrobial Chemotherapy 41(增刊A) :41-6,1998)。有趣的是，引起感染的微生物的范围似乎从1970年代末期和1980年代主要是革兰氏阴性菌变成了现今的主要是革兰氏阳性菌，其原因目前不清楚(Martin，G.S.等，况 Eng. J. Med. J妨1546-54，2003)。许多研究表明补体活化在介导炎症和引起休克、特别是败血症性休克和出血性休克特征中的重要性。革兰氏阴性和革兰氏阳性生物一般都促使败血症性休克。LPS是主要经由替代途径的有效的补体活化因子，尽管抗体介导的经典途径活化也有发生(Fearon，D. T.等，N. Engl. J. Med. 似:937-400，1975)。革兰氏阳性细胞壁的主要成分是肽聚糖和脂磷壁酸，两种成分都是替代补体途径的有效激活因子，尽管在特异性抗体存在时，它们也能激活经典补体途径(Joine, K. A.等,Ann. Rev. Immunol.之:461-2,1984)。脓毒症发病机制中最初涉及补体系统是当研究人员注意到过敏毒素C3a和C5a介导各种也可能发生在脓毒症期间的炎症反应时发现的。这些过敏毒素引起血管扩张和微血管通透性增加，这是在败血症性休克中起着重要作用的事件(Schumache, IL等，Agents Actions34:345-349,1991)。此外，过敏毒素 诱导支气管痉挛、组胺从肥大细胞中释放以及血小板聚集。而且，它们对粒细胞发挥了许多作用，例如趋化、聚集、粘附、溶酶体酶的释放、毒性超氧阴离子的产生和白三烯的形成(Shin, H. S.等，Science 162\361-363,1968 ；Vogt, ff. , Complement J: 177-86，1986)。认为这些生物学作用在脓毒症并发症例如休克或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生中起着作用(Hammerschmidt, D. E.等，Lancet7:947-949,1980 ；Slotman, G. T.等，供划:744-50，1986)。此外，过敏毒素 C3a 水平的升高与脓毒症的致命结果有关(Hack, C.E.等，Am. J. Med.浙:20-26，1989)。在一些休克动物模型中，某些补体缺陷型品系(如C5缺陷型品系)对LPS的输注效应具有更高的抗性(Hseuh, W.等，Iwmunol. 7^:309-14,1990)。研究显示，在啮齿动物脓毒症发作期间，用抗体阻断C5a产生极大地提高了存活率(Czermak，B. J.等，舱t Med. &788-792，1999)。当用抗体或小分子抑制剂阻断C5a 受体(C5aR)时，得到了类似的结果(Huber-Lang, M.S.等，FASEB J. 7^:1567-74,2002 ；Riedemann, N. C 等，7； Clin.770:101-8，2002)。较早期对猴子的实验研究表明，C5a的抗体阻断减少了大肠杆菌iB. coli)诱发的败血症性休克和成人呼吸窘迫综合征(Hangen, D. H.等，J. Surg. Res. 46:195-9,1989 ；Stevens, J. H.等，J.Clin. Invest. 77:1812-16，1986)。与脓毒症不太严重的患者和幸存者相比，C5a在脓毒症病人体内升高，并且与显著降低存活率和多器官衰竭有关(Nakae，H.等，/fes. Commun.Chem. Pa thol. Pharmacol.财189-95,1994 ;Nakae 等，51 / 1; Today 26:225-29,1996 ；Bengtson, A.等，Aroh. Surg. 7W: 645-649，1988)。C5a在脓毒症期间发挥其有害作用的机制还有待更详细的研究，但是最近的数据表明，脓毒症期间C5a的产生显著损害血液嗜中性粒细胞的先天免疫功能(Huber-Lang, M.S.等，J. Immunol. 7^:3223-31,2002) >它们引起呼吸爆发的能力及其产生细胞因子的能力(Riedemann, N. C.等，I_unity19:193-202,2003) o此外，脓毒症期间的C5a产生似乎具有促凝血效应(Laudes，I. J.等，Am. J. / 从o7. 7仰1867-75，2002)。在脓毒症和ARDS动物模型中，补体调控蛋白Cl INH也显示出功效(Dickneite, G. ,Behring Ins. Mitt.沿299-305，1993)。凝集素途径在脓毒症的发病机制中也可能有作用。已显示MBL结合临床上重要的各种微生物，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，并激活凝集素途径(Neth，0.等，Infect. Inmun.你:688，2000)。脂磷壁酸(LTA)越来越被视作LPS的革兰氏阳性对应物(Gram-positive counterpart)。它是诱导细胞因子从单核吞曬细胞和全血中释放的有效免疫刺激剂(Morath, S 等，7； Exp. Med. 7^:1635,2002 ；Morath, S 等，
Irnnun. 7^:938,2002)。最近证实，L-纤维胶凝蛋白与从许多革兰氏阳性菌(包括金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus))分离的LTA特异性结合,并且激活凝集素途径(Lynch,N.J.等,J. J遞77J : 1198-02, 2004)。还显不，MBL 能结合得自肠球菌(Bnterococcusspp)的LTA，其中多聚甘油磷酸链被糖基取代，但是不结合来自其它9种菌种(包括金黄色葡萄球菌)的 LTA (Polotsky, V. Y.等，Infect. Tmmun.份:380,1996)。因此，本发明一方面提供用于治疗脓毒症或由脓毒症引起的疾病的方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有脓毒症或由脓毒症引起的疾病的受试者实施，所述疾病包括但不限于严重脓毒症、败血症性休克、脓毒症引起的急性呼吸窘迫综合征和全身性炎症反应综合征。本发明提供治疗其它血液病的有关方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患其它血液病的受试者实施，所述其它血液病包括出血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)、溶血性尿毒症综合征(HUS)或其它骨髓/血液破坏性疾病。可以全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入(特别是在ARDS的情况下)、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能抑制剂可口服给予。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种另外的治疗药联用以对抗脓毒症和/或休克的后遗症。对于晚期脓毒症或休克或者由此引起的疾病状况来说，MASP-2抑制剂组合物可适于以速效剂型给药，例如 通过静脉内或动脉内推注含有MASP-2抑制剂组合物的溶液剂来给药。可按照医师规定重复给药，直到疾病消退。泌尿生殖系统疾病
研究表明补体系统参与了几种截然不同的泌尿生殖系统疾病，包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎(Holm-Bentzen，M.等，J Urol.7激:503-507，1987)、不育(Cruz 等，Biol. Reprod. 1217-1228，1996)、妊娠(Xu,等，Science 287:498-507，2000)、胎儿母体耐受(Xu, 等，Science 287:498-507，2000)和先兆子痫(Haege，I，Int. J. Gynecol. Obstet.幻113-127，1993)。疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎是未知病因和发病机制所知甚少的疾病，因此没有任何合理的治疗方法。有关膀胱的上皮和/或粘膜表层膜缺陷的致病理论，以及有关免疫紊乱的理论成为主流(Holm-Bentzen，M.等，J.Urol. 7^^:503-507,1987^据报道已经测试了间质性膀胱炎患者的免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、补体成分(Clq、C3、C4)和Cl酯酶抑制剂。补体成分C4的血清水平有非常显著的降低(P〈0. 001)，免疫球蛋白G显著增加(p〈0.001)。该研究表明补体系统经典途径活化，并且支持慢性局部免疫过程参与该病发病机制的可能性(Mattila，J. ^,Eur.Urol.义350-352，1983)。而且，在自身抗体与膀胱粘膜中的抗原结合之后，补体活化可能参与组织损伤的产生，并参与该病典型的慢性自身延续性炎症(seIf-perpetuatinginflammation) (Helin, H.等,Clin. Immunol. Immunopathol.幻:88-96,1987)。除了补体在泌尿生殖器炎性疾病中的作用之外，生殖功能也可能受到补体途径局部调节的影响。天然存在的补体抑制剂已经发展到了为宿主细胞提供所需的保护以控制体内的补体系统。为了揭示胚胎发育中的补体调控，对Crry进行了研究，Crry是天然存在的啮齿动物补体抑制剂，在结构上类似于人补体抑制剂MCP和DAF。有趣的是，产生Crry-/-小鼠的努力没有成功。相反，发现纯合的Crry-/-小鼠死于子宫内。Crry-/-胚胎在交配后存活到大约10天，存活随着由发育停滞所导致的死亡而迅速下降。炎性细胞也明显侵入Crry-/-胚胎的胎盘组织中。相比之下，Crry+/+胚胎似乎具有沉积在胎盘上的C3。这表明在胎盘水平上发生了补体活化，在缺少补体调节时，胚胎死亡。验证性研究在C3缺陷型背景下进行了引入Crry突变的试验。该补救性策略是成功的。总的说来，这些数据表示必须调节胎儿母体的补体界面。胎盘中补体调节的细微变化可能是胎盘功能障碍和流产的原因(Xu, C.等，Science 498-507，2000)。先兆子痫是妊娠诱发的高血压症，其中涉及补体系统活化，不过仍然存在着争议(Haege, I，Int. J. Gynecol. Obstet.幻113-127,1993)。体循环中的补体活化与先兆子痫中已确立的疾病密切相关，但是在临床症状出现之前没有发现补体活化增加，因此不能将补体成分用作先兆子痫的预测因子(Haeger等，Gynecol. 7^:46,1991)。然而，在胎盘床局部环境中增加的补体活化可能胜于局部控制机制，导致过敏毒素和C5b-9水平升高(Haeger 等，Gynecol. 551,1989)。与抗精子抗体(ASA)相关的不育的一种假定机制是通过生殖道中补体活化的作用。C3b和iC3b调理素可通过其补体受体以及精子表面末端C5b-9复合物的形成来增强 吞噬细胞与精子的结合，进而降低精子的活动性，故C3b和iC3b调理素的产生是与生殖力降低有关的可能原因。在不孕妇女的卵巢卵泡液中也证实了 C5b-9水平升高(D’Cruz，
0.J.等，J. Immunol. 7^:3841-3848，1990)。其它研究表明精子游动减缓，精子/卵子相互作用减弱，这些都可能与补体有关(D’Cruz, 0. J.等，7； Immunol. 7^:611-620,1991 ；Alexander, N. J. , FertiI. SteriI. ￥7:433-439,1984)。最后，用 sCRl 进行的研究证实了针对ASA介导和补体介导的人精子损伤的保护作用(D’Cruz, 0. J.等，Biol. Reprod.54-1217-1228，1996)。这些数据为补体抑制剂用于治疗泌尿生殖系统疾病和障碍提供了若干证据。因此，本发明一方面提供用于抑制患有泌尿生殖系统疾病的患者的MASP-2依赖性补体活化的方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有泌尿生殖系统疾病的受试者实施。我们认为用本发明方法和组合物进行治疗性治疗的泌尿生殖系统疾病以非限制性实例方式包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎和间质性膀胱炎、男女不育、胎盘功能障碍以及流产和先兆子痫。可以全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能抑制剂可口服给予。或者，MASP-2抑制剂组合物可局部递送到泌尿生殖道，例如通过用液体溶液或凝胶组合物进行膀胱内冲洗或灌输。可按照医师规定重复给药以控制或消除疾病。糖尿病和糖尿病性疾病
糖尿病性视网膜微血管病的特征是通透性增加、白细胞淤滞、微血栓形成和毛细血管细胞凋亡，所有这些都可能是由补体活化所引起或促进的。糖尿病患者的肾小球结构和神经内微血管都表现出补体活化的迹象。高含量葡萄糖体外选择性地降低CD55和CD59在内皮细胞表面上表达和CD59进行阻碍其补体抑制功能的非酶糖化作用的发现表明，糖尿病中补体抑制剂的利用度或有效性降低，CD55和CD59是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定膜蛋白的两种抑制剂。Zhang等人的研究ij)iabetes51:3499 - 3504，2002)探索了作为人非增殖性糖尿病性视网膜病特征的补体活化及其与抑制分子变化的关联性。发现补体活化末端产物C5b-9的沉积发生在2型糖尿病病人眼供体的视网膜血管壁上，但在年龄匹配的非糖尿病供体血管则没有发生。在糖尿病性视网膜中未检测到经典途径特有的补体成分Clq和C4，这表明C5b_9是经替代途径产生的。糖尿病供体显示，由GPI锚连接到质膜上的两种补体抑制剂CD55和CD59的视网膜水平显著降低。在用10周链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠中观察到视网膜血管中类似的补体活化及视网膜CD55和CD59水平选择性降低。因此，糖尿病似乎引起补体抑制剂和补体活化的缺损性调节，其在糖尿病性视网膜微血管病大多数其它表现之前。Gerl 等人{Investigative Ophthalmology and Visual Science 43\ 1104-08,
2000)测定了受累于糖尿病性视网膜病眼内的活化补体成分的存在。免疫组织化学研究表明，在所有50个糖尿病性视网膜病样本中，在紧邻玻璃膜(Bruch membrane)之下以及紧包住毛细血管的脉络膜毛细血管层中都检测到了补体C5b-9复合物大量沉积。C3d染色与C5b-9染色正相关，表示补体活化在原位发生的事实。此外，发现了玻连蛋白的阳性染色，它与胞外C5b-9形成了稳定的复合物。相反，没有C反应蛋白(CRP)、甘露聚糖结合凝集素 (MBL)、Clq或C4的阳性染色，表明补体活化不是通过C4依赖性途径发生的。因此，C3d、C5b-9和玻连蛋白的存在表明，补体活化可能是通过糖尿病性视网膜病受累眼中脉络膜毛细血管层中的替代途径而完成的。补体活化可能是可造成眼组织疾病和视觉缺陷的病理性后遗症的病因。因此，使用补体抑制剂可能是减少或阻断糖尿病中发生的微血管损伤的有效治疗方法。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM，亦称I型糖尿病)是与不同类型自身抗体的存在有关的自身免疫性疾病(Nicoloff等，Dev. Immunol. 77:61-66,2004)。这些抗体和相应抗原在循环中的存在导致形成循环免疫复合物(CIC)，已知CIC长期保留在血液中。CIC在小血管中的沉积有可能导致伴有衰弱性临床结果的微血管病。糖尿病儿童中，CIC与微血管并发症的发生之间存在关联性。这些发现表明CIC IgG的水平升高与早期糖尿病性视网膜病的发生有关，且补体途径抑制剂对于阻断糖尿病性视网膜病可能是有效的(Kotnik等,Croat. Med. J. 707-11, 2003)。此外,下游补体蛋白的形成和替代途径的参与可能是IDDM中胰岛细胞总体功能的影响因素，期望使用补体抑制剂来减少可能的损伤或限制细胞死亡(Caraher 等，J Endocrinol. 7似143-53,1999)。与健康对照相比，循环MBL浓度在I型糖尿病患者中显著升高，并且这些MBL浓度与尿白蛋白排泄正相关(Hansen 等，J Clin. Endocrinol, ifete办.泌:4857-61, 2003)。最近的临床研究发现，MBL基因型高表达和低表达的频率在I型糖尿病患者和健康对照之间是相似的(Hansen等，Dia知1570-76，2004)。然而，如果糖尿病患者的MBL基因型高，则他们患肾病的风险显著提高。这就表明MBL高水平和凝集素途径补体活化可能是引起糖尿病性肾病发生的原因。该结论得到最新前瞻性研究的支持，在该研究中，对MBL水平与新近诊断为I型糖尿病患者组群中蛋白尿发生之间的关联性进行了分析(Hovind等，Diabetes54-1523-21，2005)。他们发现在I型糖尿病病程早期，高水平的MBL与稍后持续性蛋白尿的发生显著相关。这些结果表明，MBL和凝集素途径可能参与糖尿病血管并发症的特定发病机制，而不仅仅是引起现有病变的速度加快。在最近的临床研究(Hansen等，办CAIntern. Med. 266:2007-13，2006)中，在接受随访调查15年以上，已进行基线充分鉴定的一组2型糖尿病患者中，对MBL水平进行了测定。他们发现即使在对已知的混淆变量进行调整后，MBL血浆水平高(>1000 U g/L)的患者的死亡风险比低水平MBL 1000 y g/L)患者明显较高。本发明另一方面，提供抑制患有非肥胖性糖尿病(IDDM)或IDDM的血管病、神经病或视网膜病并发症或者成人发病的(2型)糖尿病的受试者的MASP-2依赖性补体活化的方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予受试者实施。可以全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能抑制剂可口服给予。或者，可通过局部送递到血管病、神经病或视网膜病症状的部位来给药。可在一段长的时间内定期给予MASP-2抑制剂以治疗或控制慢性病，或者通过单次或连续给药来治疗急性病。围化疗期的给药和恶性肿瘤的治疗
补体系统的活化还可能参与恶性肿瘤的发病机制。最近，使用多克隆抗体或单克隆抗体以及链霉抗生物素一生物素一过氧化物酶技术，对17个乳腺癌样品和6个良性乳腺肿瘤 样品中的C5b-9补体复合物新抗原、IgG、C3、C4、S蛋白/玻连蛋白、纤连蛋白和巨噬细胞进行了定位。所有的癌组织样品在每个 !阶段，都有C5b-9沉积在肿瘤细胞膜上，有细颗粒沉积在细胞残留物上，并且坏死区域中出现弥散性沉积物(Niculescu，F.等，办 . J.Pathol. 7初1039-1043，1992)。此外，补体活化可能是化学疗法或放射治疗的结果，因此抑制补体活化可能用作恶性肿瘤治疗的辅助治疗以减少医源性炎症。手术之前进行化学治疗和放射治疗时，C5b-9的沉积更多更久。在所有良性病变样品中都不存在C5b-9沉积物。S蛋白/玻连蛋白呈原纤维状沉积物存在于结缔组织基质中，呈弥散性沉积物存在于肿瘤细胞周围，不如纤连蛋白沉积得多而持久。IgG、C3和C4沉积物只存在于癌样品中。乳腺癌中C5b-9沉积物的存在表示补体活化及其随后的致病效应(Niculescu, Y 等，Am. J. Pathol. 7^(9:1039-1043,
1992)。脉冲式可调谐染料激光(577 nm) (PTDL)治疗诱导了血红蛋白凝固和组织坏死，这主要限于血管中。在经PTDL照射的正常皮肤的研究中，主要发现如下1) C3片段、CS、C9和MAC沉积在血管壁上；2)这些沉积物不是由于蛋白变性，因为它们仅仅在照射后7分钟就很明显了，与运铁蛋白立即沉积在红细胞凝固部位上不同；3)显示C3沉积物通过替代途径放大了补体活化，这是特异性的反应，因为组织坏死本身并不导致这种放大作用；和4)这些反应是在多形核白细胞局部累积之前发生的。在血管瘤中组织坏死更明显。坏死中心的较大血管瘤血管并不显著地固定补体。相反，位于外周血管中的补体沉积类似于正常皮肤中所观察到的沉积，除了一个例外在激光治疗后立即在一些血管中检测到CS、C9和MAC,这个发现与没有C5转化酶形成而直接发生MAC装配相一致。这些结果表明，补体在PTDL诱导的血管坏死中被激活，并可能是随后的炎症反应的原因。肿瘤的光动力学疗法(TOT)引起了强烈的宿主免疫应答，其表现之一是显著的嗜中性粒细胞增多。除了由于PDT诱导的补体活化而释放的补体片段(直接介质)以外，还有至少12种由于补体活性而引起的间接介质。后者包括细胞因子IL-I ^、TNF-a、IL-6、L-10、G-CSF和KC、血栓烷、前列腺素、白三烯、组胺和凝血因子(Cecic，I.等，CmcerLett. 7^:43-51,2002)。最后，可以展望MASP-2依赖性补体活化的抑制剂与标准治疗方案联用以治疗癌症。例如，用利妥昔单抗(rituximab),即一种嵌合抗CD20单克隆抗体进行治疗可能与中度至严重的首剂不利作用相关，特别是在具有大量循环肿瘤细胞的患者中。在最近的首次输注利妥昔单抗的研究中，在5位复发的轻度非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中，测得补体活化产物(C3b/c和C4b/c)和细胞因子(肿瘤坏死因子a (TNF-a)、白介素6 (IL-6)和IL-8)。输注利妥昔单抗诱导快速的补体活化，其先于TNF- a、IL-6和IL_8的释放。尽管研究组小，但是补体活化水平似乎是与输注前的循环B细胞数量有关(r = 0. 85 ；P = 0.07)，并与副作用的严重性有关。这些结果表明，补体在利妥昔单抗治疗副作用的发生机制中起着关键作用。因为不能用皮质类固醇防止补体活化，所以研究补体抑制剂在利妥昔单抗首次用药期间的可能作用中具有重大意义(van der Kolk, L. E.等，i r. J. Haematol. 77^:807-811,2001)。在本发明另一个方面，提供用于抑制待接受化学疗法和/或放射疗法治疗的受试者的MASP-2依赖性补体活化的方法，所述疗法包括但不限于癌症状况治疗。该方法包括将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物在围化疗期，即在实施化学疗法和/或放射疗法之前和/或期间和/或之后给予患者。例如，可以在实施化学疗法或放射疗法之前或者实施化学疗法或放射疗法同时给予本发明的MASP-2抑制剂组合物，并在整 个治疗过程中持续，以减轻化学疗法和/或放射疗法在非目标健康组织中的有害影响。此夕卜，可以在化学疗法和/或放射疗法之后给予MASP-2抑制剂组合物。要理解的是，化学疗法和放射疗法方案经常需要重复治疗，因此MASP-2抑制剂组合物的给药也可重复，并与化学疗法和放射疗法相对一致。还认为MASP-2抑制剂可用作化疗药物，单用或与其它化疗药物和/或放射疗法联用，以治疗患有恶性肿瘤的患者。可以适当通过口服(用于非肽能药物)、静脉内、肌内或其它非肠道途径给药。内分泌疾病
最近还发现与少数几种内分泌疾病或失调有关的补体系统，包括桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis) (Blanchin, S.等，Exp. Eye Res. 73(6) : 887-96, 2001) >应激、焦虑症以及其它涉及自垂体调节性释放的催乳素、生长因子或胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素的潜在的激素失调(Francis，K.等，MSEB J. 77:2266-2268，2003 ;Hansen, T. K. , Endocrinology 144(12) : 5422-9, 2003)。使用例如激素和细胞因子这类分子，在内分泌系统和免疫系统之间形成了双向沟通。最近，阐明了一条新途径，通过该途径，补体衍生的细胞因子C3a刺激垂体前叶激素释放并激活对应激反应和炎症控制的反射中枢下丘脑一垂体一肾上腺轴。C3a受体在分泌垂体激素的细胞和不分泌垂体激素的(滤泡星形(folliculostellate))细胞中表达。C3a和脱Arg的C3a (非炎性代谢物)刺激垂体细胞培养物释放催乳素、生长激素和促肾上腺皮质激素。体内给予重组C3a和脱Arg的C3a时，这些激素以及肾上腺皮质酮的血清水平以剂量依赖性方式增加。这就表明补体途径通过与内分泌垂体腺的沟通来调节组织特异性和全身性炎症反应(Francis, I 等，FASEB J. 77:2266-2268，2003)。越来越多的动物和人体研究表明，生长激素(GH)和胰岛素样生长因子I (IGF-I)调节免疫功能。GH疗法增加垂危患者的死亡率。过量的死亡几乎完全是由败血症性休克或多器官衰竭所致，这表明可能涉及GH诱导的免疫和补体功能的调节。甘露聚糖结合凝集素(MBL)是在先天免疫中通过结合糖结构之后激活补体级联和炎症而起重要作用的血浆蛋白。有证据支持，生长激素对MBL水平有重要影响，因此可能对凝集素依赖性补体活化有重要影响(Hansen, T. K. , Endocrinology 144 {12) : 5422-9，2003)。甲状腺过氧化物酶(TPO)是参与自身免疫性甲状腺疾病的一种主要的自身抗原。TPO由大的N末端髓过氧化物酶样模块(module)、其后是补体调控蛋白(CCP)样模块和表皮生长因子样模块组成。CCP模块是参与C4补体成分活化的分子组分,在自身免疫性疾病中研究C4能否结合TPO并激活补体途径。TPO通过其CCP模块直接激活补体，而无需Ig的任何介导。而且，在桥本甲状腺炎患者中，甲状腺细胞过量表达C4和该补体途径的所有下游成分。这些结果表明，TPO连同与补体途径活化有关的其它机制一起，可能是桥本甲状腺炎中观察到的大量细胞遭破坏的原因(Blanchin，S.等，2001)。因此，本发明一方面提供用于抑制MASP-2依赖性补体活化以治疗内分泌疾病的方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有内分泌疾病的受试者实施。根据本发明进行治疗的疾病以非限制性实例方式包括桥本甲状腺炎、应激、焦虑症以及其它涉及自垂体调节性释放的催乳素、生长因子或胰岛素样生长因 子和促肾上腺皮质激素的潜在的激素失调。可全身性给予受试者MASP-2抑制剂，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能抑制剂可口服给予。MASP-2抑制剂组合物可以与一种或多种另外的治疗药物联用。可按照医师规定重复给药直到疾病消退。眼科疾病
年龄相关性黄斑变性(AMD)是累及数百万成人的致盲疾病，然而对导致AMD发生的生物化学、细胞和/或分子事件的后遗症了解甚少。AMD导致黄斑的渐进性破坏，这与位于黄斑内及其周围、视网膜后以及视网膜色素上皮(RPE)与脉络膜之间的称为脉络膜小疣(drusen)的胞外沉积物的形成有关。最近的研究揭示，与炎症和免疫介导过程相关的蛋白质在脉络膜小疣相关成分中是普遍的。已经在视网膜、RPE和脉络膜细胞检测到编码许多这类分子的转录物。这些数据还证实，作为有效抗原呈递细胞的树突细胞与脉络膜小疣的发生密切相关，补体活化是脉络膜小疣内部以及沿着RPE-脉络膜界面的关键途径(Hageman, G. S.等，Prog. Retin.办<9 Tfes. : 705-732, 2001)。若干项独立研究表明，AMD与补体H因子(CFH)基因的遗传多态性之间有强关联性，其中在危险性等位基因纯合的个体中AMD的可能性增加了 7.4倍(Klein，R. J.等，Science, 362-364, 2005 ；Haines 等，Science 308 : 362-364, 2005 ;Edwards 等，Science 263-264, 2005)。CFH基因已经被定位在染色体lq31，这是一个在AMD中涉及6个独立连锁扫描(linkage scan)的区域(参见例如Schultz, D. ff.等,Hum. Mol. Genet.
3315，2003)。已知CFH是补体系统的关键调节因子。研究显示，细胞上和循环中的CFH通过抑制将C3激活成为C3a和C3b以及通过钝化现有的C3b来调节补体活性。已经在AMD患者的玻璃膜(Brusch’ s membrane)、毛细血管间支柱(intercapillary pillar)中以及脉络膜小疣内部观察到C5b-9的沉积(Klein等)。免疫荧光实验表明，在AMD中CFH的多态性可能引起补体沉积在脉络膜毛细血管和脉络膜血管中(Klein等)。膜结合补体抑制剂补体受体I也定位在脉络膜小疣中，但是在RPE细胞中用免疫组织化学法无法检测出。相比之下，第二膜结合补体抑制剂膜膜辅因子蛋白存在于脉络膜小疣结合的RPE细胞中以及脉络膜小疣内部的小的球形亚结构组分中。这些以前未鉴定出的组分对特征性沉积在补体活化部位的补体成分C3的蛋白水解片段也具有强的免疫反应性。有研究认为这些结构代表来自作为补体攻击目标的退行性RPE细胞的残余碎片(Johnson, L. V.等，Exp. Eye Res. 887-896，2001)。这些多补体调节剂以及补体活化产物(C3a、C5a、C3b、C5b_9)的鉴定和定位使研究者断定，慢性补体活化在脉络膜小疣生物发生过程和AMD病因中起着重要作用(Hageman等，Progress Retinal Eye Res.勿:705-32，2001)。在脉络膜小疣中鉴定出C3和C5活化产物，并不会让人认了解补体是通过经典途径还是通过凝集素途径或替代放大环路活化，正如本发明所了解的一样，因为C3和C5两者是所有三条途径共有的。然而，两项研究使用对经典途径活化必不可少的识别成分Clq特异性的抗体，对脉络膜小疣免疫标记进行了探索(Mullins 等，J 835-846, 2000 ;Johnson 等，/ . Eye Res. 7<9:441-449,
2000)。两项研究都得出结论，认为在脉络膜小疣中一般观察不到Clq免疫标记。这些有关Clq的否定结果表明，脉络膜小疣中的补体活化不是通过经典途径产生的。另外，Mullins等人的研究(2000)报道了脉络膜小疣的免疫复合物组分(IgG轻链、IgM)的免疫标记是微弱可变的，这进一步表明经典途径在该疾病过程期间发生的补体活化中起着次要作用。 最近，两篇已发表的研究报告对小鼠(一种人CNV模型)中补体在激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)的发展中的作用进行了评价。Bora及其同事(2005)采用免疫组织学方法发现，在激光处理后，补体活化产物C3b和C5b-9 (MAC)在新血管复合体上的显著沉积(Bora等，J. Immunol. 77么491-7，2005)。重要的是，在C3遗传缺陷型小鼠(C3-/-小鼠)中不发生CNV，C3是所有补体活化途径所需的必不可少的成分。在激光诱导的CNV后，对小鼠眼组织中的3种涉及CNV的血管生成因子VEGF、TGF- P 2和P -FGF的RNA信息水平进行了评价。值得注意的是，补体缺失导致这些血管生成因子的RNA水平明显降低。Nozaki及其同事采用ELISA方法，证实了在激光诱导的CNV进程的早期产生了有效的过敏毒素 C3a 和 C5a (Nozaki 等，/Natl. Acad. Sci. U. S. A. 7似:2328-33，2006)。此外，在野生型小鼠中，将C3和C5的这两种生物活性片段注射到玻璃体腔之后诱导VEGF表达。与这些结果一致，Nozaki及其同事还表明遗传上去除C3a和C5a的受体减少激光损伤后的VEGF表达和CNV形成，抗体介导的C3a或C5a中和或其受体的药理阻断也减少CNV。之前的研究证实，白细胞募集，特别是巨噬细胞募集在激光诱导的CNV中起着关键作用(Sakurai 等，Opthomol. Vis. Sci. 44:3578-85, 2003 ；Espinosa-Heidmann等，Invest. Opthomol. Vis. Sci. 3586-92, 2003)。在 Nozaki 及其同事的论文(2006)中报道了在激光损伤后，C3aR(-/_)和C5aR(-/_)小鼠的白细胞募集显著减少。因此，本发明的一方面提供用于抑制MASP-2依赖性补体活化以治疗年龄相关性黄斑变性或其它补体介导的眼科疾病的方法，该方法通过将包含治疗有效量的MASP-2抑制剂在药物载体中的组合物给予患有这些疾病或其它补体介导的眼科疾病的受试者实施。可通过例如凝胶剂、软膏剂或滴剂形式的组合物经冲洗或敷用而局部给予眼部MASP-2抑制剂组合物。或者，可全身性给予受试者MASP-2抑制剂,例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给药，或者对于非肽能抑制剂可口服给予。MASP-2抑制剂组合物可与一种或多种另外治疗药物联用，另外的治疗药物公开于例如美国专利申请公开号2004-0072809-A1。可按照医师规定重复给药直到疾病消退或得到控制。凝血病已形成补体系统在弥散性血管内凝血("DIC")如显著身体外伤继发的DIC中的作用的证据。前述研究已显示，C4-/-小鼠不受免于肾再灌注损伤的保护(Zhou，ff.等人，"Predominant role for C5b_9 in renal ischemia/reperfusion injury,〃 J ClinInvest 7^:1363-1371 (2000))。为了研究C4_/_小鼠是否仍然能够经由经典或凝集素途径激活补体，在特异性针对经典或凝集素途径激活路线的试验中测定C4-/-血浆中的C3周转。尽管在经由经典途径触发激活时未能观察到C3裂解，但观察到C4缺陷血清中的C3的高效凝集素途径依赖性激活(图30)。能够看出，在MASP-2-/-小鼠体内，甘露聚糖和酵母聚糖上的C3b沉积严重受损，即使在根据许多先前发表的关于替代途径激活的论文，应该对于所有三条途径而言是允许的实验条件下。当使用由免疫球蛋白复合体包被而不是甘露聚糖或酵母聚糖包被的孔中的相同血清时，在MASP-2+/+小鼠血清和MASP-2-/-血清中看到C3b沉积和因子B裂解，而在Clq耗尽的血清中看不到。这表明，当经由经典活性提供初始的C3b时，在MASP-2-/-血清中促进了替代途径激活。图30C图示以下令人惊讶的发现C3能够在C4缺陷血浆中以凝集素途径依赖的形式被有效激活。
这个“C4旁路”通过经由用可溶性甘露聚糖或甘露糖预温育血浆的凝集素途径激活的抑制而废止。异常、非免疫性的补体系统的激活对人是具有潜在危险性的，并且可能还在血液途径激活中起重要作用，尤其是在其中炎性途径和血液途径均被激活的严重外伤的情况下。在正常的健康者体内，C3转化率是总血浆C3蛋白的〈5%。在猛烈的感染(包括败血症和免疫复合物病)中，C3转化率在补体水平常常低于正常水平的情况下以约30%重建自身，这归因于增加的利用和池(pool)分布的改变。大于30%的即时C3途径激活通常产生血管舒张和组织体液丧失的明显的临床证据。在30%C3转化率以上，引发机制主要是非免疫性的，并且导致的临床表现对患者有害。健康者体内和对照患病者体内的补体C5水平似乎远比C3更稳定。C5水平的显著降低和/或转化与患者对非正常多发伤(例如，道路交通事故)和可能形成休克肺综合症的反应相关联。因此，超过30%的血管池的补体C3激活的任何证据、或任何C5介入的任何证据、或两者可被认为可能是患者中有害病理变化的前兆。C3和C5两者均放出作用于释放血管舒张化合物的肥大细胞和嗜碱细胞的过敏毒素(C3a和C5a)。它们建立趋化性梯度以将多形核细胞(PMN)导向免疫干扰(一种有益的应答)的中心，但在这里它们不一样，因为C5a对这些吞噬细胞具有特异性凝块(凝集)作用，防止它们远离反应位点的随机移动。在感染的正常对照中，C3激活C5。然而，在多发伤中，C5似乎被广泛激活，系统地生成C5a过敏毒素。此不受控制的活性引起多形白细胞在血管系统内部凝块，并且然后这些凝块被扫入肺的毛细血管，它们由于过氧化物的放出而在其中滞留并且产生局部损伤作用。尽管不愿被理论限制，但该机制在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发病机理中或许是重要的，不过此见解最近受到了质疑。在体外，C3a过敏毒素能够显示为强有力的血小板凝聚体，但它们的体内介入较少被定义，并且伤口修复中的血小板物质和纤溶酶的释放可仅次要地包含补体C3。可能的是，C3激活的延时上升为生成DIC所必需。除以上概述的能够解释外伤与DIC之间的联系的被激活补体成分的细胞和血管效应之外，出现的科学发现识别了补体与凝血系统之间的直接分子连接和功能性交互。支持数据已从对C3缺陷小鼠的研究中获得。由于C3是各补体途径的共享成分，所以预测C3缺陷小鼠缺乏全部补体功能。然而，意外地，C3缺陷小鼠能够完美激活终端补体成分(Huber-Lang, M.等人，"Generation of C5a in the absence of C3: a new complementactivation pathway, 〃 Nat. Med 7J :682-687 (2006))。研究深入揭不，终端补体成分的C3依赖性激活是通过凝血酶(凝血级联的限速酶)介导的(Huber等人,2006)。初始补体活化之后介导凝血酶激活的分子成分仍然是难以捉摸的。本发明人阐明了什么被认为是补体与凝血级联之间的交互的分子基础，并且将MASP-2识别为连接该两个系统的中心控制点。除众所周知的C2和C4补体蛋白之外，对MASP-2的底物特异性的生化研究已将凝血酶原鉴定为可能的底物。MASP-2在功能相关的位点特异性裂解凝血酶原，生成凝血酶，即凝血级联的限速酶 (Krarup，A.等人，"Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated SerineProtease 2, " PLoS. ONE. 2:e623 (2007))。由MASP-2生成的凝血酶能够促进纤维蛋白在限定的重建的体外系统中的沉积，证明MASP-2裂解的功能相关性(Krarup等人，2007)。如以下本文实例中所论述，发明人通过证明凝集素途径激活之后正常啮齿动物血清内的凝血酶激活，进一步印证了这个发现的生理学意义，并且证明了这个过程通过中和MASP-2单克隆抗体而被阻断。MASP-2可在凝集素途径中代表中心分支点，能够促进补体系统和凝血系统两者的激活。由于凝集素途径激活是对许多类型的外伤性损伤的生理应答，所以本发明人认为，并发的(由补体成分介导的)系统性炎症和(经由凝血途径介导的)弥散性凝血能够通过MASP-2激活两个途径的能力来解释。这些发现清楚地表明MASP-2在DIC产生中的作用和MASP-2抑制在治疗或预防DIC中的治疗学益处。MASP-2可提供补体系统与凝血系统之间的分子连接，并且凝集素途径的激活在其发生在外伤的背景下时能够经由MASP-2凝血酶轴直接引发凝血系统的激活，提供外伤和DIC之间的机制联系。根据本发明的一个方面，MASP-2的抑制会抑制凝集素途径激活并且减少过敏毒素C3a和C5a两者的生成。据信，C3激活的延时上升为生成DIC所必需。所以，本发明的一个方面因而提供用于抑制MASP-2依赖性补体活化以治疗弥散性血管内凝血或其他补体介导的凝血障碍的方法，该方法通过向患有此类病症或处于发生此类病症风险中的受试者给予组合物来进行，该组合物包含药物载体中的治疗有效量的MASP-2抑制剂(例如，抗MASP-2抗体或其片段、肽抑制剂或小分子抑制剂)。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂能够阻断已被激活的MASP-2。将MASP-2抑制组合物适当给予受试者全身，诸如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、鼻、皮下或其他肠胃外给药，或对于非肽能剂而言可能通过口服给药。给药可按照医师决定而重复，直到已消除或控制病症为止。本发明的这个方面的方法可用于治疗DIC，其继发于败血症、包括神经性创伤(例如，急性颅脑损伤，见 Kumura, E.等人,Ka23-28 (1987))的严重外伤、感染(细菌、病毒、真菌、寄生虫)、癌症、产科并发症、肝病、严重中毒反应(例如，蛇咬伤、昆虫咬伤、输血反应)、休克、中暑、移植排异反应、血管动脉瘤、肝功能衰竭、通过化学治疗或放射治疗的癌症疗法、烧伤、意外福射暴露及其他病因。见(例如)Becker J. U.和Wira C. R. "DisseminatedIntravascular Coagulation" emedicine. medscape. com/9/10/2009。对于外伤或其他急性事件继发的DIC而言，MASP-2抑制组合物可在外伤性损伤之后立即给药，或在外伤诱发损伤或状况(诸如对被认为处于DIC风险中的患者的手术)之前、期间、紧接着或之后一至七天或更长时间内(诸如在24小时至72小时内)给药。在一些实施方案中，MASP-2抑制组合物可以速效剂型适当给药，诸如通过包含MASP-2抑制剂组合物的溶液滴注剂的静脉内或动脉内输送。IV. MASP-2 抑制剂
一方面，本发明提供抑制MASP-2依赖性补体活化的不利作用的方法。MASP-2抑制剂是以有效抑制有生命的受试者的MASP-2依赖性补体活化的量给予的。在本发明这个方面的实施中，代表性的MASP-2抑制剂包括抑制MASP-2生物活性的分子(例如小分子抑制齐U、抗MASP-2抗体或者与MASP-2相互作用或妨碍蛋白间相互作用的封闭性肽)，以及减少MASP-2表达的分子(例如MASP-2反义核酸分子、MASP-2特异性RNAi分子和MASP-2核酶)，从而阻止MASP-2激活替代补体途径。MASP-2抑制剂可单独使用作为主要疗法，或者与其它治疗药物联用作为辅助疗法以增强其它药物治疗的治疗益处。MASP-2依赖性补体活化抑制以补体系统成分的至少一种以下的变化为特征，所述 变化是由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制剂所致:MASP-2依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b_9 (MAC)形成或产生的抑制(测定法参见例如实施例2)、使用未致敏兔或豚鼠红细胞在溶血分析中评价的替代补体活化的减少、C4裂解和C4b沉积的减少(测定法参见例如实施例2)，或者C3裂解和C3b沉积的减少(测定法参见例如实施例2)。根据本发明，使用有效抑制MASP-2依赖性补体活化系统的MASP-2抑制剂。用于实施本发明这个方面的MASP-2抑制剂包括例如抗MASP-2抗体及其片段、MASP-2抑制肽、小分子、MASP-2可溶性受体和表达抑制剂。MASP-2抑制剂可通过阻断MASP-2的生物学功能而抑制MASP-2依赖性补体活化系统。例如，抑制剂可有效阻断MASP-2蛋白间的相互作用，阻碍MASP-2 二聚化或装配，阻断Ca2+结合，阻碍MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点，或者可减少MASP-2蛋白表达。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂选择性抑制MASP-2补体活化，保持了 Clq依赖性补体活化系统功能上的完整性。在一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-2抑制剂是特异性的MASP-2抑制剂，其与包含SEQ ID NO:6的多肽特异性结合的亲和力是与补体系统中的其它抗原结合的亲和力的至少10倍高。在另一个实施方案中，MASP-2抑制剂与包含SEQ ID N0:6的多肽特异性结合的结合亲和力是与补体系统中的其它抗原结合的结合亲和力的至少100倍高。MASP-2抑制剂的结合亲和力可使用合适的结合测定法进行测定。MASP-2多肽具有类似于Cl补体系统的蛋白酶MASP-I、MASP-3以及Clr和Cls的分子结构。SEQ ID N0:4所示的cDNA分子编码MASP-2的代表性实例(由SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列组成)，提供带有前导序列(氨基酸1-15)的人MASP-2多肽，分泌后被切害I]，产生成熟形式的人MASP-2 (SEQ ID N0:6)。如图2中所示，人姻5P 基因包括十二个外显子。人MASP-2 00嫩由外显子8、(、0、？、6、11、1、1、1(和1编码。可变剪接产生了 20kDa蛋白，称为MBL相关的蛋白19 ( “MApl9”，亦称“sMAP”)(SEQ ID NO: 2)，由图2所示外显子B、C、D和E产生的(SEQ ID NO: I)编码。SEQ ID NO: 50所示的cDNA分子编码鼠MASP-2 (由SEQ ID NO: 51所示的氨基酸序列组成)，提供带有前导序列的鼠MASP-2多肽，分泌后被切割，产生成熟形式的鼠MASP-2 (SEQ ID N0:52)。SEQ ID NO:53所示的cDNA分子编码大鼠MASP-2 (由SEQ ID N0:54所示的氨基酸序列组成)，提供带有前导序列的大鼠MASP-2多肽，分泌后被切割，产生成熟形式的大鼠MASP-2 (SEQ ID N0:55)。本领域技术人员应理解的是，SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:50和SEQ ID NO:53中公开的序列分别代表人、小鼠和大鼠MASP-2的单个等位基因，发生等位基因变异和可变剪接是预料之中的。SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:50和SEQ ID NO:53所示核苷酸序列的等位基因变体，包括含有沉默突变的变体以及其中导致氨基酸序列改变的突变的变体，都属本发明的范围。可根据标准方法，通过探测cDNA或基因组文库而从不同个体中克隆MASP-2序列的等位基因变体。人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:6)的结构域见图3A，包括N端Clr/Cls/海胆Vegf/骨形成蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:6的氨基酸1_121)、表皮生长因子样结构域(氨基酸122-166)、第二 CUBI结构域(氨基酸167-293)以及串联的补体调控蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。HSd J基因的可变剪接产生图3B中所示的MApl9。MAp19是含有MASP-2的N端CUBl-EGF区的非酶蛋白，具有得自图2所示外显子E的4个额外残基(EQSL)。
研究表明，一些蛋白质通过蛋白间的相互作用与MASP-2结合或者与MASP-2相互作用。例如，已知MASP-2结合凝集素蛋白MBL、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白，并与之形成Ca2+依赖性复合物。研究表明，每种MASP-2/凝集素复合物通过蛋白质C4和C2的MASP-2依赖性裂解来激活补体(Ikeda, K 等，7； Biol. Chem.之似:7451-7454，1987 ；Matsushita, M.等，Exp. Med. 77^:1497-2284,2000 ；Matsushita, M.等，/ Immunol. 7你:3502-3506，2002)。研究表明，MASP-2 的 CUB1-EGF 结构域对于 MASP-2 与 MBL的缔合是必不可少的(Thielens, N. M.等，J. Immunol. 166:5068, 2001) 研究还表明，CUB1EGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化，这是形成活性MBL复合物所需要的(Wallis，R.等,J. Biol. Chem. 275:30962-30969,2000^ 因此，可对结合已知对 MASP-2 依赖性补体活化重要的MASP-2靶区或者阻碍该区域的MASP-2抑制剂进行鉴定。抗MASP-2 抗体
在本发明这个方面的一些实施方案中，MASP-2抑制剂包括抑制MASP-2依赖性补体活化系统的抗MASP-2抗体。用于本发明这个方面的抗MASP-2抗体包括得自任何产生抗体的哺乳动物的多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，并且可以是多特异性的、嵌合的、人源化的、抗独特型抗体以及抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab’、F (ab) 2、F (ab’)2、Fv片段、scFv片段和单链抗体，见本文的进一步描述。文献中记载了几种抗MASP-2抗体，其中的一些列于下表I。可使用本文所述测定法筛选前述抗MASP-2抗体抑制MASP-2依赖性补体活化系统的能力。例如，已经鉴定出阻断MASP-2依赖性补体活化的抗大鼠MASP-2 Fab2抗体，详情见本文实施例24和25。一旦鉴定出发挥MASP-2抑制剂作用的抗MASP-2抗体，就可将它用于产生抗独特型抗体，并用于鉴定其它MASP-2结合分子，如见下文进一步描述的。表I :来自文献的MASP-2特异性抗体
权利要求
1.一种抑制患有凝血障碍或处于发生凝血障碍的风险中的受试者中的MASP-2依赖性补体活化的方法，该方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂给予所述受试者。
2.权利要求I的方法，其中所述患者患有弥散性血管内凝血或处于发生弥散性血管内凝血的风险中。
3.权利要求I的方法，其中所述MASP-2抑制剂与包含SEQID NO: 6的多肽特异性结口 ο
4.权利要求I的方法，其中所述MASP-2抑制剂与包含SEQID NO: 6的多肽特异性结合的亲和力是其与补体系统中的不同抗原结合的亲和力的至少10倍高。
5.权利要求3的方法，其中所述MASP-2抑制剂与所述多肽在SEQID NO: 6的氨基酸残基1-176内的位置结合。
6.权利要求I的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与部分SEQID NO:6特异性结合的抗体或其片段。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体或其片段是单克隆的。
8.权利要求6的方法，其中所述抗体或其片段是多克隆的。
9.权利要求6的方法，其中所述抗体或其片段是重组抗体。
10.权利要求6的方法，其中所述抗体具有降低的效应子功能。
11.权利要求6的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
12.权利要求6的方法，其中所述抗体在MASP-2缺陷型转基因动物中产生。
13.权利要求I的方法，其中所述MASP-2抑制剂是从选自以下的多肽衍生的肽 人MASP-2、抑制MASP-2的人MBL、抑制MASP-2的人H-纤维胶凝蛋白、抑制MASP-2的人M-纤维胶凝蛋白、抑制MASP-2的人L-纤维胶凝蛋白和抑制MASP-2的人C4。
14.权利要求I的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与包含SEQID NO:6的多肽特异性结合的非肽剂。
15.权利要求14的方法，其中所述MASP-2抑制剂与所述多肽在SEQID NO:6的氨基酸残基1-176内的位置结合。
16.一种抑制患有凝血障碍或处于发生凝血障碍的风险中的受试者中的MASP-2依赖性补体活化的方法，该方法包括将有效选择性抑制MASP-2依赖性补体活化但基本上不抑制Clq依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂给予所述受试者。
17.权利要求16的方法，其中所述患者患有弥散性血管内凝血或处于发生弥散性血管内凝血的风险中。
18.权利要求16的方法，其中所述MASP-2抑制剂与包含SEQID NO:6的多肽特异性
19.权利要求18的方法，其中所述MASP-2抑制剂与所述多肽在SEQID NO:6的氨基酸残基1-176内的位置结合。
20.权利要求16的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与部分SEQID NO:6特异性结合的抗体或其片段。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体或其片段是单克隆的。
22.权利要求20的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
23.权利要求20的方法，其中所述抗体在MASP-2缺陷型转基因动物中产生。
24.权利要求16的方法，其中所述MASP-2抑制剂是从选自以下的多肽衍生的肽 人MASP-2、抑制MASP-2的人MBL、抑制MASP-2的人H-纤维胶凝蛋白、抑制MASP-2的人L-纤维胶凝蛋白和抑制MASP-2的人C4。
25.权利要求16的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与包含SEQID NO: 6的多肽特异性结合的非肽剂。
26.一种制备用于抑制患有补体介导的凝血障碍的有生命的受试者中的MASP-2依赖性补体活化的作用的药物的方法，该方法包括将治疗有效量的MASP-2抑制剂组合在药物载体中。
27.一种在有需要的受试者中治疗弥散性血管内凝血、预防弥散性血管内凝血或降低弥散性血管内凝血的严重程度的方法，所述方法包括给予所述受试者组合物，所述组合物 包含有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂。
28.权利要求27的方法，其中将所述组合物全身给予所述受试者。
29.权利要求27的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或状况败血症、外伤、恶性肿瘤、移植排斥、输血反应、产科并发症、血管动脉瘤、肝功能衰竭、中暑、烧伤、辐射暴露和严重毒性反应。
30.权利要求27的方法，其中所述受试者患有神经学创伤。
31.权利要求27的方法，其中所述受试者患有细菌感染。
32.权利要求31的方法,其中所述细菌感染是脑膜炎奈瑟氏菌0 meningitidis')感染。
33.权利要求27的方法，其中所述MASP-2抑制剂与包含SEQID NO:6的多肽特异性彡口口
34.权利要求27的方法，其中所述MASP-2抑制剂与包含SEQID NO:6的多肽特异性结合的亲和力是其与补体系统中的不同抗原结合的亲和力的至少10倍高。
35.权利要求33的方法，其中所述MASP-2抑制剂与所述多肽在SEQID NO:6的氨基酸残基1-176内的位置结合。
36.权利要求27的方法，其中所述MASP-2抑制剂是与部分SEQID NO:6特异性结合的抗体或其片段。
全文摘要
一方面，本发明提供抑制有生命的受试者中MASP-2依赖性补体活化的作用的方法。在一个实施方案中，本发明提供治疗患有诸如弥散性血管内凝血的补体介导凝血障碍的受试者的方法。该方法包括将有效抑制MASP-2依赖性补体活化的量的MASP-2抑制剂给予有需要的受试者的步骤。在一些实施方案中，所述MASP-2抑制剂抑制与MASP-2介导的替代补体途径活化有关的细胞损伤，同时保持免疫系统的经典(Clq依赖性)途径成分的完整。另一方面，本发明提供用于抑制凝集素依赖性补体活化的作用的组合物，所述组合物包含治疗有效量的MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体。
文档编号A61K39/395GK102781471SQ201080056358
公开日2012年11月14日 申请日期2010年10月15日 优先权日2009年10月16日
发明者C.E.特德福德, G.A.德莫普罗斯, H.施维布尔, J.B.帕伦特, T.A.杜德勒 申请人:奥默罗斯公司, 莱斯特大学