微流体装置的再生的制作方法

专利名称：微流体装置的再生的制作方法
微流体装置的再生相关申请的交叉引用本申请要求2009年11月30日提交的美国临时专利申请No. 61/265，325的优先权，其通过引用全文并入本文。
背景技术：
微流体装置为核酸分析领域(尤其是包括核酸扩增的分析领域)带来了ー场革命。适当设计的装置可用作分析工具来測定特定的目的靶核酸在样品中是否存在、检测或表征与疾病或遗传异常相关联的等位基因、进行基因分型分析和基因表达分析、用于核酸测序以及其他应用。在一个实施方案中，可以以制备性方式使用所述装置，以扩增出足以用于进ー步分析的核酸。可通过设计可重复使用的微流体装置尤其是可重复使用的基于弾性体的微流体装置来降低分析成本。然而，重复使用这样的装置有许多障碍。局限性之一与核酸分析的灵敏度相关，其中单个核酸分子也可被检测到。这样，来自上ー轮分析的即便微小量的污染也可使被重新使用的装置不可靠。附图简述图I是显示可重复使用的微流体芯片中选定的室、通道和阀的示意图。图2是概述再生的微流体芯片之应用的流程图。“NAI溶液”是“核酸失活溶液Uiucleic acid inactivating solution)”。图3A D显示简化的示意图，其显示本发明ー个实施方案的操作过程中通过微流体装置的流体流。图4显示实验结果，其中在两个装置的每ー个中先后进行6个PCR扩增，在扩增之间再生所述装置。在毎次反应中，按照下文实施例中的描述用阳性对照和阴性对照对微流体装置进行上样。获得实时PCR的热图，以评价在再生之后装置的可靠性。显示了 Ct和Ct的标准差。第二列中显示第一芯片的结果，且第三列中显示第二芯片的結果。图5是从美国专利No. 7，476，363修改而来的示意图，显示可重复使用的微流体芯片中选定的室、通道和阀。图6是从美国专利No. 7，476，363修改而来的示意图，显示可重复使用的微流体芯片中选定的室、通道和阀。图7是从美国专利公开No. 2008/0223721修改而来的示意图，显示可重复使用的微流体芯片中选定的室、通道和阀。图8是从美国专利No. 7，476，363修改而来的示意图，显示可重复使用的微流体芯片中选定的室、通道和阀。图9是本发明一个实施方案的载体和微流体装置的简化透视图。图IOA D图示用于均勻计量泵送(uniform meter pumping)的方法。图IOA :膨胀泵送(Dilation Pumping);图 IOB :单侧膨胀泵送(Single SidedDilation Pumping);图 10CB :螺动泵送(Peristaltic Pumping);图 10D :限流阻碍物泵送(Limiting Resistor pumping)。这些图表仅是代表性的，并不意在限制本发明的范围。要理解的是，图中所示的示例性流体回路不一定包括了工作装置中所使用的所有阀。根据所选择的具体构造，工作装置所使用的阀可以比所示的更少。

发明内容
在ー个方面中，本发明提供用于使微流体装置适于在核酸分析中重复使用的方法，所述方法通过a)通过泵送使核酸失活溶液流入所述装置的微流体通道；并且随后b)通过泵送使清洗溶液流入所述通道从而置换所述通道中的所述核酸失活溶液，由此使来自之前使用所述装置的任何残留核酸失活。在一个实施方案中，所述微流体装置包含多个微流体反应室，其各自与所述微流体通道流体连接。在一个实施方案中，所述微流体反应室包含来自之前使用所述装置的残留核酸。在一个实施方案中，本发明提供用于从弾性体微流体装置中除去残留核酸的方 法，其通过a)使核酸失活溶液流入微流体空间，其中所述微流体空间包含i)第一微流体通道， )多个微流体反应室，其沿所述通道排列成串，并且各自与所述通道微流体相连，其中所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弾性体部分发生形变的压力和条件下引入所述微流体空间，并且b)使所述核酸失活溶液流过所述微流体空间，并从所述微流体空间除去所述核酸失活溶液，这通过泵送来实现。在一个实施方案中，所述微流体空间包含多个第一微流体通道，其各自与多个微流体反应室微流体相连。在一些实施方案中，所述泵送包括第一过程和/或第二过程，其中所述第一过程包括i)使来自第一核酸失活溶液来源的核酸失活溶液通过第一微流体通道流入至少ー个微流体反应室中，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的弾性体部分发生形变的压力和条件下引入所述微流体空间；并且随后， )关闭ー个或更多个第一输入阀以使所述失活溶液来源与所述至少ー个微流体反应室隔离；并且随后，iii)打开ー个或更多个第一输出阀以允许流体流出微流体空间；并且其中所述第二过程包括i)使来自第二核酸失活溶液来源的核酸失活溶液通过多个接ロ通道流入所述多个微流体反应室中，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的弾性体部分发生形变的压力和条件下引入所述微流体空间；并且随后，ii)关闭ー个或更多个阀以使所述失活溶液来源与所述多个接ロ通道隔离；其中所述阀是接ロ阀或第二输入阀，并且随后，iii)打开ー个或更多个第二输出阀(其可以与第一输出阀相同或不同)，以允许流体流出所述微流体空间；其中所述第二核酸失活溶液来源可以与所述第一核酸失活溶液来源相同或不同。在一些实施方案中，在所述第二过程中，每个接ロ通道将单个微流体反应室与单个微流体反应室相连接，每个接ロ通道具有与其相关联的接ロ阀，用于控制所述单个反应室与所述单个试剂室之间的流体连通，并且当所述ー个或更多个第二输入阀打开时，每个反应室与所述第二核酸失活反应来源流体连通。在一些实施方案中，所述第一过程包括使来自第一核酸失活溶液来源的核酸失活溶液经由进样通道(slug channel)通过所述第一微流体通道流入至少ー个微流体反应室；并且所述第二过程包括使来自第二核酸失活溶液来源的核酸失活溶液经由进样通道通过多个接ロ通道流入所述多个微流体反应室。在ー些实施方案中，泵送仅包括所述第一过程(其被重复至少一次)，或者泵送仅包括所述第二过程(其被重复至少一次)，或者泵送包括所述第一过程和所述第二过程，其中每个过程可被重复，并且其中根据预定的模式实施所述过程。在一些实施方案中，所述方法还包括通过以下来除去核酸失活溶液a)使清洗溶液遵循核酸失活溶液流入微流体空间的路径流入所述微流体空间，b)通过泵送使所述清洗溶液流过所述微流体空间，以及c)从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液。在一些实施方案中，所述方法还包括通过以下来除去核酸失活溶液a)使清洗溶液遵循至少ー个不同于核酸失活溶液流入微流体空间之路径的路径流入所述微流体空间，b)通过泵送使所述清洗溶液流过所述微流体空间，以及c)从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液。在一些实施方案中，所述方法包括通过使清洗溶液流过微流体空间而除去核酸失活溶液，其中a)如果根据第一过程引入所述核酸失活溶液，则通过第三过程使所述清洗溶液流过所述装置，所述第三过程包括i)使来自清洗溶液来源的清洗溶液流入所述第一微流体通道并且流入至少ー个微流体反应室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弹性体部分发生形变的条件和压カ下引入所述微流体空间，并且随后，ii)关闭ー个或更多个 第三输入阀以使所述微流体空间与所述清洗溶液来源隔离；并且随后，iii)打开ー个或更多个第三输出阀(其可以与所述第一输出阀相同或不同)，以允许流体流出所述微流体空间；以及b)如果根据所述第二过程引入所述核酸失活溶液，则通过第四过程使所述清洗溶液流过所述装置，所述第四过程包括i)使来自清洗溶液来源的清洗溶液流过所述多个接ロ通道进入至少ー个微流体试剂室或至少ー个微流体反应室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弾性体部分发生形变的条件和压カ下引入所述微流体空间，并且随后，ii)关闭ー个或更多个第四输入阀(其可以与所述第一输入阀相同或不同)，以使所述清洗溶液来源与所述微流体空间隔离；或者关闭所述接ロ阀，从而使所述清洗溶液来源与所述微流体空间隔离；并且随后，iii)打开ー个或更多个第四输出阀(其可以与所述第一输出阀相同或不同)，以允许流体流出所述微流体空间。
具体实施例方式本发明提供用于从弾性体微流体装置中除去残留核酸的方法。术语“微流体装置”具有本领域中通常的意义，指这样的装置，其包含可流过液体的微流体通道(例如，至少有ー个横截面尺寸小于500微米的通道)，以及在关闭时能阻断液体流过通道的阀。“微流体装置”还可包含体积小于或等于IOOnl (例如，小于或等于40nl，小于或等于10nl，或者小于或等于2nl)的室。“弾性体微流体装置”是具有至少ー个用弾性体制成的微流体组件(例如，层或者通道或室的壁)的微流体装置。在一些实施方案中，限定出所述装置的通道和室的大多数或基本全部材料由弾性体材料构成。下文中和下文中所引用的參考文献中描述了示例性的弾性体微流体装置以及制造方法。在一些实施方案中，所述弾性体是聚ニ甲基硅氧烷(,polydimethylsiloxane, PDMS)。使用弾性体微流体装置用于核酸分析是本领域公知的。核酸分析的实例包括但不限于PCR扩增、等温扩增、杂交、逆转录、核酸测序和其他反应，其中核酸可引入所述装置中，或者在所述装置中修饰或产生(例如，产生PCR扩增子)。引入核酸的一个实例是将含有DNA和RNA的细胞引入装置中。ー轮核酸分析之后，在后续的使用之前，必须除去所述装置中剰余的任何残留核酸分子以避免干扰后续的分析。本文中使用的“残留核酸”是指多次使用装置中必须在使用该装置进行核酸分析之前被除去的核酸分子。残留核酸可以是任何种类的核酸分子，包括例如单或双链的RNA或DNA、引物、探针、扩增子、基因组DNA、重组DNA等。
本文中使用的术语“除去残留核酸”意为在处理之后，在所述微流体装置中检测不到污染核酸。在一个实施方案中，当在所述装置中使用引物(其已知扩增在前ー轮分析的过程中引入或产生的核酸)进行扩增反应(例如，PCR)吋，检测不到污染核酸。參见例如下文中的实施例。不意在受具体机制的限制，残留核酸的除去可包括降解核酸(例如，通过水解)以及将核酸分子或片段或衍生物物理转移出所述装置。当核酸不能在核酸反应(例如，聚合酶链式反应)中发挥引物、探针或模板作用吋，则所述核酸是失活的。可通过使残留核酸与核酸失活溶液相接触来实现对残留核酸的失活。核酸失活溶液的实例包括酸溶液(例如，< PH 4)，以及含有氧化剂(例如，过氧化氢)、酶(例如，DNA酶)等的溶液。优选的核酸失活溶液是漂白剤(次氯酸钠)。核酸失活溶液的另ー个实例是含有补骨脂素(psoralen)的溶液。核酸失活溶液的另ー个实例是氢氧化钠溶液(例如，>pH 10)。可组合使用或依次使用两种或两种以上上述试剂的组合。在一个实施方案中，本发明的方法包括使核酸失活溶液流入微流体空间，其中之前轮次的分析或装置的较早使用中已经产生或引入了核酸。“微流体空间”是指具有以下特征的通道或通道的网络(包括通孔(via))，任选地包括室i)所述空间是拓扑连续的，即，液体溶液可以从所述微流体空间的ー个区域流到或被泵到任何其他区域；以及ii)通过关闭两个或更多个阀，所述空间可以是拓扑分离的，S卩，所述空间中的液体溶液不能流出所述微流体空间。本发明的微流体空间将具有至少ー个输入通道和一个单独的输出通道。要认识到的是，“微流体空间”是功能性的定义。即，在多个通道和阀的特定微流体装置的情况下，可以确定出ー个、两个或多个潜在的“微流体空间”。在某些实施方案中，所述微流体空间包括(i)第一微流体通道和(ii)多个微流体反应室，其沿所述通道排列成串，并且各自与所述通道流体相连。这种构造的实例(示例性且非限制性地)包括“进样通道型(slug channel-type) ”装置(參见美国专利公开2008/0223721,其通过引用并入本文)；“动态阵列型(dynamic array-type) ”(參见美国专利7，476，363，其通过引用并入本文；还參见美国专利公开20090257920，其描述“多水平微流体系统和方法”，其通过引用并入本文)；以及“盲端流型(blind-flow-type) ”装置(參见美国专利No. 7，476，363，其通过引用并入本文，例如，图3)等。可修改现有技术中已知的这种微流体系统以使每个第一通道(如下文中的描述)与输入通道和単独的输出通道微流体连接，并且为该系统添加输入和输出阀以协助膨胀泵送。在以援引方式并入本文的共有的共同未决申请PCT/US10/29854(以WO 2010/115154公布)(并且要求美国专利申请 No. 61/166105, “Microfluidic Device with Reaction Product Recovery System，，的优先权)中描述了ー个合适的系统。可用于实施本发明之ー些方面的微流体装置“AccessArray Integrated Fluiaic Circuit，' ロ」-犾目 Fluiaigm Corp. , S. San Francisco, CA。在一些实施方案中，使用其他方法实现均匀的计量泵送。可再生的结构简单装置的一个实例是这样的装置其包含与第一流体输入通道和第一流体出通道微流体连通的通道，能够以适合数字PCR(參见美国专利No. 7，604，965，其通过引用并入本文)的方式分隔所述通道的多个阀，以及在末端处的阀对(即，输入阀和输出阀)。參见图8。重要的是，本发明不限于其中多个微流体反应室沿ー个微流体通道排列成串的装置。相反，本发明方法可例如以包含多个通道的微流体装置(其中可进行均匀计量泵送)来实施。典型的装置包含多个独立通道(各自包含多个室或者与多个室流体连接(參见例如图5，其中示出通过通道406与室412流体连接的通道404))。在一些示例性装置中，可有约12、约24、约48、约96、约192或更多个通道。在一些实施方案中，每个通道独立地与核酸失活(nucleic acid inactivation,ΝΑΙ)溶液的通用来源直接相连。“均勻计量泵送”是指通过很多微流体通道实现均匀流量的方法，并且是正确操作本方法所需要的。因为通道尺寸的微小偏差、气泡或表面能的改变可产生这样的情况其中仅ー些通道(例如，少于一半)承担了通过包含多个通道的流体网络的所有或大部分流量，因此需要用于均匀计量泵送的方法来确保通过流体网络之所有部分的失活溶液和清洗溶液的均匀流量，以使残留核酸基本完全失活。用于均匀计量泵送的方法包括“膨胀泵送”、“单侧膨胀泵送”、“蠕动泵送”和“限流阻碍物(limiting resistor)”。 “膨胀泵送”是ー种用于操控合适构造的集成流体回路(integrated fluidiccircuit)(微流体装置)以通过微流体装置的全部元件或选定的一部分元件来获得精确、低速、小体积泵送的方法。膨胀泵送是利用具有一个或更多个由弾性体材料所形成通道壁之通道的微流体回路所特有的。可通过设想由以下所组成的简单流体回流而获得膨胀泵送的概念I.微流体通道，其具有至少ー个由弾性体材料形成的通道壁，并且在通道的一端具有与溶液来源流体连通的输入通道。2.在通道另一端处的输出通道。3.多个微流体反应室，其沿所述微流体通道排列成串，并且各自与所述微流体通道流体连接，并且位于输入通道和输出通道之间。 4.所述输入通道与所述多个微流体反应室之间的输入阀。5.所述多个微流体反应室与所述输出通道之间的输出阀。为了在本发明的这种简单流体回路中进行膨胀泵送，首先在通道的输入通道和输出通道之间填充溶液。开始时，所述溶液可是(但不限干)来自上ー轮核酸分析的反应溶液、收获溶液或任何其他溶液。在输出阀关闭且输入阀打开的情况下，进行泵送。图3A D的阀822和820展示了这ー情況。将核酸失活溶液通过输入阀引入所述通道。因为所述通道中填充有溶液，并且因为没有液体可流出的単独出口，因此引入核酸失活溶液会导致通道的弾性体壁发生形变或膨胀。在一些实施方案中，通道的所有壁(内表面)均是弹性体的。具有至少ー个由弾性体材料形成之通道壁的微流体通道的增压导致弾性体壁向通道外侧膨胀，导致通道体积与通道内的流体压カ(弾性体通道壁材料的弾性特征(例如，杨氏模量))以及通道的长度和横截面积成比例地升高。必须在足以导致这样的形变或膨胀的压カ下引入所述核酸失活溶液。在压カ下引入溶液的方法是已知的，并且包括例如使用泵。合适的泵可以是(但不限干)电子泵、静电泵、磁力泵、机械泵、注射泵、气动泵或蠕动泵(參见例如美国专利No. 6，408，878，其通过引用并入本文)。引入核酸失活溶液之后,输入阀关闭，随后输出阀打开。随着通道壁恢复其正常(未受压的)体积，溶液通过输出阀被压出。如果需要的话，可重复该循环任何次数，直到所述通道完全充满核酸失活溶液。要理解的是，除了核酸失活溶液之外，也可通过膨胀泵送来运输其他溶液。例如，可用清洗溶液从微流体通道中置换失活溶液。膨胀泵送的示意图见

图10A。在该网络的输入通道マ入处的阀和在输出通道Va处的阀允许计量流量并且向所述网络施加压力。均匀计量泵送的另ー些方法有单侧膨胀泵送、蠕动泵送和限流阻碍物泵送。在单侧膨胀泵送(图10B)中，仅使用Va。使压カ升高并使所述网络膨胀。短暂地打开VaW允许每个通道流动。在蠕动泵送(图10C)中，按顺序使用一系列的三个阀，其中所述三个阀中总有两个以所述顺序关闭(例如，1，3;2，3;1，2)。该方法在有和没有加压溶液来源的情况下均适用。在限流阻碍物泵送(图10D)中，在每个通道中设置相同的流量限制，产生比网络中所有通道中阻力变异大得多的阻力。用于限制流动的方法是现有技术中已知的。通常在具有至少部分由弾性体材料形成的流动通道的装置中进行膨胀泵送和单侧膨胀泵送。可在完全非弾性体材料中进行蠕动泵送和限流阻碍物泵送。
图IOA D显示与三个流动通道直接相连接的加压的溶液来源(P)。要理解的是，一般来说，所述溶液来源通常与更大数目的流体通道流体连通。在膨胀泵送和单侧膨胀泵送的情况中，还可使用分配岐管(distribution manifold),以将溶液从与溶液来源相连接的单个通道分配至多个流动通道。在一些实施方案中，所述通道在其长度的至少一部分上是平行的。本文中使用的术语“输入通道”或“输出通道”是指从溶液来源(例如，储池)携带溶液进入微流体空间或者携带微流体空间中所含有的溶液离开所述微流体空间的通道。尽管是为了清楚而使用的，但术语“输入通道”和“输出通道”并不一定表示限定的功能或结构。例如，虽然使用该术语，但溶液也可流过“输出通道”进入微流体空间，并且流过“输入通道”离开所述空间。类似地，形容词修饰的元件例如阀(例如，输入阀对输出阀)和室(例如，试剂室和反应室)仅是为了清楚而使用，并不意在限制所述元件的功能。可从“溶液来源”(例如，核酸失活溶液来源、润洗溶液来源等)引入核酸失活溶液和其他溶液(例如，清洗溶液)。在一些实施方案中，所述溶液来源可以与微流体装置载体整合。图9中提供这种装置的图解，根据本发明实施方案的载体和微流体装置的简化透视图。载体100支撑微流体装置110。所述载体100可由为所述载体上的多种元件提供合适机械支撑的材料制成。例如，使用塑料或其他合适的材料制造所述载体。所述载体的外侧部分具有与标准384孔微板相同的投影(footprint)，并且可进行独立阀操作。此外，载体100可与常规的独立热循环仪相客。在图示的实施方案中，有48个样品输入口 120位于所述载体100的第一侧以及48个测定试剂输入口 122位于所述载体的另ー侧。样品输入口120和测定输入口 122的侧壁相对于所述载体的顶部是凹陷的。利用这些凹陷的构造，可同时向所有的样品输入口或测定输入口施加压力，驱动每个口中存在的流体通过存在于微流体装置110上的连接所述输入口与通孔、流体输入线路(line)或其组合相连接的流体线路140。载体100还包含四个来源130、132、134和136。所述四个来源的一个或更多个可用作包含液体(如核酸失活溶液、清洗溶液、收获试剂等)的流体孔。可向例如来源130施加压力，迫使溶液通过所述载体上的流体线路流入微流体装置上的流体线路。图9中所示的四个来源之一个或更多个的替代应用可以是启动微流体装置中存在的控制线路(例如，可操作以打开和关闭阀的加压控制线路)。在压カ下注入核酸失活溶液导致弾性体壁从装置的通道和/或室向外膨胀之后，关闭输入阀。关闭输入阀之后，打开输出阀，使通道中的流体通过输出阀流出所述通道。在任何泵循环中，通过微流体通道和室的泵送体积等于压カ下通道和室的膨胀后体积减去释放压カ且使膨胀的弾性体壁松弛后通道和室原来的体积。如上文所讨论的那样，将用于均匀计量泵送(例如，膨胀泵送)的核酸失活溶液、清洗溶液或其他溶液引入微流体空间。在一个实施方案中，在足以使微流体空间的弾性体部分发生形变的条件下引入所述溶液。通过上文中的讨论，显而易见的是，“足以使弾性体部分发生形变的条件”意为在压力和这样的条件下将溶液(例如，核酸失活溶液)引入所述微流体空间即没有可使液体流出微流体空间的单独出口(即，通过关闭阀阻断任何流出途径)，并且所述溶液(例如，核酸失活溶液)在压カ下引入。
在一些实施方案中，用于实施本发明的微流体装置包含多个列的阵列以及多排微流体室或单位小室(unit cell)(成对的室)，其中姆一列中的室或单位小室与一个微流体通道微流体连接，并且每一排中的室或単位小室与另ー微流体通道微流体连接(參见图1、6和7)。这样设置所述阵列，以使每个室或単位小室与独特的ー对排(M)和列(N)相连。该构造使得可以分析MXN种不同对的例如试剂和样品。參见例如美国专利公开2008/00223721和美国专利No. 7，476，363，二者均通过引用并入本文。在本文的讨论和图中，仅显示或讨论所述阵列的一小部分。为了清楚的目的，通常仅讨论微流体装置的单个列或列的一部分。显而易见的是，可在具有复杂设计的微流体装置中实施本方法，所述设计具有多个相互连接的通道、分支点(例如，从第一微流体通道至微流体室；參见例如图5 7)以及从输入通道至输出通道的曲折流通路径。使用核酸失活溶液除去残留核酸之后，通常希望从微流体空间中除去核酸失活溶液。这可通过例如使用泵送(例如，膨胀泵送)方法使清洗溶液流入微流体空间而实现。合适的清洗溶液包括水、盐溶液、水缓冲液(例如，Tris缓冲液)、去污剂溶液等。示例的去污剂溶液例如(但不限于)包括O. 1%至10% v/v的TffEEN 80、TRITON X-100、NPR40和NONIDET P40。足够数目的泵送循环的结果是清洗溶液(例如，无菌水)流过整个微流体空间并从微流体空间中置換任何核酸失活溶液。所述清洗溶液可沿着核酸失活溶液流过微流体空间的路径流过所述微流体空间。或者，清洗溶液可沿着不同于核酸失活溶液流过微流体空间的路径流过微流体空间。可通过干燥，任选地通过将所述装置暴露于升高的温度而除去清洗溶液。示例的系统构造可用多种系统构造实施本发明。要注意的是，可将额外的和不同的方法步骤并入使用其他通路构造的实施方案中。要理解的是，以下实例是为了举例说明而不是为了限制。在一个实施方案中，所述装置包含(i)第一微流体通道；(ii)多个微流体反应室，其沿着所述通道排列成串并且各自与所述通道微流体连接。參见例如图5和8，二者均是从美国专利No. 7，476，363 (其提供对所述附图的其他描述)修改而来。
在一个实施方案中，所述装置包含(i)第一微流体通道；(ii)多个微流体反应室，其沿着所述通道排列成串并且各自与所述通道微流体连接；以及(iii)多个接ロ通道。在这个实施方案中，每个微流体反应室与接ロ通道流体连接，以使流体可从所述室流入所述第一微流体通道或接ロ通道(在相反的方向上也是这样)。在一些实施方案中，如上文中所讨论的那样，多个接ロ通道共同与第二微流体通道相连，以提供独特反应位置的阵列。对于这种系统构造的图解 參见例如图7，其是从美国专利公开US 2008/00223721 (其中可找到对该图的额外描述)修改而来的。还參见美国专利No. 7，476，363，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，每个微流体反应室与上述接ロ通道流体连接，并且每个接ロ通道与试剂室流体连接。在一些实施方案中，如上文中所提及的那样，多个试剂室中的每ー个可与共同的第二微流体通道相连。任选地，每个接ロ通道与用于控制单个反应室与单个试剂室之间流体连通的接ロ阀相关联。參见图1、6和10。图6是从美国专利No. 7，476,363(其中可找到对该图的额外描述)修改而来的。图3是从WO 2010/115154和临时申请No. 61/166，105(其中可找到对该图的额外描述)修改而来的，其通过引用并入本文。显而易见的是，尽管本发明的基本过程不依赖于特定的装置架构，但具体的过程将根据装置而有所不同。例如，在每个微流体反应室与接ロ通道流体连接、每个接ロ通道与试剂室流体连接、并且试剂室与共用的第二微流体通道相连的装置中，核酸失活溶液和/或清洗溶液可从第一微流体通道弓I入反应室中，和/或可通过接ロ通道引入。后一方法可用于从试剂室和反应室中除去残留的核酸(或其他污染物)。图3从WO 2010/115154和临时申请No. 61/166，105 (就所有目的而言，并入本文)修改而来的图3显示“进入阵列型(Access Array-type) ”装置的一部分。图3提供图解在本发明实施方案的操作过程中流体流过微流体装置的四个简化示意图。图3A图解在上样和测定过程中本发明实施方案的微流体装置的一部分。所图解的部分包括输入线路810和上样碗(loading bowl)部分830，以及分隔阀840。阀820和822用于对存在于样品室510中的反应产物进行膨胀泵送。在測定和芯片再生的过程中，输入线路810可用于多种溶液，例如样品或试剂溶液、收获溶液、核酸失活溶液和清洗溶液。如图3A所示，阀820是关闭的且阀822是打开的。阀820和822通常是“上推”阀。将样品上样到样品室510中，将被测物上样到测定室512中。接ロ阀530是关闭的，阻止样品与被测物混合。在一些实施方案中提供上样碗以使减少与消耗前沿相关的效应。(在将样品上样到微流体装置中时(例如，通过图3A中所示的垂直样品输入线路)，存在于流通路径前缘之样品部分与微流体装置之材料的结合将产生消耗前沿，其中因为这种结合过程而消耗样品中的ー种或更多种成分。提供上样碗830使使用者可推动消耗前沿通过微流体装置的多个样品室并在上样碗830中贮存所消耗的样品材料。最終，经消耗的样品材料通过所述装置冲刷到所述上样碗中，微流体装置中所含有的样品将会是基本未消耗的。)在样品和被测物上样过程中，分隔阀840是打开的，以使消耗前沿流入上样碗状物830。打开阀822,允许样品流过样品输入线路进入多个样品室。因为阀820是关闭的，样品无法通入输入线路810。应当注意的是，图3A中显示防漏阀(containment valve) 540处于关闭状态。在样品和被测物上样过程中，防漏阀是打开的，随后在完成样品和被测物上样之后被关闭，如所显示的那样。所述防漏阀将多对反应和測定室与包含多个成对组合的其他对分隔开。在图3A中，为清楚的目的，仅显示微流体装置的ー个列。要理解的是，如图1、6和7中所示的那样，微流体装置提供另ー些列。此外，为了清楚的目的，列的大部分并未显示。图3B显示样品与被测物的混合以及随后的反应(例如，扩增)过程。为了混合样品和试剂，接ロ阀530如所示地处于打开的位置。关闭防漏阀540将反应产物沿连接流体线路密封在样品和測定室中。如图3B所示，关闭分隔阀840，阻止样品输入线路和上样碗830之间的流体流通。在一些实施方案中使用蓄压器(參见图9)以及在另ー些实施方案中使用另ー些启动技术(例如，机械的、静电的、电动机械的、热カ的、压电的开动技术等)以启动阀840使其处于打开或关闭的位置。尽管图3B使用一幅图显示混合和反应,但本领域技术人员会理解,可使用多个热循环使用PCR法扩增DNA。因此，该简图意在显示可发生在微流体装置中的混合和随后的反 应。图3C显示除去残留核酸的第一阶段中微流体装置的一部分。核酸失活溶液从输入通道通过输入线路810流向反应室。如图3A所示，阀820是打开的，以允许核酸失活溶液流入顶端的样品室。关闭接ロ阀530以阻止核酸失活溶液流入试剂室(其还含有反应产物)。通过关闭阀822限制核酸失活溶液初始填充输入线路和反应室的程度。如所示的那样，核酸失活溶液仅部分地填充第一样品室的一部分。仅以举例的方式提供填充有核酸失活溶液之样品室ー侧的示意图，因为核酸失活溶液流入样品室实际上是通过从图平面伸出的通路。关闭分隔阀840阻止核酸失活溶液流入上样碗，但如果需要的话其他实施方案可允许这样的流动。进入微流体装置的阵列部分的核酸失活溶液流所产生的流体压カ导致阀822上方的样品输入线路和样品室发生膨胀。通过样品室的这种加压而起始膨胀泵循环。如下文中所描述的那样，关闭阀820并且打开阀822将会使溶液(例如，核酸失活溶液)能够在其流过微流体装置时从微流体装置中被回收。图3D显示该过程的第二阶段中微流体装置的一部分。尽管显示为第二阶段，但这并不意在暗示所述第二阶段紧跟第一阶段。所述第二阶段通常通过ー个或更多个膨胀泵送的中间阶段而与所述第一阶段分开。如上文中讨论的那样，膨胀泵送(还称为容量泵送(volumetric capacitivepumping))是操作合适构造的集成流体回路(微流体装置)以获得通过微流体装置的所有构造元件的精确、低速、小体积泵送的方法。膨胀泵送是利用具有一个或更多个由弾性体材料所形成通道壁之通道的微流体回路所特有的。例如，收获试剂通过样品输入线路和样品室的流动被认为是容量泵送。泵送通过关闭阀822并且打开阀820而进行。如上文中讨论的那样，对收获试剂ロ(未显示)加压以将收获试剂引入最顶端的样品输入线路和样品室(其可被认为是通道)。对具有至少ー个用弾性体材料形成的微流体通道加压导致弾性体壁由所述通道向外膨胀，导致通道体积相对于通道内的流通压カ(或者在另ー些实施方案中为气体压力)、弾性体通道壁材料的弾性特征(例如，杨氏模量)以及通道的长度和横截面积成比例地升高。使样品输入线路和样品室加压，随后如图3D所示关闭阀820。关闭阀820之后，打开阀822。通过微流体通道和室的泵送体积等于压カ下通道和室的膨胀后体积减去释放压カ且使膨胀的弾性体壁松弛后通道和室原来的体积。通过以下重复循环持续地膨胀泵送关闭822，打开820，对样品输入线路和样品室加压，关闭820，打开822。以这种方式，可以以精确控制的流速实现连续或不连续的小体积泵送。这样的实施方案提供膨胀泵送的方法，包括关闭位于反应室与输入通道之间的第ー阀(即，阀822)，打开位于输出通道和反应室之间的第二阀(S卩，阀820)，关闭第二阀，打开第一阀，以及以预先确定的次数重复这些步骤。在 打开所述第二阀与关闭所述第二阀的步骤之间，NAIS流入样品输入线路和样品室，按上文所述对通道加压。在膨胀泵送中，流体的流速(例如，进入或离开微流体空间)较慢。在一些实施方案中，低于90μ I/小时、80μ I/小时、70μ I/小时、60μ I/小时、50μ I/小时、40μ I/小时、30 μ I/小时、20 μ I/小时、10 μ I/小时、9 μ I/小时，低于8 μ I/小时，低于7 μ I/小时，低于6μ I/小时，低于5μ I/小时，低于4 μ I/小时，低于3μ I/小时，低于2μ I/小时，低于I μ I/小时或者低于O. 5 μ I/小时。图7在另ー个相关的实施方案中，每个微流体反应室如上文所述通过“进样通道”与接ロ通道流体连接。參见美国专利公开2008/0223721，其通过引用并入本文。在这个实施方案中，接ロ通道跨越微流体装置的层并且也被称为“通孔”。參见图7 (额外的描述可见于美国专利公开2008/0223721)。可这样制造弾性体层之间的“垂直通孔”或相互连接通过平板印刷在弾性体层的顶部产生抗蚀刻层，随后蚀刻弾性体，并且最后在添加最后ー层弹性体之前除去所述抗蚀刻层，或者通过激光穿孔来制造。图I在另ー个相关的实施方案中，如图I所示，溶液(核酸失活溶液和/或清洗溶液)通过两种路径的ー种或两种流过微流体装置的通道和室。在第一种路径中，将核酸失活溶液上样到芯片中并且加压进入样品总线(bus line)(图I中的幻沖1阀关闭且？2阀打开。随后关闭P2阀。当Pl打开且P2保持关闭后，溶液被释放。在第二路径中，使用阀I和Pl通过膨胀泵送来清洁反应室和试剂室，并且通过测定线路(图I中的A)引入溶液。在该方法中，阀P2和Pl是关闭的，并且来自测定线路的溶液被加压。溶液可从测定线路通过试剤-反应室并通过关闭阀1(接ロ阀)和打开Pl而离开芯片。因此，通过选择打开和关闭阀PI、P2和I的模式，膨胀泵送模式可以为仅样品侧、仅被测物侧、ー个周期的样品侧推入紧跟ー个周期的被测物侧推入、5个周期的样品侧推入紧跟2个周期的被测物侧推入等。可根据室体积比或其他參数调整最佳组合。在一些实施方案中，例如使用第一路径循环核酸失活溶液，并且使用这两个路径循环清洗溶液。一方面，本发明提供用于使微流体装置适于在核酸分析中重复使用的方法，其通过(a)通过膨胀泵送使核酸失活溶液流入所述装置的微流体通道；并且随后(b)通过膨胀泵送使清洗溶液流入所述通道，因而从所述通道中置换所述核酸失活溶液，由此使来自之前使用所述装置的任何残留核酸失活。在一些实施方案中，所述微流体装置包含多个微流体反应室，其各自与所述微流体通道流体连接。在一些实施方案中，所述微流体反应室包含来自之前使用所述装置的残留核酸。在一些实施方案中，所述核酸失活溶液和所述清洗溶液通过不同的流通途径引入所述通道。在一些实施方案中，在沿所述通道多个点将所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或这两者引入所述通道。在一些实施方案中，所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或这两者从微流体反应室流入所述通道的多个点。在一个相关的方面中，本发明提供用于从弾性体微流体装置中除去残留核酸的方法，其通过(a)使核酸失活溶液流入微流体空间，其中所述微流体空间包含第一微流体通道，并且其中所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弾性体部分发生形变的压カ和条件下引入所述微流体空间，并且随后(b)使所述核酸失活溶液流过所述微流体空间，并且通过膨胀泵送从所述微流体空间中除去核酸失活溶液。在一些实施方案中，本发明提供用于从弾性体微流体装置中除去残留核酸的方法，其通过(a)使核酸失活溶液流入微流体空间，其中所述微流体空间包含i)第一微流体通道，以及ii)多个微流体反应室，其沿所述通道排列成串，并且各自与所述通道流体连接，所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弾性体部分发生形变的条件下引入所述微流体空间，并且随后(b)使核酸失活溶液流过所述微流体空间，并且从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液，这通过膨胀泵送来实现。 在一些实施方案中，所述微流体空间包含多个第一微流体通道，其各自与多个微流体反应室微流体连接。膨胀泵送的过程可包括例如第一过程或第二过程或者二者兼有。在一个实施方案中，所述第一过程包括(i)使来自失活溶液来源的核酸失活溶液通过所述第一微流体通道流入至少ー个微流体反应室；并且随后，(ii)关闭ー个或更多个第一输入阀以使所述失活溶液来源与所述至少ー个微流体反应室隔离，并且随后，(iii)打开ー个或更多个第一输出阀以使流体流出所述微流体空间。在一个实施方案中，所述第二过程包括(i)使来自失活溶液来源的核酸失活溶液通过多个接ロ通道流入所述多个微流体反应室中；并且随后，( )关闭ー个或更多个第二输入阀以使所述失活溶液来源与所述多个接ロ通道隔离，和/或关闭ー个或更多个接ロ阀；并且随后，(iii)打开ー个或更多个第二输出阀(其可以与所述第一输出阀相同或不同)，以使流体流出所述微流体空间。在另ー个实施方案中，改变所述第二过程以使膨胀泵送的过程包括(i)使来自失活溶液来源的核酸失活溶液通过多个接ロ通道流入所述多个微流体反应室；并且随后，( )关闭接ロ阀以使所述失活溶液来源与所述反应室隔离；并且随后，(iii)打开ー个或更多个第二输出阀(其可与所述第一输出阀相同或不同)，以使流体流出所述微流体空间。一般来说，所述第二输出阀与第一微流体通道中的第一输出阀相同。当所述装置包含接ロ通道时，在一些实施方案中，每个接ロ通道将单个微流体反应室与单个微流体反应室相连接，每个接ロ通道具有与其相关联的接ロ阀，其用于控制单个反应室与单个试剂室之间的流体连通，并且当所述ー个或更多个第二输入阀打开时，每个反应室与所述失活溶液来源流体连通。在另ー个实施方案中，膨胀泵送的过程可包括经由进样通道使核酸失活溶液从失活溶液来源通过第一微流体通道流入至少ー个微流体反应室；和/或经由进样通道使来自失活溶液来源的核酸失活溶液通过多个接ロ通道流入所述多个微流体反应室。很明显，核酸失活溶液(NAIS)流可通过两个基本路径之一或二者。第一，从核酸失活溶液来源将NAIS引入第一微流体通道，以及引入第一反应室(例如，每排或列中最靠近所述输入通道的反应室)。第二，将NAIS从第二核酸失活溶液来源(其可与第一来源相同或不同)引入多个接ロ通道(或引入多个试剂室，并且随后进入多个接ロ通道)，并且随后沿所述第一微流体通道进入多个反应室。这样，一个路径利用膨胀泵送从反应通道中除去残留核酸，并且第二路径利用膨胀泵送从反应室和试剂室(在包含两个试剂室的装置中)中除去残留核酸。在多个实施方案中，所述膨胀泵送仅包括所述第一过程(其被重复至少一次)(即，第一途径)，或者仅包括所述第二过程(其被重复至少一次)(即，第二途径)，或者包括所述第一过程和所述第二过程，其中每个过程可被重复并且其中根据预定的模式实施所述过程。在本发明的另ー个方面中，通过使用膨胀泵送使溶液流过微流体空间以除去(洗出)被引入微流体空间的NAIS。在一些实施方案中，使清洗溶液流过NAIS所流过的相同路径或一系列路径。在一些实施方案中，所述清洗溶液流过不同于NAIS的路径或一系列路径。例如，可仅使用所述第一过程流通NAIS，且使用所述第一过程和所述第二过程流通清洗溶液。因此，在ー个方面中，本发明还包括通过以下除去核酸失活溶液(a)使清洗溶液遵循核酸失活溶液流入微流体空间的路径流入所述微流体空间，(b)通过泵送使所述清洗溶液通过所述微流体空间，以及(c)从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液。或者，在ー个方面中，本发明还包括通过以下除去核酸失活溶液(a)使清洗溶液遵循至少ー个不同于核酸失活溶液流入微流体空间的路径流入所述微流体空间，(b)通过泵送使清洗溶液流过所述微流体空间，以及(c)从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液。在一些实施方案中，所述方法包括通过使清洗溶液流过所述微流体空间从而除去核酸失活溶液，其中如果根据所述第一过程引入核酸失活溶液，则使清洗溶液通过第三过程流过所述装置，所述第三过程包括(i)使来自清洗溶液来源的清洗溶液流入所述第一微流体通道，并且流入至少ー个微流体反应室，其中清洗溶液在足以使通道和室的弾性体部分发生形变的条件和压カ下引入所述微流体空间，并且随后，(ii)关闭ー个或更多个第三输入阀以使所述微流体空间与所述清洗溶液来源隔离；并且随后，(iii)打开ー个或更多个第三输出阀(其可以与所述第一输出阀相同或不同)以允许流体流出微流体空间。或者，如果根据所述第二过程引入核酸失活溶液，则使清洗溶液通过第四过程流过所述装置，所述第四过程包括(i)使来自清洗溶液来源的清洗溶液通过所述多个接ロ通道流入至少ー个微流体试剂室或至少ー个微流体反应室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弾性体部分发生形变的条件和压カ下引入所述微流体空间，并且随后，(ii)关闭ー个或更多个第四输入阀(其可以与第一输入阀相同或不同)，以使所述清洗溶液来源与所述微流体空间隔离；或者关闭所述接ロ阀，从而将所述清洗溶液来源与所述微流体空间隔离；并且随后，(iii)打开ー个或更多个第四输出阀(其可以与第一输出阀相同或不同)，以使流体流出所述微流体空间。保真度出人意料的是，如实施例中所描述的那样，通过使用本文中所描述的方法，装置可用于多个独立的分析循环(其中的循环包括扩增反应、检测产物和再生所述装置)而没有核酸(例如，DNA)遺留。这样，所述装置可多次重复使用，而不产生假阳性(由于污染)或其他不准确的結果。
使用本发明的方法，可进行多个循环(例如至少2，至少3，至少4、5或大于5轮)的扩增反应，而假阳性不提高。例如，在一个循环中，在微流体装置的室中进行扩增反应，根据本发明处理所述装置(“再生的”)，并且在相同的室中进行第二扩增反应。再次再生所述装置，并进行第三反应，等。在实施例中举例说明了使用该方法所达到的出色的保真度，并且可在任何装置中通过以下进行测试在微流体装置的室中进行扩增反应，根据本发明再生所述装置，并且在如果存在任何污染DNA就能产生信号的条件下，在不存在模板DNA的情况下在所述室中重复所述扩增反应。使用本发明的方法，经过多个扩増-再生循环(例如，至少2，至少3，至少4、5或大于5个循环)，不存在模板DNA时基本不可检出信号。在该情况中，低于阳性对照信号(模板DNA存在下的信号)2% (更经常低于1% (并且经常低于0.1%))的残余信号可被认为是不可检出的。示例性的测定可使用人基因组DNA(60ng/ul)、GAPDH特异性引物(例如，正向 5' GGACCTGACCTGCCGTCTAG3';反向 5' TAGCCCAGGATGCCCTTGAG3' ) ,Taq聚合酶和30 40个热循环来实施。
制造弾性体微流体装置如上文所述，本发明的微流体装置至少部分使用弾性体材料制造。在此仅简略描述使用弾性体材料的制造方法，因为弾性体材料、使用这种材料制造之装置的制造方法以及设计使用所述材料制造之装置及其组件的方法已被详细地描述(參见例如 Unger et al.，2000，Science 288:1 13-16 ；美国专利 No. US 6, 960, 437(Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices) ；US 6,899,137(Microfabricated elastomeric valve and pump systems) ；6, 767, 706(Integratedactive flux microfluidic devices and methods) ；6, 752, 922 (Microfluidicchromatography) ；6, 408, 878 (Microfabricated elastomeric valve and pumpsystems) ；6,645,432 (Microfluidic systems including three-dimensionallyarrayed channel networks);美国专利申请公开 No. 2004/01 15838,20050072946 ；20050000900 ；20020127736 ；200201091 14 ；200401 15838 ；20030138829 ；20020164816 ；20020127736 ；and 200201091 14 ；PCT 专利公开 W02005/084191 ；W005030822A2 ；和 WO 01/01025 ；Quake&Scherer, 2000, " From micro to nanofabricationwith soft materials " Science 290 :1536-40 ;Xia et al. , 1998, " Softlithography " Angewandte Chemie-International Edition 37 :551-575 ；Unger etal.,2000, " Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer softlithography " Science 288:1 13-116 ;Thorsen et al. ,2002, " Microfluidiclarge-scale integration " Science298 :580-584 ;Liu et al. ,2003, " Solvingthe" world-to-chip" interface problem with a microfluidic matrix" AnalyticalChemistry 75，4718_23"，其均通过引用并入本文)。弾性体材料弾性体一般是在其玻璃化转变温度和液化温度之间的温度下所存在的聚合物。參见 Allcock et al. , Contemporary Polymer Chemistry,第 2 版。弾性体材料表现出弹性特征，因为聚合物链很容易发生扭转运动以允许骨架链对カ发生响应而解旋，在カ不存在时骨架链再缠绕以采取之前的形状。一般来说，当施加カ时，弾性体发生形变，但随后当所述カ撤除后恢复其原来的形状。可通过杨氏模量来表征弾性体材料所表现出的弾性。根据本发明，可使用具有约IPa ITpa(更优选约IOPa lOOGPa，更优选约20Pa lGPa，更优选约50Pa lOMPa，并且更优选约IOOPa IMPa)杨氏模量的弾性体材料，但也可根据具体应用的需要而使用具有这些范围之外杨氏模量的弾性体材料。鉴于聚合物化学、前体、合成方法、反应条件以及潜在添加剂的极大的多祥性，有大量可能的弾性体系统可用于制造本发明的装置。常见的弾性体聚合物包括例如全氟聚醚、聚异戊ニ烯、聚丁ニ烯、聚氯丁ニ烯、聚异丁烯、聚(苯こ烯-丁ニ烯-苯こ烯)、聚氨酷和硅酮，或者聚(双(氟烷氧基)磷腈)(PNF、Eypel-F)、聚(碳硼烷-硅氧烷)(Dexsil)、聚(丙烯臆-丁ニ烯)(丁腈橡胶)、聚(I-丁烯)、聚(氯三氟こ烯-偏ニ氟こ烯)共聚物(Kel-F)、聚(こ基こ烯基醚)、聚(偏ニ氟こ烯)、聚(偏ニ氟こ烯-六氟丙烯)共聚物(Viton)、聚氯こ稀(PVC)的弾性体组合物、聚砜、聚碳酸酷、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚四氟こ烯(Teflon)、聚ニ甲基硅氧烷、聚ニ甲基硅氧烷共聚物和脂肪族聚氨酯ニ丙烯酸酷。为了举例说明，在此简要描述最常用的弾性体类型硅酮硅酮聚合物具有极大的结构多祥性，并有大量的市售制剂。在本发明的ー个示例性方面中，由弾性体聚合物(例如，GE RTV 615(制剂)、こ烯基-硅烷交联的(型)硅酮弾性体(家族))制造本系统。RTV 615的こ烯基-至-(Si-H)交联允许进行异质多层软光刻技术(heterogeneous multilayer soft lithography)和光致抗蚀刻包封(photoresistencapsulation)。然而,这仅是用于娃酮聚合物化学并适用于本发明的多种交联方法中的ー种。在一个实施方案中，所述娃酮聚合物是聚ニ甲基娃氧烧(polydimethylsiIoxane,PDMS)。全氟聚醚官能化的光固化全氟聚醚(perfluoropolyether, PFPE)尤其可用作用于制造与某些有机溶剂一起使用的耐溶剂的微流体装置。这些PFPE具有与PDMS类似的材料特征和制造能力，但具有与范围更广泛的溶剂相容性。參见例如PCT专利公开WO 2005030822 和 W02005084191，以及 Rolland et al. ,2004, " Solvent-resistantphotocurable " liquid Teflon " for microfluidic device fabrication '' J. Amer. Chem. Soc. 126 :2322_2323。聚异戊ニ烯、聚丁ニ烯、聚氯丁ニ烯聚异戊ニ烯、聚丁ニ烯和聚氯丁ニ烯均从ニ烯单体聚合而来，并因此当聚合后每个单体具有ー个双键。该双键使得所述聚合物能够通过硫化被转化为弾性体(基本上，通过加热使用硫来形成双键之间的交联)。同质多层软光刻技术(homogeneous multilayer soft lithography)将包括要结合之层的不完全硫化，并且可通过类似的机制进行光致抗蚀刻包封。聚异丁烯纯的聚异丁烯没有双键，但通过在聚合中包含少量( 1% )异戊ニ烯而发生交联以用作弾性体。异戊ニ烯单体在聚异丁烯骨架上提供悬突的双键，随后可按上文将其硫化。聚(苯こ烯-丁ニ烯-苯こ烯)通过活性负离子聚合(即，在该反应中没有天然链终止步骤)产生聚(苯こ烯-丁ニ烯-苯こ烯)，所以，固化的聚合物中可存在“活性”聚合物末端。这使它成为本发明光致抗蚀刻包封系统(其中，在倾倒到固化层顶部的液体层中会有大量未反应的单体)的天然候选物。不完全固化可允许进行均质多层软光刻技术(A与A結合)。该化学还有助于产生具有额外丁ニ烯和偶联剂的ー层(“A”)以及没有丁ニ烯的另ー层(“B”)(用于异质多层软光刻技木)。SBS是“热固性弾性体”，意为其在高于某温度时熔解并变为可塑的(而不是弹性的)；降低温度再次产生弾性体。因此，可通过加热使层结合在一起。聚氨酯聚氨酯由ニ异氰酸酯(A-A)和ニ醇或ニ胺(B-B)产生；因为有非常多样的ニ -异氰酸酯和ニ醇/胺，因此不同类型聚氨酯的数目庞大。但聚合物的A和B性质使它们可用于异质多层软光刻技木，正如RTV615那样通过在ー层中使用过量的A-A以及在另ー层中使用过量的B-B。材料的选择(无论弾性体还是非弾性体)要考虑对具体材料特性的需要，并且将取决于多种因素，包括容易制造、化学合成的性质、耐溶剂性和温度稳定性。例如，由PDMS制造的流体回路将不与所有有机溶剂相容(參见例如Lee et al. ,2003, Anal. Chem. 75 6544-54)。可在所述装置的至少ー些区域中使用化学耐性弾性体替代PDMS来解决该问题。例如，可使用全氟聚醚(PFPE)(參见 Rolland et al. , 2004, " Solvent-resistantphotocurable " liquid Teflon " for microfluidic device fabrication '' J. Amer.Chem. Soc. 126 :2322-23,和上文中的引文)。或者，可对弾性体(例如PDMS)表面进行 化学修饰以提高与有机溶剂的相容性，并且提高功能。用于这种修饰的方法和试剂包括US 2004/01 15838[第0293段]等中所描述的那些；四氟こ烯、全氟甲基こ烯基醚的共聚物(还称为TFE-全氟こ烯基聚合物)，例如在低沸点全氟化碳液体(例如，来自3M的Flourinert)中 I : I 稀释的 Chemraz (Greene-Tweed, 10 % 溶液)，Kalrez (Du Pont),Chemtex(Utex Industries)和氟碳聚合物(FKM,例如聚(四氟-co-六氟丙烯)共聚物,例如来自Bellex International Corp.的Cytop涂层(聚(全氟(烯基こ烯基醚)和来自3M的Novec EGC-1700涂层(全氟脂肪族聚合物)，其可通过使溶液流过通道(例如，在25psi下，3X40微升，I分钟间隔)而应用)。此外，可在多种溶剂中进行很多化学反应。可这样设计要在使用特定材料制造的芯片中进行的一系列反应，以使所用溶剂在完成所述反应所必需的时间中与所述材料相容。对于使用多层软光刻技术(其中分别固化弾性体层并且随后结合在一起)制造的装置，制造的另ー个重要的考量因素是将多层弾性体结合在一起的能力。该方案要求固化的层具有足够的反应性以结合在一起。所述层可以是相同类型并且能够自身结合，或者它们可以是不同的类型并且能够彼此結合。其他可能性包括在层之间使用粘合剂，使用热固性弾性体，以及使用复合结构。弹性体制造方法使用弾性体的复合微流体回路制造方法是已知的并且描述于Unger etal. ,2000, Science 288:1 13-1 16 ；Quake & Scherer,2000, " From micro tonanofabrication with soft materials " Science 290 :1d36_40 ;Xia et al.,1998, " Soft lithography " Angewandte Chemie-International Edition37 551-575 ；Unger et al. ,2000, " Monolithic microfabricated valves and pumpsby multi layer soft lithography " Science 288 :113-116 ；Thorsen et al.,2002," Microfluidic large-scale integration" Science 298 :580-584 ；Chou et al.,2000， " Microfabricated Rotary Pump" Biomedical Microdevices3 :323-330 ；Liu etal.,2003," Solving the" world-to-chip" interface problem with a microfluidicmatrix" Analytical Chemistry 75,4718-23"，以及本文中所引用的和现有技术中已知的其他參考文献。通常使用单层和多层软光刻(multilayer soft lithography,MSL)技术和/或牺牲层包封(sacrificial-layer encapsulation)方法构建微流体装置。基本的MSL方法包括将一系列的弾性体层浇铸在微加工模具上，从模具中除去所述层，并且随后将所述层融合在一起。在牺牲层包封方法中，在需要通道的地方沉积出光致抗蚀刻的图案。以下简略地描述制造弾性体装置的一个示例方法。简单地说，用于制造弾性体装置的ー种方法包括通过用光致抗蚀刻剂进行光刻(Shipley SJR 5740)在娃片上制成顶层的母模(mother mold)(具有控制通道和反应器的弾性体层，具有流动通道的弾性体层)。可通过旋涂速度(spin coating rate)来精确地控制通道高度。通过将光致抗蚀刻护暴露于UV光随后显影而形成光致抗蚀刻通道。通常按照上文中Unger等的描述完成热回流过程和保护处理。随后将混合的两组分硅酮弹性体(GE RTV 615)分别旋涂到底模中并倾倒到顶模上。可应用旋涂来控制底部聚合物流体 层的厚度。在80°C的烤箱中烘烤25分钟之后，将部分固化的顶层从其模具中剥去，与所述底层对齐并组装。在80°C下最后烘烤I. 5小时，以使这两层不可逆地结合。一旦从底部硅母模中剥离，通常用HCl (O. IN，在80°C下30分钟)处理该RTV装置。该处理的作用是切割Si-O-Si键中的ー些，从而暴露使所述通道更亲水的羟基。随后可任选地将所述装置热密封到支持物上。所述支持物基本上可由任何材料制造，但其表面应当是平的以确保良好的密封，因为所形成的密封主要是由粘附カ所形成的。合适支持物的实例包括玻璃、塑料等。根据前述方法形成的装置导致基底(例如，玻璃载片)形成流通通道的ー个壁。或者，一旦从母模中除去，将所述装置密封到薄弾性体膜上，以使所述流通通道完全被弾性体材料包围。随后可任选地将所产生的弾性体装置与基底支持物连接。通过在块材料上刺孔而进入流体通道，并且所述装置很容易与玻璃或硅基底结合。可通过堆叠多个单独制造的层而产生大量有效组件(例如，通道、反应器、阀和泵)的阵列。复合结构在芯片和反应器的制造中，可使用多祥的材料。可由材料的组合来制造装置，尤其是反应器。例如，在一些实施方案中，反应器的壁和顶是弾性体的，而所述反应器的底由下面的非弾性体基底(例如，玻璃)形成，而在另一些实施方案中，由非弾性体材料构成所述反应器的壁和底，仅所述反应器的顶由弾性体构成。这些芯片和反应器有时称为“复合结构”。參见例如US 20020127736。可使用多种方法密封装置的弾性体和非弾性体组件，其中ー些描述于 US 6，719，868 和 US 20020127736，1I1I0227等。阀微流体装置的阀可以选择性地启动，以调节通道、室和其他芯片组件之间的流动。多种类型的阀是现有技术中已知的，包括微机械阀、弾性体阀、固态微阀等。參见例如Felton,2003, The New Generation of Microvalves" Analytical Chemistry 429-432。两种常用的制造微机电(microelectromechanical, MEMS)结构(例如,泵和阀)的方法是基于娃的大块微机械加工(其是消减制造法(subtractive fabrication method),单晶娃由此光刻形成图案并且随后蚀刻形成三维结构)，以及表面微机械加工(其是添加法，其中依次添加半导体型材料如多晶硅、氮化硅、ニ氧化硅和多种金属的层，并形成图案以制造三维结构。在一个实施方案中,所述阀是单片阀(monolithic valve)。在一个优选的实施方案中，所述阀是压カ启动的“弾性体阀”。压カ启动的弾性体阀由这样的构造组成，其中两个微通道被弾性体段分隔开，所述弾性体段能响应于施加到一个通道(例如，控制通道)的启动カ而偏转进入另一通道(例如，流通通道)或从其中抽出。弾性体阀的实例包括向上偏转的阀(參见例如US 20050072946)、向下偏转的阀(參见例如US20050072946)、侧启动的阀(參见例如US 20020127736，例如，第0215-0219段]、正常关闭的阀(參见例如US6，408，878B2和US 6,899, 137)等。在一些实施方案中，装置可具有阀的组合(例如，向上和向下偏转的阀)。可通过将气体(例如，空气、氮气和IS气)、液体(例如，水、娃油和其他油)、含有盐和/或聚合物(包括但不限于聚こニ醇、甘油和碳水化合物)的溶液等注射到控制通道中来使阀启动。一些阀可通过向控制通道施加真空而启动。 一般来说，本文中讨论的多层微流体装置包含多个弾性体层，且所述阀包含第一层和第二层之间的可偏转膜。在“上推”构造中，阀的可偏转膜可在与控制线路交叉点的上方偏转进入流通线路514。在该构造中，可偏转膜向上偏转到流体线路中以在阀的位置关闭流体线路，因而称为“上推”阀。释放控制线路中的压カ将导致可偏转膜回到未偏转的位置，从而将关闭的阀打开。美国专利申请No. 2005/0226742中提供了包含阀之微流体装置的额外描述，就所有目的而言，其全部公开内容通过引用全文并入本文。除了通过基于压カ启动系统启动的弾性体阀之外，可使用具有弾性体组件和静电、磁力、电解和电动启动系统的单片阀。參见例如US20020109114 ；US 20020127736，例如W0168-0176 ;以及US 6，767，706 B2例如，§ 6. 3。还已经描述了单向阀(參见例如Adamset al.，2005，J. Micromech. Microeng. 15 :1517-21 ；以及其中的參考文献 6 12)。实施例图I描述实验中使用的微流体芯片的布局。在PCR单元内有反应室(较大的方形)、试剂室(较小的方形)及其安全阀(guard valve) (I或C)。所述安全阀对于热循环过程中的芯片性能是有用的。在清洗期间，阀I还可被视为入口或出口阀，以控制液体流向。高通量PCR基质之外有两个控制线路Pl和P2，在芯片清洗期间，其还充当入口和出口阀。在PCR热循环期间，仅安全阀I和C是启用的，而Pl和P2被忽略。PCR之后，阀对(valuepair)Pl/P2和I/P1将充当泵送阀，引导流动方向以清洁反应室或者反应室和试剂室。例如，当清洁反应室时，对安全阀加压并使其关闭。Pl和P2被用于清洁液体控制。将核酸失活溶液(漂白剤)上样到芯片中，并将其压入样品总线(图中的S)。所述溶液可进入室(Pl关闭且P2打开)，并保持在所述室中(Pl和P2关闭)。因为微流体芯片是由弾性体材料(PDMS)制造的，因此额外的压カ能够留存在膨胀的反应室中。随后，当Pl打开且P2关闭时清洗液体被释放。所述室中的溶液通过膨胀泵送被更换。同样，通过測定线路(图中的A)的膨胀泵阀I和Pl来清洁反应室和试剂室。关闭阀P2并对测定线路的液体加压。清洗溶液可从测定线路通过试剂-反应室，并通过切換I和Pl阀而流出芯片。通过切换阀P1、P2和I，膨胀泵送模式可以是仅样品侧、仅被测物侧、ー个周期的样品侧推入紧跟ー个周期的被测物侧推入、5个周期的样品侧推入紧跟2个周期的被测物侧推入。这种组合可与室体积比或任何其他偏好有夫。图2提供芯片使用和再生的示例性工作流程。对新的或再生的芯片上样用于实时PCR0可通过用核酸失活溶液(例如，漂白剤)清洗和随后用水润洗来再生使用过的芯片。清洗时间包括液体泵送时间和在室温下孵育的时间。在这个具体的设计中，清洗时间约为I小吋。可进ー步根据不同的芯片设计和化学应用进ー步优化。清洗之后，在升高的温度下蒸发清洗液体。再生后的芯片随后进入下ー个循环。应理解的是，图2仅用于举例而非限制。为了测试再生过程，在同一芯片的两半中进行了一系列实时PCR。用基因组DNA和GAPDH引物对反应室的一半进行上样，作为阳性对照。用无模板对照(no templatecontrols, NTC)和GAPDH引物对所述室的另一半进行上样，作为阴性对照。在阳性对照部分，以预计的循环阈值(Ct)检测到了反映，室之间的标准差是一致的。当对芯片进行再生并在另一半上重复反应时，未观察到污染。反应在相似的条件(相同的基因组DNA加GAPDH引物)下进行，只是在芯片的另ー侧(即，在前一轮中为阴性对照的ー侧)进行阳性对照反 应。该反应产生相似的结果(相似的Ct)。还在芯片的另一部分进行阴性对照反应，且显示来自之前反应的模板或PCR产物均未被带到本次反应中。该实验证明成功地再生了微流体芯片。图4显示两个芯片中6个使用-再生-使用-再生循环的连续PCR結果。在每次反应中，将上文中描述的阳性和阴性对照上样到所述芯片中。获得阳性和阴性对照的热图以验证再生的有效性。为两个微流体芯片检查Ct和Ct的标准差。如图所示，所有的阳性反应均具有相似的Ct值和相似的Ct标准差。重要的是，Ct和标准差不随重新使用和再生而下降。女**还要理解的是，本文中描述的实施例和实施方案仅为举例目的，并且对其进行的多种修改和改变可对本领域技术人员做出启示，并且要包括在本申请的精神和范围以及所 附权利要求书的范围之内。
权利要求
1.使微流体装置适于在核酸分析中重复使用的方法，所述方法包括 a)通过泵送使核酸失活溶液流入所述装置的微流体通道；并且随后 b)通过泵送使清洗溶液流入所述通道，因而从所述通道中置换出所述核酸失活溶液， 由此使来自之前使用所述装置的任何残留核酸失活。
2.权利要求I的方法，其中所述微流体装置包含多个微流体反应室，其各自与所述微流体通道流体连接。
3.权利要求2的方法，其中所述微流体反应室包含来自之前使用所述微流体装置的残留核酸。
4.权利要求I的方法，其中所述核酸失活溶液与所述清洗溶液通过不同的流通路径引入所述通道中。
5.权利要求2的方法，其中所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或这二者在沿所述通道布置的多个点引入所述通道中。
6.权利要求5的方法，其中所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或这二者从微流体反应室流入所述通道的多个点。
7.从弹性体微流体装置中除去残留核酸的方法，其包括 a)使核酸失活溶液流入微流体空间， 其中所述微流体空间包含 i)第一微流体通道 ii)多个微流体反应室，其沿所述通道排列成串，并且各自与所述通道流体连接， 其中所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弹性体部分发生形变的压力和条件下引入所述微流体空间中，以及 b)使核酸失活溶液流过所述微流体空间，并且从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液，这通过泵送来实现。
8.权利要求7的方法，其中所述微流体空间包含多个第一微流体通道，其各自与多个微流体反应室流体相连。
9.权利要求7或8的方法，其中泵送包括第一过程和/或第二过程， 其中所述第一过程包括 i)使来自第一核酸失活溶液来源的核酸失活溶液通过第一微流体通道流入至少一个微流体反应室，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的弹性体部分发生形变的压力和条件下引入所述微流体空间；并且随后， ii)关闭一个或更多个第一输入阀以使所述失活溶液来源与所述至少一个微流体反应室隔离；并且随后， iii)打开一个或更多个第一输出阀以允许流体流出所述微流体空间； 并且 其中所述第二过程包括 i)使来自第二核酸失活溶液来源的核酸失活溶液通过多个接口通道流入所述多个微流体反应室，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的弹性体部分发生形变的压力和条件下引入所述微流体空间；并且随后， ii)关闭一个或更多个阀以使所述失活溶液来源与所述多个接口通道隔离；其中所述阀是接口阀或第二输入阀，并且随后， iii)打开一个或更多个第二输出阀以允许流体流出所述微流体空间，所述第二输出阀可以与所述第一输出阀相同或不同；其中所述第二核酸失活溶液来源可以与所述第一核酸失活溶液来源相同或不同。
10.权利要求9的方法，其中在所述第二过程中，每个接口通道将单个微流体反应室与单个微流体反应室相连接，每个接口通道具有与其相关联的接口阀，用于控制所述单个反应室与单个试剂室之间的流体连通，并且在所述一个或更多个第二输入阀打开时，每个反应室与所述第二核酸失活溶液来源流体连通。
11.权利要求9的方法，其中 所述第一过程包括使来自第一核酸失活溶液来源的核酸失活溶液经由进样通道通过所述第一微流体通道流入至少一个微流体反应室中；并且 所述第二过程包括使来自第二核酸失活溶液来源的核酸失活溶液经由进样通道通过多个接口通道流入所述多个微流体反应室中。
12.权利要求9的方法，其中泵送仅包括所述第一过程，其被重复至少一次。
13.权利要求9的方法，其中泵送仅包括所述第二过程，其被重复至少一次。
14.权利要求9的方法，其中泵送包括所述第一过程和所述第二过程，其中每个过程可被重复，并且其中所述过程根据预定的模式实施。
15.权利要求7至14中任一项的方法，其还包括通过以下除去所述核酸失活溶液 a)使清洗溶液遵循所述核酸失活溶液流入所述微流体空间的路径流入所述微流体空间， b)通过泵送使所述清洗溶液流过所述微流体空间，以及 c)从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液。
16.权利要求7至14中任一项的方法，其还包括通过以下除去所述核酸失活溶液 a)使清洗溶液遵循至少一个不同于所述核酸失活溶液流入所述微流体空间之路径的路径流入所述微流体空间， b)通过泵送使所述清洗溶液流过所述微流体空间，以及 c)从所述微流体空间中除去所述核酸失活溶液。
17.权利要求8的方法，其包括通过使清洗溶液流过所述微流体空间来除去所述核酸失活溶液，其中 a)如果根据所述第一过程引入所述核酸失活溶液，则使所述清洗溶液通过第三过程流过所述装置，所述第三过程包括 i)使来自清洗溶液来源的清洗溶液流入所述第一微流体通道并流入至少一个微流体反应室， 其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弹性体部分发生形变的条件和压力下引入所述微流体空间，并且随后， ii)关闭一个或更多个第三输入阀以使所述微流体空间与所述清洗溶液来源隔离；并且随后， iii)打开一个或更多个第三输出阀以允许流体流出所述微流体空间，所述第三输出阀可以与所述第一输出阀相同或不同；以及b)如果根据所述第二过程引入所述核酸失活溶液，则使所述清洗溶液通过第四过程流过所述装置，所述第四过程包括 i)使来自清洗溶液来源的清洗溶液流过所述多个接口通道进入至少一个微流体试剂室或至少一个微流体反应室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弹性体部分发生形变的条件和压力下引入所述微流体空间，并且随后， ii)关闭一个或更多个第四输入阀以使所述清洗溶液来源与所述微流体空间隔离，所述第四输入阀可以与所述第一输入阀相同或不同；或者关闭所述接口阀，从而使所述清洗溶液来源与所述微流体空间隔离；并且随后， iii)打开一个或更多个第四输出阀以允许流体流出所述微流体空间，所述第四输出阀可以与所述第一输出阀相同或不同。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中所述微流体通道和室的壁由弹性体构成。
19.权利要求18的方法，其中所述弹性体是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述阀是压力启动的弹性体阀。
全文摘要
提供了用于使微流体装置适于在核酸分析中重复使用的方法。所述方法可包括通过泵送使核酸失活溶液流入所述装置的微流体通道；并且随后通过泵送使清洗溶液流入所述通道，从而置换所述通道中的所述核酸失活溶液，由此使来自之前使用所述装置的任何残留核酸失活。
文档编号A61L2/00GK102686246SQ201080060206
公开日2012年9月19日 申请日期2010年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者王菁, 蒂莫西·M·沃登贝里 申请人:富鲁达公司