专利名称：一种具有抗焦虑作用的药物组合物的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物的检测方法，特别涉及一种具有抗焦虑作用的药物组合物的检测方法。
背景技术：
焦虑症是一种以急性焦虑反复发作为特征的神经官能症，包括广泛性焦虑及惊恐障碍，发作时常伴有头晕、胸闷、心悸、呼吸困难、口干、尿频、尿急、出汗、震颤和运动性不安，以及睡眠障碍等，并伴有植物神经功能紊乱。随着现代社会的发展，人们的生活节奏普遍加快，来自于社会、生活和工作等方面的压力越来越大，因此焦虑症患者日渐增多。目前临床常用的抗焦虑药分为苯二氮卓类和非苯二氮卓类。苯二氮卓类如氯氮革(利眠宁)、地西泮和硝西泮等；非苯二氮革类如丁螺环酮、黛力新和抗抑郁药等。长期使用 易成瘾、耐受，存在记忆力下降、胃肠道反应、疗效降低等不良反应。本发明在中医临床的基础上，筛选、提供一种有效性高、安全性好的中药组合物用于治疗焦虑症。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗焦虑作用的药物组合物的检测方法，本发明的另一个目的在于提供一种具有抗焦虑作用的药物组合物的胶囊制剂的检测方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种具有抗焦虑作用的药物组合物的检测方法，该方法采用高效液相色谱法检测色谱及检测条件Agilent C18色谱柱；以10-30 70-90的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；检测波长280nm ；以橙皮苷溶于有机溶剂制备对照品溶液；有机溶剂提取该组合物制剂，制备样品溶液；分别吸取对照品溶液与样品溶液注入液相色谱仪，测定。本发明药物组合物的检测方法优选为高效液相色谱法色谱及检测条件Agilent C18色谱柱；以10-30 70-90的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；柱温35°C ;流速lmL/min，检测波长280nm ；对照品溶液的制备取橙皮苷用甲醇溶解；样品溶液的制备取该药物组合物制剂，粉碎，用甲醇回流提取制得；测定法分别精密吸取对照品溶液与样品溶液注入液相色谱仪，测定，即得。本发明药物组合物中橙皮苷含量为O. 4-0. 8mg/g。本发明药物组合物的检测方法优选为色谱及检测条件AgilentC18 色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);以 20 : 80 的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；柱温35°C ;流速lmL/min，检测波长280nm。
对照品溶液的制备精密称取橙皮苷9. 8mg,用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，摇匀，即得。样品溶液的制备取本发明药物组合物制剂，粉碎，称取5g，置索氏提取器中，力口适量甲醇，置水浴上回流提取至提取液无色，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，置于IOOmL容量瓶瓶中，甲醇定容至100mL。测定法分别精密吸取对照品溶液5μ I与样品溶液15 μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。
本发明药物组合物中橙皮苷含量为O. 68mg/g。本发明药物组合物胶囊制剂的检测方法为色谱及检测条件AgilentC18 色谱柱(4. 6mmX 250mm，5 μ m);以 10-30 70-90的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；柱温35°C ;流速lmL/min，检测波长280nm。对照品溶液的制备精密称取橙皮苷9. 8mg,用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，摇匀，即得。样品溶液的制备取本发明药物组合物胶囊制剂去壳，称取2-8重量份颗粒，置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴上回流提取至提取液无色，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，置于IOOmL容量瓶瓶中，甲醇定容至100mL。测定法分别精密吸取对照品溶液O. 002-0. 008体积份与样品溶液O. 01-0. 02体积份，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明药物组合物胶囊制剂中橙皮苷含量为O. 4-0. 8mg/g。本发明药物组合物的检测方法优选为色谱及检测条件AgilentC18 色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);以 20 : 80 的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；柱温35°C ;流速lmL/min，检测波长280nm。对照品溶液的制备精密称取橙皮苷9. 8mg,用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，摇匀，即得。样品溶液的制备取本发明药物组合物胶囊制剂去壳，称取5. 00重量份颗粒，置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴上回流提取至提取液无色，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，置于IOOmL容量瓶瓶中，甲醇定容至100mL。测定法分别精密吸取对照品溶液0. 005体积份与样品溶液0. 015体积份，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明药物组合物胶囊制剂中橙皮苷含量为0. 68mg/g。本发明所述的重量份与体积份为g/ml的关系。本发明药物组合物的原料药组成为蜘蛛香 5-20重量份合欢皮 5-15重量份酸枣仁 5-15重量份灯心草 0.5-4重量份。本发明药物组合物的原料药组成优选为蜘蛛香 8-16重量份合欢皮 6-12重量份酸枣仁 6-14重量份灯心草 0.6-2重量份。本发明药物组合物的原料药组成优选为蜘蛛香 12重量份合欢皮 9重量份
炒酸枣仁9重量份灯心草 I重量份。本发明药物组合物的原料药组成优选为蜘蛛香 8重量 份合欢皮 12重量份炒酸枣仁14重量份灯心草 O. 8重量份。本发明药物组合物的原料药组成优选为蜘蛛香 18重量份合欢皮 6重量份炒酸枣仁8重量份灯心草 I. 2重量份。本发明药物组合物的制备方法，包括如下步骤步骤I :选取上述比例原料药；步骤2 :取蜘蛛香粉碎成粗粉，用乙醇提取；步骤3 :将酸枣仁与合欢皮粉碎成粗粉，水提取；步骤4 :将灯心草用乙醇提取；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液。上述步骤2中，蜘蛛香药材用15-55%乙醇回流提取；优选提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；乙醇优选35% ；上述步骤3中，酸枣仁与合欢皮加5-15重量倍的水，回流提取2-5次，每次1_3小时；上述步骤4中，灯心草用40-60重量倍的60-99%乙醇回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；乙醇优选95%。为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如填充齐U、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括甜味剂及各种香精；防腐剂包括尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第I版中各剂型记载的辅料)。本发明药物组合物胶囊剂的制备方法为取蜘蛛香粉碎成粗粉，用相当于蜘蛛香药材5-15重量倍的35%乙醇，回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；将酸枣仁与合欢皮粉碎成粗粉，加5-15重量倍的水，回流提取2-5次，每次1_3小时；将灯心草粉碎成粗粉，用40-60重量倍的95%乙醇，回流提取2_5次，每次O. 5-1. 5 小时；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，各成分干膏按处方比例混合，加入O. 2-0. 8重量倍干膏量的糊精，混匀，80-95%乙醇作为润湿剂，进行制粒，过20目筛，颗粒应保存在临界相对湿度70-90%以下，即得。本发明药物组合物胶囊剂的制备方法优选为取蜘蛛香粉碎成粗粉，用相当于蜘蛛香药材10重量倍的35%乙醇，回流提取3次，每次I小时；将酸枣仁与合欢皮粉碎成粗粉，加10重量倍的水，回流提取3次，每次2小时；将灯心草粉碎成粗粉，用50重量倍的95%乙醇，回流提取3次，每次I小时；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，各成分干膏按处方比例混合，加入O. 5重量倍干膏量的糊精，混匀，90 %乙醇作为润湿剂，进行制粒，过20目筛，颗粒应保存在临界相对湿度80 %以下，即得。经过线性关系考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验以及回收率试验等一系列考察，本发明药物组合物的检测方法准确、有效，能够较好的控制产品的质量。实验例I :本发明药物组合物胶囊剂药效学实验 I材料与方法I. I 材料I. I. I实验动物SD大鼠，雄性，初始体重140 180g，随机分为5组，每组10只。I. I. 2药品与试剂地西泮、吗啡用生理盐水调成所需的浓度溶液。本发明药物组合物胶囊按实施例I方法制备，用生理盐水调成所需的浓度溶液。I. I. 3实验仪器大鼠高架十字迷宫、Vogel饮水冲突实验装置和辐射热刺激诱发疼痛仪器。I. 2实验方法1.2. I大鼠高架十字迷宫实验SD雄性大鼠随机分为本发明药物组合物胶囊高、中、低剂量组、地西泮组和空白组共5组，其中本发明药物组合物低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按原生药O. 75g/kg/d、I. 5g/kg/d和3g/kg/d给予灌胃，地西泮按lmg/kg/d给药，空白组灌服等容积的生理盐水。连续IOd灌胃给药，给药体积为lml/100g。于第IOd中药组和盐水对照组末次给药Ih后，地西泮组给药O. 5h后，于8:00 14:OOAm做行为测试。高架十字迷宫包括两个开臂(50.8cmX10.2cmXl.3cm)、两个闭臂(50. 8cmX 10. 2cmX40. 6cm)和中央区(10. 2cmX 10. 2cm)，距地面72. 4cm。迷宫测试前将每只大鼠放入I个45cmX30cmX 15cm塑料盒中，任其自由探究5min后迅速置于EPM的中央平台处，使其头部正对其中I个开放臂，采用红外线技术记录5min内动物进入开臂次数(open arm entry, 0E)、闭臂次数(closearm entry,CE)及迷宫中央区内的次数及在开臂与闭臂内的运动时间。以进入开臂次数与总入臂次数的百分比(the percentage of entries to the open arms, OE% )及在开臂内运动时间与开臂闭臂内的总时间的百分比(the percentage of time spent in the openarms, OT% )代表抗焦虑作用指标。每次测试完成后用湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进行下一只大鼠的测试。I. 2. 2大鼠Vogel饮水冲突实验大鼠分组与给药剂量同I. 2. 1，大鼠Vogel饮水冲突实验在日光灯照下分两个阶段进行。第一阶段，非惩罚饮水训练将大鼠禁水24h后单个置于操作箱，让其充分探究，直到发现瓶嘴并开始舔水，记录大鼠3min的舔水次数，淘汰舔水少于300次的大鼠。第二阶段，惩罚实验上述未被淘汰的大鼠继续禁水24h(共48h)后置于操作箱。大鼠能很快找到瓶嘴并开始舔水，舔够20次仪器自动开始计时并给予一次电击(舔水与电击次数之比为20 I)，电击强度一般为O. 2-0. 5mA (惩罚期)，持续2s。记录大鼠3min的舔水次数。I. 2. 3大鼠自发饮水实验同方法I. 2. 2，只是在惩罚期内撤除电击，记录大鼠在无电击时3min内的舔水次数。I. 2. 4痛阈实验
大鼠分组与给药剂量同I. 2. 1，另加10只吗啡组，腹腔注射30min后进行辐射热测试。通过一个100瓦的灯泡提供，光线经聚焦后由直径4_的小孔投射出来，透过1_厚的有机玻璃板垂直照射大鼠足底，动物出现回避行为后手动关闭辐射热灯，在行为药理学实验过程中，需将正常大鼠的抬脚潜伏期调整到8s左右，设定最大结束时间为22s。这样可以阻止组织损伤，其中抬脚潜伏期是指每次开始给与足底热刺激直到大鼠抬脚之间的时间间隔。每只大鼠每只脚给与四次刺激，同一只大鼠两次热辐射刺激之间至少间隔5min，取最后三次热辐射刺激的结果进行平均并用于统计学检验。I. 2. 5 数据用SAS8.2软件对数据进行统计，用t检验进行组间比较，结果以无±观表示。*P
<O. 05，林P < O. 01, #P < O. 05有显著性差异。2.实验结果2. I大鼠高架十字迷宫实验表I本发明药物组合物胶囊对大鼠高架十字迷宫模型的影响(E，n = 9-10)
剂量
组别，，Total entries 0T%0Ε%
_/g.kg_
空白对照组-17.22± 1.5133.43±5.9830.50±3.83
地西泮组 0.00119.10±0.4853.55 ±2.25*41.26 ±2.30*
0.7516.20± 1.1736.54±3.7328.27±3.42
中剂量组 1.514.60± 0.6748.15 ± 1.75*39.05 ±2.31
高剂量组 315.50± 1.0951.14 ±2.49*43.06 ±2.79*注与空白组相比，*P < O. 05。从表I结果可以看出，与空白对照组相比，地西泮组和本发明药物组合物胶囊高剂量组可明显增加大鼠OE%和OT% (P <0.05);同时与空白组相比，中剂量组可增加大鼠OT% (P < O. 05)，而总入臂次数则无明显变化，其它各组间无显著差异。实验结果表明本发明药物组合物胶囊剂量为3g/kg/d时，在此模型上具有抗焦虑作用。2. 2大鼠Vogel饮水冲突实验
表2本发明药物组合物胶囊对大鼠Vogel饮水冲突模型饮水次数的影响G±SE，η = 10)
权利要求
1.一种具有抗焦虑作用的药物组合物制剂的检测方法，其特征在于该方法为 该方法采用高效液相色谱法检测； 色谱及检测条件=Agilent C18色谱柱；以10-30 70-90的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；检测波长280nm ;以橙皮苷溶于有机溶剂制备对照品溶液；该组合物制剂由有机溶剂提取制备样品溶液；分别吸取对照品溶液与样品溶液注入液相色谱仪，测定； 其中所述药物组合物制剂的原料药组成为 蜘蛛香 5-20重量份合欢皮 5-15重量份 酸枣仁 5-15重量份灯心草 O. 5-4重量份。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述药物组合物制剂的原料药组成为蜘蛛香 8-16重量份合欢皮 6-12重量份酸冬仁 6-14重量份灯心草0.6-2重量份或蜘蛛香 12重量份合欢皮9重量份炒酸参仁 9重量份灯心草I重量份或蜘蛛香 8重量份合欢皮12重量份炒酸参仁 14重量份灯心草0.8重量份或蜘蛛香 18重量份合欢皮6重量份炒酸冬仁 8重量份灯心草 1.2重量份。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于药物组合物制剂的制备方法为 选取上述比例原料药，蜘蛛香药材用15-55%乙醇回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；酸枣仁与合欢皮加5-15重量倍的水，回流提取2-5次，每次1-3小时；灯心草用40-60重量倍的60-99%乙醇回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，即得。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于该方法为 高效液相色谱法色谱及检测条件Agilent C18色谱柱；以10-30 70-90的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；柱温35°C ;流速lmL/min，检测波长280nm ； 对照品溶液的制备取橙皮苷用甲醇溶解； 样品溶液的制备取该药物组合物制剂，粉碎，用甲醇回流提取制得； 测定法分别精密吸取对照品溶液与样品溶液注入液相色谱仪，测定，即得。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于该方法中 对照品溶液的制备方法为精密称取橙皮苷9. 8mg,用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，摇匀，即得； 样品溶液的制备方法为取本发明药物组合物制剂，粉碎，称取2-8g，置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴上回流提取至提取液无色，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，置于IOOmL容量瓶瓶中，甲醇定容至100mL。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于该方法为该方法采用高效液相色谱法检测； 色谱及检测条件Agilent C18色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);以20 : 80的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相；柱温35°C ;流速lmL/min，检测波长280nm ； 对照品溶液的制备精密称取橙皮苷9. 8mg，用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶，摇匀，即得； 样品溶液的制备取本发明药物组合物制剂，粉碎，称取5重量份，置索氏提取器中，力口适量甲醇，置水浴上回流提取至 提取液无色，放冷，滤过，滤液浓缩至近干，置于IOOmL容量瓶瓶中，甲醇定容至IOOmL ； 测定法分别精密吸取对照品溶液5μ I与样品溶液15 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即 得;本发明药物组合物中橙皮苷含量为O. 68mg/g。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于色谱及检测条件中以20 80的乙腈-O. 3%磷酸溶液为流动相。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于该方法中所述药物组合物的胶囊制剂由如下方法制备 取蜘蛛香粉碎成粗粉，用相当于蜘蛛香药材5-15重量倍的35%乙醇，回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；将酸枣仁与合欢皮粉碎成粗粉，加5-15重量倍的水，回流提取2-5次，每次1-3小时；将灯心草粉碎成粗粉，用40-60重量倍的95%乙醇，回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，各成分干膏按处方比例混合，力口入O. 2-0. 8重量倍干膏量的糊精，混匀，80-95%乙醇作为润湿剂，进行制粒，过20目筛，颗粒应保存在临界相对湿度70-90%以下，即得。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于该药物组合物的胶囊制剂由如下方法制备 取蜘蛛香粉碎成粗粉，用相当于蜘蛛香药材5-15重量倍的35%乙醇，回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；将酸枣仁与合欢皮粉碎成粗粉，加5-15重量倍的水，回流提取2-5次，每次1-3小时；将灯心草粉碎成粗粉，用40-60重量倍的95%乙醇，回流提取2-5次，每次O. 5-1. 5小时；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，各成分干膏按处方比例混合，力口入O. 2-0. 8重量倍干膏量的糊精，混匀，80-95%乙醇作为润湿剂，进行制粒，过20目筛，颗粒应保存在临界相对湿度70-90%以下，即得。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于药物组合物的胶囊制剂由如下方法制备 取蜘蛛香粉碎成粗粉，用相当于蜘蛛香药材10重量倍的35%乙醇，回流提取3次，每次I小时；将酸枣仁与合欢皮粉碎成粗粉，加10重量倍的水，回流提取3次，每次2小时；将灯心草粉碎成粗粉，用50重量倍的95%乙醇，回流提取3次，每次I小时；将以上提取液分别回收溶剂，浓缩成干膏，各成分干膏按处方比例混合，加入O. 5重量倍干膏量的糊精，混匀，90%乙醇作为润湿剂，进行制粒，过20目筛，颗粒应保存在临界相对湿度80%以下，即得。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗焦虑作用的药物组合物的检测方法以及一种具有抗焦虑作用的药物组合物的胶囊制剂的检测方法，该方法采用高效液相色谱法检测，并且经过线性关系考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验以及回收率试验等一系列考察，本发明药物组合物的检测方法准确、有效，能够较好的控制产品的质量。
文档编号A61K9/48GK102716275SQ20111008006
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘勇, 彭敏, 王延丽, 石晋丽, 翟玉静, 赵保胜, 郑虎占, 郭建友 申请人:石晋丽