专利名称：多肽驴皮胶的代血浆的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽驴皮胶的代血浆，属于医药技术领域。
背景技术：
众所周知，血浆是循环血液之液体部分，是一种含有血清蛋白、无机盐类、电解质、葡萄糖和纤维蛋白原的水溶液。在平时特别是战争时期当人体因种种原因出现失血过多时，都需补充血浆，应用人血血浆和血液制品已随一些由血液传染的病如肝炎、艾滋病等而变得不十分安全。再加上人体血源受到限制，价格又贵，因此单靠人体血源己不能满足大量用血的需要。开发和研制非人体血液的代血浆已成为科技界和医学界十分关注和重视的问题。当前在医学临床中，普遍应用的代血浆是右旋糖酐、羟乙基淀粉和明胶代血浆。右旋糖酐临床应用的不良反应较多，如过敏反应、急性肾功能衰竭、蓄积作用、出血倾向、交叉配血实验的假凝集、加速血沉、抑制吞噬功能系统。羟乙基淀粉的生物学效应取决于它的平均分子量和羟乙基的取代度，较低相对分子质量的羟乙基淀粉的扩容强度小，较高相对分子质量的羟乙基淀粉在脏器内积存期较长，使红细胞聚集增加，出血时间延长，低取代的羟乙基淀粉在血液循环中易被血液淀粉酶所水解，在循环中存留时间较短，高取代羟乙基淀粉因停留时间过长会发生体内蓄积和凝血机制受损。而且这类代血浆的制备工艺复杂， 工艺条件控制较难，成品产量少而价格高，其成份以低分子量为主，不参与体内代谢过程， 无营养价值。研究表明，明胶代血浆具有最好的血液相溶性，即使大剂量输注，也几乎不影响凝血机制和纤维蛋白溶解系统，在临床应用中过敏反应症状也较血浆蛋白或右旋糖酐轻微，是优选的代血浆。可供临床使用的明胶代血浆有3种，即氧化聚明胶、脲联明胶、琥珀酰明胶。氧化聚明胶于1951年用于临床，但过敏反应发生率较高，曾报道应用后发生过敏性休克死亡的病例，对血沉及血型鉴定亦有影响，现已少用。脲联明胶由于其溶液中钙离子浓度过高，使得在应用中会出现凝胶现象。琥珀酰明胶是由牛胶原经琥珀酰化而成的胶体溶液，皮肤丘疹反应较多，且随着疯牛病的出现和全球蔓延，已不再用牛骨制备明胶。寻找新的胶原蛋白的来源、探索新工艺、制备安全有效的血浆代用品迫在眉睫。多肽驴皮胶代血浆属于明胶类代血浆，其扩充血容量、改善微循环的作用突出，并具有促进红细胞再生、促进受损的肝细胞恢复的优势，将成为新一代理想的血浆产品，可广泛应用于战伤、外伤、烧伤、手术等各种情况下补充血量，维持血压，不仅市场可观，而且具有较大的社会意义。CN1055111公开了一种驴皮胶代血浆及其制备方法。该专利通过改进传统阿胶的制备工艺“原料的去脂、除热原处理，原胶熬制分离，原胶的除菌、除热原精制和代血浆配制”制备代血浆。该专利所述的驴皮胶代血浆制备方法繁琐，难于规模化生产。CN101185657 保护驴皮阿胶代血浆生产工艺及装置，该专利的制备方法复杂，同样难于规模化生产
发明内容
本发明的目的是提供一种安全高效的多肽驴皮胶代血浆。本发明的另一个目的是提供所述的多肽驴皮胶代血浆的制备方法。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案
一种多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于它是由下列重量份配比的原料制取的代血菜， 多肽驴皮胶(重均分子量10000-15000道尔顿)1-3重量份多肽驴皮胶(重均分子量25000-30000道尔顿)1-3重量份色氨酸0. 001-1重量份
氯化钠0. 1-1重量份
注射用水加至100重量份。所述的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的多肽驴皮胶(重均分子量 10000-15000道尔顿)的制备方法包括驴皮去脂、切割、碳酸钠溶液浸泡，熬胶，加水稀释， 喷雾干燥，溶解，过滤，110°C -120°c降解，阳离子交换去杂质，过滤，真空干燥，分装，备用。所述的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的多肽驴皮胶(重均分子量 25000-30000道尔顿)的制备方法包括驴皮去脂、切割、碳酸钠溶液浸泡，熬胶，加水稀释， 喷雾干燥，溶解，过滤，阳离子交换去杂质，过滤，真空干燥，分装，备用。所述的的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的色氨酸是色氨酸及其盐，优选是L-色氨酸。所述的的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于制备方法包括将多肽驴皮胶重均分子量10000-15000道尔顿)、多肽驴皮胶(重均分子量25000-30000道尔顿)、色氨酸、氯化钠溶于注射用水中，加入活性炭煮沸，过滤，分装，热压灭菌。
所述的的多肽驴皮胶的代血浆的冷冻干燥制剂。本发明的有益效果主要是
1、多肽驴皮胶属于明胶的一种，明胶的物理、化学性质不仅与平均分子量有关，而且更重要的是与其分子量分布有关。作为血浆代用品，明胶的分子量及其分布关系到血容量的扩充效果和其在血液循环中存留的时间。本发明将重均分子量不同的多肽驴皮胶组合应用制备代血浆，含有分子量大小不同的明胶分子，其优点在于其中较小分子易从肾小球滤过，在输入初期有促进利尿的作用；而较大分子则滞留在血管内，延长扩容效应，研究证明本发明的产品维持血容量的有效时间达到他以上。2、明胶类产品中色氨酸含量较少，本发明提供的多肽驴皮胶代血浆中额外添加了色氨酸。色氨酸的增加可刺激其白蛋白的合成，从而补充大量流失的血浆蛋白，而其它氨基酸则仅仅是合成蛋白的原料。3、本发明提供的多肽驴皮胶代血浆在临床应用时能参与体内代谢，具有良好的扩充血容量、保持必要渗透压、改善微循环的作用，能够维持一定的血压，改善因有效循环血容量不足而引起的休克等症状。4、本发明提供的多肽驴皮胶代血浆制备工艺中引入喷雾干燥，不仅制备工艺得到了简化，适宜于大规模化生产，而且粗胶喷雾干燥后复溶，各种杂质不溶于水而最大程度的去除，后续过滤等操作的速度也大大提高。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但本发明的范围并不受这些实例的任何限制。实施例1
多肽驴皮胶(重均分子量12000道尔顿)IOOg 多肽驴皮胶(重均分子量观000道尔顿)IOOg 色氨酸Ig
氯化钠70g
注射用水加至10000g。(1)多肽驴皮胶(重均分子量12000道尔顿)的制备方法选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮、去毛、去脂，2%的碳酸钠溶液浸泡10分钟，清洗，用水蒸煮驴皮，使其成明胶状，加水稀释，喷雾干燥(进风温度160°C，出风温度50°C )，收集干燥粉末，复溶于适量蒸馏水中，采用卧式离心机过滤，滤液在压力容器中120°C降解5小时，阳离子交换去除钙离子等杂质，卧式离心机过滤，60°C真空干燥，分装，备用，Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为12000。(2)多肽驴皮胶(重均分子量四000道尔顿)的制备方法选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮、去毛、去脂，2%的碳酸钠溶液浸泡10分钟，清洗，用水蒸煮驴皮，使其成明胶状，加水稀释，喷雾干燥(进风温度160°C，出风温度50°C )，收集干燥粉末，复溶于适量蒸馏水中，采用卧式离心机过滤，滤液阳离子交换去除钙离子等杂质，卧式离心机过滤， 60°C真空干燥，分装，备用，Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为观000。(3)多肽驴皮胶代血浆的制备
(4)将多肽驴皮胶(重均分子量12000道尔顿)100g、多肽驴皮胶(重均分子量29000道尔顿)100g、色氨酸lg、氯化钠70g溶于适量注射用水中，调PH值6. 5，加入活性炭煮沸，过滤，调PH值7 8，过滤，加注射用水至10L，分装，115°C热压灭菌，Zetasizer Nano ^光散射法测定重均分子量为20000。实施例2
多肽驴皮胶(重均分子量15000道尔顿)IOOg 多肽驴皮胶(重均分子量观000道尔顿)200g 色氨酸Ig
氯化钠60g
注射用水IOOOOg
(1)多肽驴皮胶(重均分子量15000道尔顿)的制备方法选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮、去毛、去脂，2%的碳酸钠溶液浸泡10分钟，清洗，用水蒸煮驴皮，使其成明胶状，喷雾干燥(进风温度160°C，出风温度40°C)，收集干燥粉末，复溶于适量蒸馏水中，采用卧式离心机过滤，滤液在压力容器中120°C降解4小时，阳离子交换去除钙离子等杂质， 卧式离心机过滤，50°C真空干燥，分装，备用，Zetasizer Nano ZS光散射法测定重均分子量为 15000。(2)多肽驴皮胶(重均分子量观000道尔顿)的制备方法选用健康、无病的毛驴进行清洗、宰杀、剥皮、去毛、去脂，2%的碳酸钠溶液浸泡10分钟，清洗，用水蒸煮驴皮，使其成明胶状，喷雾干燥(进风温度165°C，出风温度55°C)，收集干燥粉末，复溶于适量蒸馏水中，采用卧式离心机过滤，滤液阳离子交换去除钙离子等杂质，卧式离心机过滤，60°C真空干燥，分装，备用，Zetasizer Nano M光散射法测定重均分子量为观000。(3)多肽驴皮胶代血浆的制备
将多肽驴皮胶(重均分子量15000道尔顿)100g、多肽驴皮胶(重均分子量28000道尔顿》008、色氨酸lg、氯化钠60g溶于IOOOOg注射用水中，调PH值7. 0，加入活性炭煮沸，过滤，调PH值7 8，加注射用水至10L，无菌过滤，分装，冷冻干燥，Zetasizer Nano ZS光散射法测定重均分子量为22000。实施例3
多肽驴皮胶代血浆体外溶血与凝聚试验试验动物新西兰种白色家兔，雄性，体重2. ^g，中国药科大学实验动物中心提供。试验方法按中国药典二部附录XI L溶血与凝聚法进行。2%的红细胞混悬液的制备采用心脏取血法取兔血10毫升，放入含灭菌玻璃珠的50ml三角烧瓶中同方向震荡10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0. 9%氯化钠溶液约100毫升，分装至10毫升刻度离心管中，摇勻，1200转/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0. 9%氯化钠溶液按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。 将所得红细胞加0. 9%氯化钠溶液配成2%的红细胞混悬液，备用。供试品的制备按实施例1制备多肽驴皮胶代血浆。检查法取洁净玻璃试管5只，编号。1、2号管为供试品管，3号管为阴性对照管， 4号管为阳性对照管，5号管为供试品对照管。按表1所示依次加入洲红细胞悬液、0. 9%氯化钠溶液、蒸馏水，混勻后，立即置37°C 士0. 5°C的恒温箱中进行温育。3小时后观察溶血和凝聚反应。表1溶血实验方案
试管编号1、23452%红细胞混悬液(ml)2. 52. 52. 50. 9%氯化钠溶液(ml)2. 22. 54. 7蒸馏水(ml)2. 5多肽驴皮胶代血浆(ml)0. 30. 3
结果
阴性对照管上层液体清亮透明，下层是沉淀的红血球，无溶血和凝聚发生，阳性对照管液体呈红色透明，发生溶血。供试品管中上层液体清亮透明，下层是沉淀的红血球，无溶血和凝聚发生。表明多肽驴皮胶代血浆符合注射溶血与凝聚试验的规定，可供注射使用。实施例4
多肽驴皮胶代血浆过敏性试验
试验动物豚鼠，雄性，体重2680—330 g，中国药科大学实验动物中心提供。试验方法按中国药典二部附录XI K过敏反应检查法进行。供试品的制备按实施例1制备多肽驴皮胶代血浆。检查法取上述豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射供试品0.5ml，共3次，进行致敏。每日观察每只动物的行为和体征，首次致敏和激发前称量并记录每只动物的体重，然后将其平均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉注射供试品溶液Iml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应症状。
结果三次腹腔致敏注射给药后未见豚鼠精神、活动、行为和体重出现异常；静脉激发注射给药后豚鼠呼吸均勻、被毛不竖，无抓鼻、咳嗽、呕吐、喷嚏等症状，未见其它精神、 行为的异常和过敏反应症状，体重也无异常变化。表明多肽驴皮胶代血浆符合注射过敏性试验的规定，可供注射使用。实施例5
多肽驴皮胶代血浆对家兔静脉注射给药血管刺激性试验
试验动物新西兰种白色家兔，雄性，体重2. 2-2. ^g，中国药科大学实验动物中心提{共。试验方法
供试品的制备按实施例1制备多肽驴皮胶代血浆。检查法
取白色大耳家兔4只，供试品组和对照组各2只。在兔夹上固定后，双侧耳缘静脉用75%乙醇涂抹消毒，用5号注射针头刺入，给药组分别缓慢注射多肽驴皮胶代血浆 IOml (5ml/耳)，对照组注射等容积0. 9%生理盐水，速度大约5min/耳。干棉球压迫止血 5分钟。每天注射1次，在耳缘同一条静脉血管的远心端上连续给药7天，每天观察局部血管情况。在第7天注射给药后的2小时，棒击家兔枕部头颅处死，死亡1小时待血液完全凝固后，剪取注射静脉血管近心端的双耳廓面积2X4cm各一块，浸泡在10%甲醛固定液中， 经脱水、石蜡包埋、切片后制成标本玻片，再经H. E染色，显微镜下进行病理组织学观察。结果对照组和受试药组家兔在静脉注射后无全身性不良反应。第2次静脉注射给药后，肉眼观察局部血管皮下组织有少量出血引起的青紫色瘀斑，连续7天给药未见异常。病理组织学切片观察，对照组和受试药组注射部位血管及周围组织未见出血、水肿、变性或坏死等刺激性反应。表明多肽驴皮胶代血浆符合注射给药血管刺激性试验的规定，可供注射使用。实施例6
多肽驴皮胶代血浆对失血性休克犬血液动力学的影响试验动物成年健康杂种犬12只，雄性，体重15-20kg。， 试验方法
供试品的制备按实施例1制备多肽驴皮胶代血浆。对照品万汶(羟乙基淀粉130/0.4氯化钠，德国费森尤斯卡比股份有限公司) 上述12只成年健康杂种犬随机分为2组，分别是供试品组(多肽驴皮胶代血浆)、对照
组(万汶)，每组6只。腹腔注射2. 5%硫喷妥钠25mg/kg，气管内插管，机械通气，静注芬太尼、咪唑安定、维库溴铵维持麻醉。放血前以10 15ml/kg复方氯化钠静滴，实验全程以 5ml · kg-1 · IT1 维持。左侧股动脉置管用于检测平均动脉压(MAP)、放血及采血样，左侧股静脉置管用于输液及采血样，右侧股静脉置入Swan-Ganz导管用于测量肺动脉压(PAP)、肺动脉嵌压 (PAWP)、中心静脉压(CVP)及心排血量(CO)。经股动脉放血使MAP降至约5. 3 kPa,并维持 60 min。然后以与放血量等量的多肽驴皮胶代血浆或万汶在15 20 min内静脉输入。在放血前(T0)、休克时(T1)、输入代血浆后 IOmin (T2)、60min (T3)、4h(T4)、8h(T5)用惠普 71034监测仪测量记录HR、MAP、PAP、PAffP, CVP, CO (用温度稀释法，取3次平均值)，并计算心脏指数(Cl)、体循环阻力(SVR)。同时监测观察实验结束后呼吸、反射及球结膜水肿情况。
统计分析组内比较用t检验和秩和检验处理，组间比较用单因素方差分析处理，P<0. 05为有显著性差异。结果
供试品组(多肽驴皮胶代血浆)与对照组(万汶)动物的体重、放血量、代血浆输入量无统计差异(表2)。表2各组动物体重、放血量和代血浆输入量
组别体重(kg)放血量(ml)代血浆输入量(ml)多肽驴皮胶代血浆16. 35±2. 8沼6±93525 + 95万汶16. 76±3. 5518±78520±7血液动力学变化放血至犬休克时，多肽驴皮胶代血浆组与万汶组的MAP、PAP、 PAffP, CVP, CO、CI均显著降低(P<0. 01)。多肽驴皮胶代血浆或万汶快速静脉输入后，以上各项血液动力学指标均显著回升(P<0.01)。各时间段MAP上升幅度多肽驴皮胶代血浆组 >万汶组；CO、CI三组均回升到或超过基础值，各时间段上升幅度多肽驴皮胶代血浆组> 万汶组，二组比较有显著性差异(P<0.01) ；PAP、PAWP 二组在输入代血浆后均显著升高，各时间段升高幅度多肽驴皮胶代血浆组〉万汶组，二组比较有显著性差异(P<0.01) ；SVR在休克时二组均增高，但与基础值比较无统计学差异(P>0. 05)，输入代血浆后二组均显著降低(P<0. 01)，各时间段多肽驴皮胶代血浆组与万汶组比较无统计学差异(P>0. 05)(表2)。 实验结束后全部动物均恢复自主呼吸、睫毛反射，睁眼，出现肢动，无明显球结膜水肿。表明多肽驴皮胶代血浆对失血性休克犬扩充血容量的效果优于万汶。
表2各组血液动力学变化(n=6)
权利要求
1. 一种多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于它是由下列重量份配比的原料制取的代血浆，重均分子量10000-15000道尔顿的多肽驴皮胶 1-3重量份重均分子量25000-30000道尔顿的多肽驴皮胶 1-3重量份
2.根据权利要求1所述的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的重均分子量 10000-15000道尔顿的多肽驴皮胶的制备方法包括驴皮去脂、切割、碳酸钠溶液浸泡，熬胶，加水稀释，喷雾干燥，溶解，过滤，IlO0C -1200C降解，阳离子交换去杂质，过滤，真空干 fe^J分装 备用ο
3.根据权利要求1所述的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的重均分子量 25000-30000道尔顿的多肽驴皮胶的制备方法包括驴皮去脂、切割、碳酸钠溶液浸泡，熬胶，加水稀释，喷雾干燥，溶解，过滤，阳离子交换去杂质，过滤，真空干燥，分装，备用。
4.根据权利要求1所述的的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的色氨酸为色氨酸及其盐。
5.根据权利要求1所述的的多肽驴皮胶的代血浆，其特征在于所述的色氨酸为L-色氨酸。
6.根据权利要求1所述的的多肽驴皮胶的代血浆的制备方法，其特征在于按如下步骤实现将重均分子量10000-15000道尔顿的多肽驴皮胶、重均分子量25000-30000道尔顿的多肽驴皮胶、色氨酸、氯化钠溶于注射用水中，加入活性炭煮沸，过滤，分装，热压灭菌。
7.根据权利要求1所述的的多肽驴皮胶的代血浆的冷冻干燥制剂。色氨酸氯化钠注射用水.0. 001-1重量份 0. 1-1重量份加至100重量份。
全文摘要
本发明将重均分子量不同的多肽驴皮胶组合并配伍色氨酸制备代血浆，含有分子量大小不同的明胶分子，其优点在于其中较小分子易从肾小球滤过，在输入初期有促进利尿的作用；而较大分子则滞留在血管内，延长扩容效应；色氨酸的增加则能够刺激其白蛋白的合成，从而补充大量流失的血浆蛋白。
文档编号A61K33/14GK102210703SQ20111014627
公开日2011年10月12日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者花亚光, 邹亚轩, 黄雄伟, 黄雄信, 龚箭 申请人:江苏建中投资有限公司