专利名称：一种小牛血清去蛋白提取物的纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法。
背景技术：
小牛血清去蛋白提取物(protein-free calf blood extract)是1-6个月的幼牛血清经过除蛋白后得到的小分子生物活性物质，含有小分子多肽、氨基酸、酮酸等物质。其主要药理作用是增强细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用，具有改善细胞代谢的生理作用，毒性很小，在临床上应用广泛。但是，小牛血清去蛋白提取物中含有的少量杂质，如微量蛋白甚至病毒等非活性成分还是会带来一些副作用，也使其应用范围缩小，因此，对小牛血清去蛋白提取物进一步提取纯化将提高其安全性，增强效果，拓展使用范围。目前，常用小牛血清去蛋白提取物的提取方法主要包括酸解和酶解两种，其中酸 解会严重破坏提取物的基本结构，使产品严重失活；酶解能保证生物活性，如中国发明专利(ZL 96120777. 9)所公开的方法，该方法包括采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，离心分离留上清，将上清液浓缩、除菌、冻干，即得到小牛血清去蛋白提取物。其中，用乙醇去蛋白时乙醇的用量为两倍于血清体积的96 %乙醇；减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪，37°C、1个大气压下减压除乙醇；复合蛋白酶水解的时间为24小时(水解一些核酸及蛋白质)；水解之后的离心分离是在10000rpm、4°C下离心30分钟，留上清。但采用上述方法所提取到的产品纯度低、活性低，而且都没有进行病毒灭活，无法保证产品的生物安全性(如牛可能携带疯牛病、口蹄疫等多种病毒)，带来临床应用的安全隐患。
发明内容
本发明的目地是提供一种小牛血清去蛋白提取物的进一步提纯方法。本发明所提供的小牛血清区蛋白提取物的提纯方法，包括采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤，其中，超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。在本发明中，葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液为Tris-Hcl缓冲液，pH为6. 8-7. 2，优选为7. O ;以DEAE-S印hadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液为Tris-Hcl缓冲液进行梯度洗脱，含NaCl的浓度为O. 05mol/l,0. 8mol/l, pH为8· 0-8. 5，优选为8· 2，洗脱流速为3-5ml/min，层析柱的直径选择4cm-5cm，凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为20-50 I。在微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活时，是以O. 02-0. 024微米的微孔膜进行过滤，以强度为500-1500 μ w/cm2、波长为250_260nm的紫外线直接照射6_8秒。为了能更好的进行提取物的分离纯化，减压去除乙醇以后还可以将除乙醇后的液体经过截留分子量为100000道尔顿的中空纤维柱粗滤。在本发明中，用乙醇去蛋白时乙醇的用量可选用为两倍与血清体积的96%乙醇；减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪，37°C、1个大气压下减压除乙醇；加入复合蛋白酶水解的时间为24小时；水解之后离心分离留上清是在10000rpm、4°C下离心30分钟；上清液超滤是以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤。本发明纯化方法通过增加层析分离步骤，除掉了很多非活性成份，降低产物的分子量范围和发生不良反应的几率，并且使产品的生物活 性刺激指数由原来的2. 5以上提高到4. O左右，提高了产品的纯度和生物活性；通过增加病毒灭活步骤，能够有效杀灭小牛血清去蛋白提取物中的固有病毒，保证产品的安全性。本发明提取的产品可以做成水针、冻干分针、肠溶胶囊、肠溶片剂、凝胶剂等多种临床应用剂型，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式实施例I、提取小牛血清去蛋白提取物I、提取纯化方法(I)采幼牛静脉血，分离出血清在无菌条件下采6个月以内小牛静脉血，放于4°C冰箱中过夜，使其自然分离出一部分血清，剩余部分在无菌条件下，4000rpm, 4°C离心15分钟,分离出血清备用。(2)乙醇除蛋白按照乙醇和血清体积比为2 I的量向血清中加入96%乙醇，不断搅拌，静置60分钟，使蛋白质变性沉淀，离心(4000转/分，10分钟)后留上清弃沉淀。(3)除乙醇利用真空旋转蒸发仪，37°C，I个大气压减压除乙醇。(4)粗滤用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤，收集滤液。(5)酶解在滤液中加入复合蛋白酶，每10升血清加入复合蛋白酶9. 5mg，其中木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的比列为800 I。(6)离心在4°C、IOOOOrpm条件下离心30分钟，弃沉淀留上清。(7)超滤用截留分子量5000D的中空纤维柱超滤，收集滤液。(8)纯化用交联葡聚糖G-15凝胶层析脱盐(层析液为ρΗ7· O的Tris-Hcl缓冲液)，收集280nm波长紫外线有特异吸收的部分，调pH为8. 2 ;然后选用DEAE-S印hadex-50凝胶层析(胶床高度和直径的比为20 I，柱直径选用4. 5cm)，洗脱液为Tris-Hcl缓冲液，含NaCl的浓度为O. 05mol/l,0. 8mol/l，pH为8. 2，流速为3_5ml/min，用280nm波长紫外线监控，弃去第一洗脱部分，收集第二洗脱部分，然后减压浓缩到相对密度为I. 07。(9)病毒灭活采用微孔滤膜滤过+短波紫外线照射进行病毒灭活采用的微孔滤膜为Millipore公司的VireSolve70系列(膜孔径为O. 02-0. 024微米)；短波紫外线照射法具体是指用波长为254nm的短波紫外线，强度为1000 μ w/cm2，直接照射时间为7秒；得到小牛血清去蛋白提取物产品。2、产品检测I)液相检测将所得提取物样品，按照高效液相色谱法(《中国药典》二部附录V D)，用十八院基键合胶为填充剂，以O. 68%磷酸二氢梆溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(820 180)为流动相，流速为每分钟O. 75ml.，检验波长为293nm。本方法提取的产品能够得到稳定的指纹图谱，色谱图呈两主峰且两主峰面积之和应为总面积的75%以上，理论板数以第一峰计不低于4000。作为对比，采用现有方法提取得到的产品，色谱图不稳定，图谱难以突现出主峰，且定义有效成份的峰面积占总面积的比例不超过50% ;说明本发明方法能提高产品纯度。 2)产品的生物活性刺激指数测定SX《照国家药品标准-化学药品地方标准上升国家标准》第十六册16-83呼吸活性测定法检测呼吸活性，计算刺激指数。测得本发明所提取得到产品的生物活性刺激指数为4. O ；作为对比，采用现有方法提取得到的产品，其生物活性刺激指数为2. 7-3. 5 ；这表明，本发明方法有效的提高了产品生物活性。3)病毒灭活有效性测定按照本发明提取方法，收集到经过5000D中空纤维柱超滤得到的超滤液后，向其中加入脑心肌炎病毒(EMCV)和牛腹泻病毒(BVDV)为指示病毒，经过微孔膜滤过后，用波长为254nm的短波紫外线照射，强度为1000 μ w/cm2，直接照射时间为7秒；通过病毒对照培养，结果显示，采用上述灭活方法可以使脑心肌炎病毒滴度下降> 5. 00LgTCID5(l/0. Iml ;可以使牛腹泻病毒滴度下降彡4. 00LgTCID5Q/0. 1ml。结论所采用的病毒灭活方法可以有效灭活非脂包膜病毒和脂包膜病毒，能保证产品的安全性。
权利要求
1.一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤，其特征在于超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液为PH为6. 8-7. 2的Tris-Hcl缓冲液；以DEAE-S印hadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液为PH为8. 0-8. 5的Tris-Hcl缓冲液，进行梯度洗脱，含aCl的浓度为0. 05mol/l,0.8mol/l，洗脱流速为3-5ml/min，层析柱直径为4_5cm，凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为 20-50 I。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液pH为7. 0 ;以DEAE-S印hadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液pH为8. 2.
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述层析柱直径为4cm，凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为35 I。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活是以0. 02-0. 024微米的微孔膜进行过滤，以强度为500-1500 u w/cm2、波长为250_260nm的紫外线直接照射6-8秒。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述紫外线直接照射时间为7秒。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于减压去除乙醇之后经过截留分子量为100000道尔顿的中空纤维柱粗滤。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述用乙醇去蛋白时乙醇的用量为两倍于血清体积的96%乙醇；减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪，37°C、1个大气压下减压除乙醇；加入复合蛋白酶水解的时间为24小时；水解之后离心分离留上清是在10000rpm、4°C下离心30分钟；上清液超滤是以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，提供了一种小牛血清去蛋白提取物的纯化方法。该方法包括采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤；超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。本发明除掉了很多非活性成份，降低产物的分子量范围和发生不良反应的几率，提高了产品的纯度、安全性和生物活性，具有广阔的应用前景。
文档编号A61P43/00GK102805754SQ20111014808
公开日2012年12月5日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者陈放, 李如伟 申请人:复旦大学