专利名称：繁缕黄酮苷类提取物、其制备方法及制药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药繁缕的黄酮苷提取物，其提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备降血脂药物的用途。
背景技术：
繁缕[Stellariamedia(L. ) Cyr.]是石竹科(Caryophyllaceae)繁缕属 (Stellaria L.)植物，具有清热解，活血止痛，消肿等功效，主治痢疾，痈疮肿毒，乳痈，肠痈，疖肿，跌打损伤，产后瘀滞腹痛。繁缕为石竹科Caryophyllaceae 繁缕属 Stellaria L.植物繁缕 Stellaria media(L.) Cyr.的全草。别名蔹(《尔雅》)、蘩蒌(《别录》)、滋草(《千金 食治》)、鹅肠菜、鹅儿肠菜(《纲目》)、五爪龙(《湖南药物志》)、狗蚤菜(《广西药植名录》)、鹅馄饨 (苏医《中草药手册》)。繁缕属植物，全世界约120种，中国产63种15变种和2变型，原植物繁缕为常见田间杂草，广布全国(仅新疆、黑龙江未见记录)，亦为世界广布种。繁缕资源丰富，具有悠久的药用历史。多种医药古籍对繁缕均有记载，如《本草纲目》记载“活血， 去瘀，下乳，催生。治产后瘀滞腹痛，乳汁不多，暑热呕吐，肠痈，淋病，恶疮肿毒，跌打损伤”; 《药性论》记载“主治产后血块，炒热和童子小便服”；《本草拾遗》“主破血，下乳汁，下恶血”；《湖南药物志》:“止小便利，遗尿，洗手足风丹，遍身痒痛”;《贵州民间方药集》记载“ 解热利尿，催生，催乳，活血去瘀。治跌打损伤，消伤肿，又治无名肿毒。贵州民间将其作为降血脂草药使用，效果较好。对繁缕的化学成分研究始于20世纪70年代。研究表明，繁缕中含有以黄酮(Budzianowski J.等人，Studies on the antioxidative activity of some C-glycosylflavones, J. Pharmacol Pharm.，1991,43(5) :395 ；Kitanov G. Phenolic acids and flavonoids from Stellaria media (L.) Vi11. (Caryophyllaceae), J. Pharmazie, 1992，47 (6) :470 ；陈兴荣等人，繁缕的黄酮类化学成分研究，现代中药研究与实践，2005，19(4)41 ；Budzianowski J.等人，TwoC, 0-glycosylfIavones from Stellaria media, J. Plate Med,1991,57(3) :290)、皂苷(Hodisan V 等人’ Triterpenoid saponins from Stellaria media(L. )Cyr, J. Farmacia,1989, 37⑵105)、甾体(陈兴荣等人，繁缕的黄酮类化学成分研究，现代中药研究与实践， 2005,19(4) :41)、香豆素(Tsotsoriya G G，等人，Study of Stellaria media for its content of biologically active compounds[M]. Russian :Tbilis Gos，Med Inst. 1977.172)、木月旨素(Sun B 等人，Bioactive constituents from Chinese natural medicines. XIV. New glycosides of beta—carboline—type alkaloid，neolignan， and phenylpropanoic! from Stellaria dichotoma L.var.Ianceolata and theirantiallergic activities, J. Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2004,52(10) 1194)、酷酸(Kitanov G. Phenolic acids and flavonoids from Stellaria media(L.) Vill. (Caryophyllaceae), J. Pharmazie, 1992,47(6) :470)、亚麻酸酯(HohmannJ 等人， Monoacylgalactolipids from Stellaria media, J. Fitoterapia, 1996,67 (4) :381)等为主的多种化学成分。有关繁缕的现代药理学研究和临床应用方面的报道较少。其药理研究还很不充分，主要为解热、抗炎作用(王英华等人，引种与野生银柴胡化学成分比较研究，中国药学杂志，1991.洸(5) 266)和抗氧化作用(Budzianowski J.等人，Studies on the antioxidative activity of some C-glycosylflavones, J. Pharmacol Pharm. ,1991, 435) :395)。从现有文献报导可见，尚无关于繁缕系统化学成分及其活性的研究报道，尤其是没有关于其降血脂活性成分的报道。
发明内容
为阐明繁缕药理活性的物质基础，本发明人对繁缕进行了系统的化学研究，得到了系列黄酮苷类化合物和其他成分。在此基础上，对其中的一个黄酮苷部位进行了降血脂药理活性试验、制备工艺和质量控制研究，并发现按照本发明所述工艺得到的繁缕的黄酮苷提取物能够明显地降低实验动物血液总胆固醇和甘油三酯水平，具有显著的降血脂作用，显示出良好的治疗高血脂相关疾病的广阔应用前景。基于以上发现，本发明得以完成。因此，本发明的一个方面涉及中药繁缕的黄酮苷提取物，其中包括以提取物重量计18. 69-28.的芹菜素-6-C- β -D-半乳糖-8-C- α -L-阿拉伯糖苷(化合物1)和芹菜素-6-C- α -L-阿拉伯糖-8-C- β -D-半乳糖苷(化合物2)。本发明的另一个方面涉及中药繁缕的黄酮苷提取物的提取方法。本发明的再一个方面涉及含有中药繁缕黄酮苷提取物及一种或多种药用载体或赋形剂的药物组合物。本发明进一步的一个方面涉及中药繁缕黄酮苷提取物用于制备降血脂的药物的用途。根据本发明的一个实施方案，以提取物重量计，本发明提取物中含有9. 64-14. 46 的芹菜素-6-C- β -D-半乳糖-8-C- α -L-阿拉伯糖苷。根据本发明的另一个实施方案，以提取物重量计，本发明提取物中含有 9. 05-13. 57 w/VW的芹菜素-6-C- α -L-阿拉伯糖-8-C- β -D-半乳糖苷。根据本发明，所述的繁缕黄酮苷类提取物可按照图6的工艺路线获得具体来说，将新鲜采集的繁缕全草晾干，揉碎。该揉碎药材用含水醇提取，过滤，得提取液。提取液浓缩，除去醇，水溶解后离心，得到上清液。上清液进行大孔吸附树脂柱层析，依次用水和极性有机溶剂洗脱，极性有机溶剂洗脱部位浓缩除去溶剂后冷冻干燥，即得到繁缕黄酮苷提取物。因此，本发明繁缕黄酮苷提取物的制备方法包括以下步骤i)将繁缕药材用含水醇提取两次，合并提取液；
ii)浓缩除去醇，得到浓缩液；水溶解后离心，得到上清液；iii)将上清液进行大孔吸附树脂柱层析，依次用水和极性有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到本发明繁缕黄酮苷提取物。根据本发明，上述工艺路线中所用的大孔吸附树脂可为任何型号的弱极性大孔吸附树脂；提取所用的醇可为任何低级链烷醇，如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇等，其中醇的浓度范围为5% -85 V/V%;大孔吸附树脂层析洗脱所用的极性有机溶剂为大孔树脂允许使用的任何有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等，其浓度范围为5% -95 v/v%。根据本发明，本发明的繁缕黄酮苷提取物可按如下方法定性鉴别(1) α -萘酚反应(Molish 反应)提取物以适量水溶解，加10% α-萘酚乙醇溶液三滴，然后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，使形成上下两层，稍后在两层界面处可见紫色环，表示有苷类成分存在。O) AlCl3 反应提取物以适量水溶解，用毛细管点在层析纸上，喷洒AlCl3乙醇溶液显色，干燥后，黄色斑点于紫外荧光灯下显明显荧光，表示有黄酮成分。(3) FeCl3 反应提取物以适量水溶解，取Iml于试管中，加入3滴3% FeCl3水溶液，溶液变为灰褐色，表示有酚羟基。(4)提取物中以上述化合物1和2为代表的黄酮苷类成分的定性检查提取物适量10%乙醇溶解为待测液。以已经分离提纯的化合物1和2的10%乙醇溶液作为对照品。将待测液和对照液分别点样于聚酰胺层析薄膜上，以展开剂(乙醇/ 水，40 60)展开，喷洒AlCl3Z醇溶液显色，紫外灯下观察，待测液中有与对照液相同 Rf值的黄色荧光斑点。(5)繁缕黄酮苷提取物的HPLC-MS指纹图谱及其中主要成分的分析液相色谱条件高效液相分离条件乙腈-水(10 90)；流速1. 2ml/mi η ；柱温室温(24°C )。质谱条件负离子检测方式，Ion Spray离子源，源电压_4000V，DP电压_60V，FP 电压:-290V, NEB 8, CUR :11。根据本发明，本发明的繁缕黄酮苷提取物可按如下方法定量鉴别仪器与试剂高效液相色谱仪HITACHIL_2130Pump、HITACHI L-2420UV-VIS Detector、天美 T-2000L 色谱工作站、Dikma Diamonsil C18 色谱柱(240X4. 6mm, 5 μ m)对照品芹菜素-e-C-β -D-半乳糖-8-C-a -L-阿拉伯糖苷(对照品1)和芹菜素-6-C-a-L-阿拉伯糖-8-C-i3_D-半乳糖苷(对照品2)均由本实验室分离纯化所得，并经现代光谱技术确定结构，HPLC面积归一化法测得其纯度在95. 0%以上。试剂甲醇(色谱纯)Fisher公司，水为去离子水。实验方法标准溶液的配制精密称取黄酮对照品1和2各2. Omg，分别置于25ml容量瓶中， 加入水溶解并定容至刻度，得各对照品溶液(0. 08mg/ml)。称取黄酮对照品1和2各2. Omg,混合置于5ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得混合标准样品。样品溶液的配制精密称取繁缕黄酮苷提取物干燥品50. Omg，加入5ml 30%甲醇水溶解，过滤，取1ml，移至IOml容量瓶中定容至刻度，得样品溶液(lmg/ml)。实验色谱条件柱温25°C，检测波长335nm，流速1. Oml/min。流动相为甲醇水= 35 65(水中加入0.01%乙酸)，501^ n，这样混合标准样品中成分基本不受杂质干扰。峰的归属以同样的流动相分析各对照品、混合标准样品及样品液，通过对照其保留时间来确定混合标准样品及样品液中各成分的相应峰位，结果见表1。表1.峰的归属
编号对照品(min)混合标准样品(min)品液(min)113. 9413. 7813. 92218. 9118. 6018. 88标准曲线精密称取黄酮对照品1和2各5. Omg,混合后用甲醇水溶解定容于5ml 容量瓶中为标准液。稀释成系列浓度作为代测液。在上述色谱条件下，取各待测液及标准液各20 μ 1依次进样，计算标准液和各待测液中各对照品的浓度，再分别计算出相应标准曲线。结果见表2 (X代表峰面积，Y代表进样浓度μ g/ml)。表2.对照品1、2的标准曲线
权利要求
1.繁缕黄酮苷提取物，其含有以提取物重量计18.69-28. 03 w/w %的芹菜素-6-C- β -D-半乳糖-8-C- α -L-阿拉伯糖苷和芹菜素-6_C_ α -L-阿拉伯糖-8-C-i3_D-半乳糖苷。
2.权利要求1的提取物，其中以提取物重量计含有9.64-14. 46W/W%的芹菜素-6-C- β -D-半乳糖-8-C- α -L-阿拉伯糖苷。
3.权利要求1的提取物，其中以提取物重量计含有9.05-13. 57w/w%的芹菜素-6-C- α -L-阿拉伯糖-8- C- β -D-半乳糖苷。
4.药物组合物，其含有如权利要求1所限定的繁缕黄酮苷提取物以及一种或多种药用载体或赋形剂。
5.权利要求1中所述的繁缕黄酮苷提取物的制备方法，其包括以下步骤i)将繁缕药材用含水醇提取两次，合并提取液； )浓缩除去醇，得到浓缩液；水溶解后离心，得到上清液；iii)将上清液进行大孔吸附树脂柱层析，依次用水和极性有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到本发明繁缕黄酮苷提取物。
6.权利要求5所述的方法，其中所用大孔吸附树脂为任何型号的弱极性大孔吸附树脂；提取所用的醇为任何低级链烷醇，其中醇的浓度范围为5% -85v/v%;大孔吸附树脂层析洗脱所用极性有机溶剂为大孔树脂允许使用的任何有机溶剂，其浓度范围为5% -95v/ v%。
7.权利要求5或6所述的方法，其中的醇选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇。
8.权利要求5或6所述的方法，其中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和丙酮。
9.权利要求1的提取物用于制备治疗降血脂药物的用途。
全文摘要
本发明涉及繁缕黄酮苷提取物，其含有以提取物重量计18.69-28.03 w/w％的芹菜素-6-C-β-D-半乳糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷和芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-半乳糖苷。本发明还涉及所述繁缕黄酮苷提取物的提取方法，含有该提取物的药物组合物及其用于制备降血脂药物的用途。
文档编号A61K31/7048GK102342951SQ20111015519
公开日2012年2月8日 申请日期2006年7月14日 优先权日2006年7月14日
发明者乔善义, 董琦, 黄元 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所