专利名称：一种吉马酮在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，更具体涉及一种吉马酮在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用。
背景技术：
流感病毒(influenza virus)是严重影响人类健康的，可引起流行性感冒的病原体。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。这三种不同型的病毒的基因组结构、多肽组成、感染性和致病性等方面都存在显著差异。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13. 6kb,分别编码10种结构蛋白(PB2、 PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NSl)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为16个H(H1-H16) 和9个N(m-N9)亚型。人流感病毒主要是HI、H2和H3亚型，而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7、和H9亚型，其中以H5W亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆发，且至今未在除人以外的其它动物中发现其存在。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。流感病毒是分节段负链RNA病毒，所以病毒RNA不具有感染性，各个RNA节段必须与RNA聚合酶 (PB2、PB1和PA)及核蛋白(NP)结合后形成vRWs才有活性。感染的起始是病毒颗粒表面的HA刺突识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的受体。唾液酸与次末端半乳糖的连接键，决定了病毒的宿主特异性，该连接键在禽类中为α 0-3)，在人类中为α (2-6) 0流感病毒HA 蛋白分子中，个别氨基酸的替换及不同的糖基化修饰能改变其受体结合的特异性。病毒吸附细胞后，细胞通过网格蛋白受体介导的胞饮作用摄入病毒。在细胞内，网格蛋白分子解离，病毒与内涵体融合形成吞噬体，使得病毒粒子周围的PH值下降至5. O左右。在此ρΗ条件下，病毒HA蛋白的构象发生变化，使位于轻链(撤幻N端的融合肽暴露，从而引起病毒囊膜与细胞膜融合。低PH环境也致使大量H+经由Μ2离子通道进入病毒粒子内部，导致Ml蛋白与VRWS的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的VRWS释放到被感染细胞的胞浆。与其它RNA病毒不同，流感病毒基因组的复制和转录均发生在宿主细胞的细胞核内。mRNA在核内合成后转移到胞浆，合成病毒的结构蛋白和非结构蛋白。而后开始装配子代病毒，神经氨酸酶可水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解为HAl和HA2多肽，这样的病毒粒子才具有感染性，从而开始新一轮病毒的复制。流感病毒在人类中已流行传播了 300多年，数年即有一次暴发流行，全球性的流感大流行则数十年暴发一次。流感流行每年可导致25万 50万例死亡，300万 500万重病例，全球约共有5 15%的人被感染。对于全球性流感大流行而言，“在流行期间中疫苗和抗病毒药物是降低发病率和死亡率最重要的应对措施”。但是目前全球每年可生产3亿人份三价流感疫苗-这仅够西方国家的流感预防之用，而不能满足全球性流感大流行的需求，而且由于流感病毒的抗原变异能力强，在新病毒株出现之前不可能研制疫苗。通常一个疫苗的大规模研发和制造至少需要六个月时间，即使到那时，由于全球生产能力有限及生产设施集中在发达国家，许多没有生产设施的国家在第1波流行期间将使用不到疫苗。所以当前疫苗能提供的保护率并不高。抗流感病毒药物不仅问世较晚，而且临床上速效、显效的治疗药物也较少，属于抗感染类药物中的小品种。目前，经美国食品和药物管理局(FDA) 批准正式上市的抗流感病毒药物有两类(1)以金刚烷胺和金刚乙胺为代表的M2离子通道阻断剂。此类药只对甲型流感病毒有预防和治疗作用，研究表明药物具有神经毒性等毒副作用，而且由于广泛使用使得耐药株普遍存在，所以CDC建议此类药物不再用于预防流感病毒感染。( 神经氨酸酶抑制剂，此类药的代表是奥斯他韦和扎拉米韦。此类药物对所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥斯他韦的耐药株确不断有报道。中药的有效组分为生物碱，黄酮类，挥发油，皂苷等，这些组分具有多种多样的药理活性，比如抑制病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、镇痛抗炎等综合功效，且毒副作用小，所以中药在防治流感方面具有独特的优势和广阔的发展前景。中药莪术为姜科姜黄属植物蓬莪术、广西莪术和温郁金的根茎。莪术具有行气，破血，消积，止痛的功效。可治疗治癥瘕积聚，血瘀经闭，跌打损伤，饮食积滞，脘腹胀痛。莪术挥发油中的主要成分有莪术醇、吉马酮和莪术二酮等，挥发油对小鼠 80有较强的抑制作用。莪术醇对人的宫颈癌有较好疗效。莪术挥发油还有抗炎、保肝作用，挥发油对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌有抑制作用。此外，文献报道吉马酮具有镇咳平喘等功效。但是目前文献报道中还没有出现吉马酮(Germacrone)在抗流感病毒方面的应用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种吉马酮在制备治疗或预防流感病毒(甲型或乙型)药物中的应用。吉马酮又称大栊牛儿酮、杜鹃酮，是吉马烷的衍生物。植物来源有姜科植物莪术的挥发油，杜鹃花科植物兴安杜鹃的叶，马兜铃科植物双叶细辛挥发油等多种植物。吉马酮在来源植物挥发油中的含量较高(20% 50%)，且具有多种活性，据文献报道吉马酮有抗菌抗炎、抗肿瘤、抗抑郁以及镇咳平喘等作用。吉马酮对A型流感病毒株抗病毒活性高，在50 μ M时抑制率达到88. 4% ；毒性小，在250 μ M吉马酮处理下，4 后 MDCK(马-达二氏犬肾细胞，流感病毒敏感细胞)存活率为100%，从而为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的天然产物。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案一种吉马酮在制备治疗或预防流感病毒(甲型或乙型)药物中的应用，其步骤是首先，通过MTT法检测了吉马酮对MDCK细胞的细胞毒性，结果显示在250 μ M浓度内，药物对细胞无毒性。其次，通过检测病毒感染细胞并给以药物处理4 后，分别检测了上清中释放出的病毒数量(基于病毒特异抗原神经氨酸酶和血凝素进行检测)，结果显示药物在1. 56 50 μ M浓度内，降低了释放到上清中的病毒数量，抑制率呈剂量依赖效应。我们还检测了药物对病毒蛋白表达的影响，结果同样显示吉马酮抑制了病毒蛋白的表达，同时也检测了药物对病毒核酸复制的影响，结果显示给以吉马酮处理后，病毒核酸的合成也明显被抑制。此外，通过病毒感染不同时间给药，初步分析了吉马酮抗病毒活性的机制，即检测了吉马酮在病毒单轮复制周期中发挥抗病毒活性的阶段，结果提示吉马酮抑制了病毒的吸附进入以及病毒复制的早期阶段，但是对病毒复制的晚期(病毒粒子的组装和释放) 没有活性或较弱活性。最后，我们检测了吉马酮抗流感病毒活性的广谱性，检测了吉马酮对 A型流感病毒H3N2亚型、A型流感病毒金刚烷胺耐药株和乙型流感病毒株的抗病毒活性，实验结果提示吉马酮对检测病毒株均有活性，且具有剂量依赖效应。综合实验结果分析，确定药物吉马酮可以用于预防和治疗流感病毒的感染。所述的吉马酮的给药剂量按照细胞实验用量为1. 56 50 μ Μ。所述的吉马酮制成抗流感病毒复方药物。所述的吉马酮单独制成抗流感病毒药物。所述的流感病毒为甲型或乙型流感病毒。所述的流感病毒还有丙型，丙型对人类影响较小。本发明通过神经氨酸酶活性抑制检测和血凝抑制实验(HI)对病毒感染并给以药物处理后分泌到细胞培养液中的病毒数量进行了检测，同时通过间接免疫荧光法(IFA)检测了细胞内病毒蛋白的表达，还通过半定量逆转录PCRGemi-quantitative RT-PCR)检测了病毒核酸的表达。结果显示吉马酮对病毒粒子的分泌，病毒蛋白的表达和病毒核酸的复制均有较好的抑制作用。通过在病毒感染不同时间给药检测了药物对病毒单轮复制周期不同环节的作用，结果显示吉马酮对病毒的吸附与入侵、病毒基因复制的早期均有抗病毒活性。实验结果表明该药物均有开发成抗流感病毒的有效药物而应用于临床，并且可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开放的广阔前景。利用现代常用药物制剂手段，可将吉马酮制成胶囊剂，颗粒剂，分散剂等，从而采用比较方便的口服给药形式。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1.吉马酮是一种天然来源小分子化合物，在1. 35 50 μ M浓度内无细胞毒性，其 CC5。在 250 μ M 以上。2.吉马酮剂量依赖地抑制流感病毒感染，其EC5tl为6μΜ。选择指数约为40。3.对Η3Ν2，B型流感病毒，和金刚烷胺耐药株均有抗流感病毒作用。4.可口服给药，使用方便。结果显示吉马酮对这三种病毒株均有抗病毒活性。具有镇咳、平喘等作用。具有开发成抗流感病毒药物的前景。5、不同浓度吉马酮对流感病毒复制抑制率如下所示
权利要求
1.一种吉马酮在制备治疗或预防甲型流感病毒药物中的应用。
2.一种吉马酮在制备治疗或预防乙型流感病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种吉马酮在制备治疗或预防流感病毒药物中的应用，首先检测了吉马酮对MDCK细胞的细胞毒性，结果显示CC50大于250um。其次，通过检测吉马酮对病毒三种抗原表达的影响和对病毒基因组复制的影响，结果显示吉马酮能剂量依赖地抑制病毒抗原的表达及病毒基因组复制。再次，初步研究了吉马酮抗病毒活性的机制。通过不同时间给药实验研究了吉马酮在流感病毒单轮复制周期中发挥抗病毒活性作用的阶段，结果提示吉马酮对病毒的吸附、进入及复制早期有抑制作用。此外，还检测了吉马酮对金刚烷胺耐药株、B型流感病毒株和A型流感病毒H3N2亚型株的抗病毒活性，结果显示吉马酮对这三种病毒株均有抗病毒活性。具有镇咳、平喘等作用。
文档编号A61P31/16GK102274206SQ20111016912
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者钱正旭, 陈绪林 申请人:中国科学院武汉病毒研究所