专利名称：提取羊胚胎提取物的方法及含有该提取物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物提取领域，特别地，涉及一种提取羊胚胎提取物的方法。此外，本发明还涉及一种包括上述羊胚胎提取物的药物组合物。
背景技术：
羊胚胎中含有多种具有延缓衰老，增强人体抵抗能力的物质如众所周知的羊胎素。人们对羊胎素的作用研究最深入，羊胎素中具有生物活性的成分能提高人体组织细胞的分裂速度，活化人体细胞，加速老化细胞的分解，有效改善人体内分泌，促使人体机能恢复最佳状态从而延缓衰老，增加皮肤的弹性使其细润具有光泽。羊胎素包括蛋白质、脂肪和糖类以及各种酵素、矿物质、氨基酸、维生素等。按常用方法提取的羊胎素中的大分子蛋白质易使得服用者增肥，不利于爱美女性长期服用。而羊胎素的上述效果强与弱又取决于所提取羊胎素的生物活性高低。现有的提取方法多为粉碎、离心、超滤，但离心时细胞液摩擦起热，其中具有生物活性的成分多易受热变性，因而所制得羊胎素的活性较低。其他方法还有液氮粉碎法(CN200910023809)等，这些专利的羊胎素提取率虽高但生物活性损失严重。
发明内容
本发明目的在于提供一种提取羊胚胎提取物的方法及含有该提取物的药物组合物，以解决羊胚胎提取物生物活性低提取率低的技术问题。为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种提取羊胚胎提取物的方法， 包括绞碎羊胚胎、冷冻、溶解、研磨以及离心步骤，然后将离心步骤得到的上清液过滤，获得羊胚胎提取物，在绞碎羊胚胎与冷冻步骤之间，还包括将绞碎羊胚胎步骤得到的羊胚胎碎片浸泡在水中的步骤；离心步骤中的离心时温度为-15 -10°C;上清液的过滤是指将上清液依次通过分子量为10万的超滤膜和分子量为1万的超滤膜。进一步地，将羊胚胎碎片浸泡在水中的步骤中，水与羊胚胎碎片的质量比
≥10 1进一步地，冷冻、溶解和研磨步骤依次进行为一循环，重复该循环3次，其中冷冻温度为-30°C。进一步地，研磨步骤是采用胶体磨研磨1 池。进一步地，羊胚胎为怀孕11 13周的羊胚胎。进一步地，羊胚胎为怀孕12周的羊胚胎。根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述一种含羊胚胎提取物的药物组合物，药物组合物由按上述方法提取的羊胚胎提取物和胸腺肽按质量比0. 8 1. 2 0. 8 1. 2组成。本发明具有以下有益效果本发明提供的提取方法，在-10°C下离心提取上清液，能有效保持羊胚胎提取物的生物活性。之后依次采用分子量为10万分子量和1万分子量的超滤膜进行过滤，在保留具有生物活性物质的同时，除去易至肥胖的蛋白质，使得该提取物只具有美容功效而不至增肥。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施例方式以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。经发明人反复试验发现，怀孕11 13周的羊胚胎中，对人体有益的物质的含量达到峰值，按此方法提取的提取率和提取物的生物活性均较优，优选为怀孕12周的羊胚胎。 洗净后采用常用食物绞碎机对其进行初步破碎，绞碎1 池，将羊胚胎绞碎至糊状。并加入所处理羊胚胎重量10倍以上的蒸馏水浸泡，使细胞吸足水分，处于膨胀状态，后续研磨时细胞能破碎均勻，充分保护其中活性物质。优选的加水量为所处理羊胚胎重量10倍。此时效果最优。本文提到的蒸馏水为医用级蒸馏水。置于-30°C下冷冻21 22h，羊胚胎细胞位置迅速固定，细胞破裂少细胞液流失少。21 2 后羊胚胎完全冻住。此时可在室温下融解，后采用胶体磨进行研磨。显然的为了缩短等待融解的时间，并进一步提供羊胚胎的破碎程度，此时也可将冻住的羊胚胎在常温下破碎10 20min，此时的破碎能加速融解并进一步绞碎羊胚胎以增强其流动性，便于在胶体磨中研磨。用胶体磨研磨也是在常温下进行，羊胚胎进一步融解，此时研磨对细胞的破碎效果优于未经速冻直接研磨的羊胚胎。优选胶体磨研磨时间为1 池，此条件下效果最优。为充分破碎细胞，以依次进行的冷冻、溶解、破碎和研磨为一个循环，重复上述循环 3次，重复3次后可达到镜检无完整细胞结构，此时活性物质均已溶于蒸馏水中。为使活性物质充分溶出，加入所处理羊胚胎重量1倍的蒸馏水离心，整个离心过程中溶液温度为-15 -10°C下。在此条件下离心能防止由于液体升温导致提取物中活性物质失活。取离心后的上层清液采用10万分子量的超滤膜进行过滤，进行初步除杂。之后还需采用1万分子量的超滤膜进行过滤，此时能将提取物中，大分子蛋白质除去，防止将提取物制成保健品后，长期服用产生增肥的作用。而分子量小于1万的活性物质，具有抗衰老作用，可得到保留。所得提取物置于-10°C下保存，以抑制其中分解酶的活性。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物由羊胚胎提取物和胸腺肽组成， 其中羊胚胎提取物为按上述方法制得。胸腺肽则按常规方法制得或可为市售。显然的，当胸腺肽为的治疗效果更优，尤其是使用年龄小于6个月的乳牛进行提取时。羊胚胎提取物和胸腺肽按质量比0. 8 1. 2 0. 8 1. 2混合，其中1 1混合时效果最优。羊胚胎提取物可促进细胞分裂，活化衰老细胞，恢复衰退器官的活力，起到延缓衰老等美容功效。而胸腺肽具有调节、增强人体细胞免疫功能的作用，能促使被有丝分裂原激活的外周血中的T淋巴细胞成熟，增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原中的分泌，增加T 细胞上淋巴因子受体的水平。同时它通过对T4辅助细胞的激活作用来增强淋巴细胞的反应。通过两者配合使用该药物组合物的抗衰老、增强免疫、增强皮肤弹性的作用得到加强。该组合物为名为姬灵口服液的保健产品。该药物组合物采用福林酚法进行多肽含量的测定。实施例以下实施例中所用药品及仪器均为市售。1)取怀孕12周的羊胚胎，绞碎1 池，加入羊胚胎10倍量的蒸馏水，浸泡Ih ；2)置于-30°C下21 22h，在常温下破碎10 20min后用胶体磨研磨1 2h ；3)重复步骤2) 3次；4)加入羊胚胎1倍量的蒸馏水离心，离心时温度为-10°C ；5)取上清液在10万分子量下超滤，再用1万分子量超滤，得到羊胚胎提取物1。经常规HCPL(高效液相色谱)测定方法检测，羊胚胎提取物1能量仅为 8. 4kcal/100ml，其中含有占提取物总重量2%的羊细胞精华、3. 06%的蛋白质(NX6. 25)、 0. 489%的各类氨基酸、2%的矿物质，且不含碳水化合物。该提取物能量低长期服用不易长胖。对比例对比例与实施例的区别为在绞碎羊胚胎与冷冻步骤之间未加水浸泡，羊胚胎研磨后在常温下离心，且并未采用超滤膜进行过滤。其它步骤及参数与实施例相同。得到羊胚胎提取物2。羊胚胎提取物E-玫瑰花环试验一、试剂1、HanK，S液取氯化钠80. 0克，氯化钾4. 0克，磷酸氢二钠(Na2HPO4. Iffl2O) 1. 2 克，磷酸二氢钾(KH2PO4)O. 6克及葡萄糖10. 0克，加注射用水1000毫升溶解后，分装至小瓶中，与115°C灭菌15分钟后，置冰箱中保存。临用前，加纯化水稀释10倍，用2. 8%的碳酸氢钠溶液调节PH值至7. 2 ；每1000毫升稀释液加酚红溶液[取酚红1克，加氢氧化钠液(0. lmol/L)28毫升研磨使溶解，再加纯化水至100毫升]2毫升，即得。2、磷酸盐缓冲液(PH7. 2)取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H20) 19. 33克，磷酸二氢钾 2. 85克，氯化钠8. 5克，加纯化水溶解并稀释至1000毫升，即得。3、血液保养液取枸橼酸钠1. 33克，枸橼酸0. 47克，葡萄糖3. 0克，加注射用水溶解并稀释至100毫升，即得。4、淋巴细胞分离液(生化试剂，上海试剂二厂)。5、20%甲醛固定液取甲醛20毫升，加磷酸盐缓冲液(PH7. 2)稀释至100毫升，即得。6、瑞氏染色液取瑞氏染粉0. 1克，加少量甘油在研钵中研磨，最后加甲醇至60毫升使溶解，摇勻，密封备用。7、肝素溶液取肝素适量，加纯化水配成每1毫升中含300单位，每管加0. 1毫升。 50°C干燥(可抗凝血液2毫升)。8、绵羊红血球取绵羊血用玻璃珠去纤维，加灯亮血液保养液，置冰箱内可保存二周，临用前吸取血球保养液中的绵羊红血球，用适量Hank’ S液离心洗三次，每次离心 (3000转/分)10分钟，加Hank’ S液稀释并计数，使每1毫升溶液中约含1 X IO8个红细胞，
二、供试品溶液的制备分别取羊胚胎提取物1、羊胚胎提取物2和蒸馏水各1克， 加Hank’S液anl，即得。羊胚胎提取物1和羊胚胎提取物2的供试品为实验组。蒸馏水的供试品为空白对照组。三、测定法1、淋巴细胞的分离与悬液的制备取淋巴细胞分离液3毫升，置离心管中，然后加入肝素抗凝人血4毫升，再加入Hank’ S液2毫升，是保持有明心的界面，离心(2000转/ 分)20分钟，取出离心管，可见分为五层，弃去第一层上清液，吸取第二层白色淋巴细胞悬液(注意力求吸净)，加Hank’ S液洗涤2-3次，每次离心(1500转/分)5分钟，弃去上清液，加Hank’ S液约10毫升，用吸管搅勻，置血球计数板上计数，最后以Hank’ S液稀释成每 1毫升中含约1XIO6个淋巴细胞的溶液，备用。2、E-花环形成实验取小试管10支，其中5支各加Hank’ S液0. 1毫升作对照管，另5支各加供试品溶液0. 1毫升作测定管，每管各加淋巴细胞液0. 2毫升，用吸管搅勻，置37°C水浴中活化90 分钟，离心(1000转/分)5分钟，弃去上清液，加新鲜配置的1 %绵羊红血球悬液0. 2毫升， 摇勻，离心(500转/分)5分钟，放入冰箱过夜。次日取出，弃去上清液，每管加入固定液一滴，请轻摇勻，与4°C静置15分钟，混勻，取一小滴，涂片，待干后用瑞氏液染色，纯化水洗干后，油镜或高倍镜检计数，计算200 个淋巴细胞，凡淋巴细胞表面粘附3个以上绵羊红血球者，即计数为玫瑰花结形成细胞，并计算形成玫瑰花结的淋巴细胞总数的百分率，求出各组的平均值。用各实验组的该平均值分别减去对照空白组的该平均值。结果列于表1中。表1 E玫瑰花环试验结果
权利要求
1.一种提取羊胚胎提取物的方法，包括绞碎羊胚胎、冷冻、融解、研磨以及离心步骤， 然后将所述离心步骤得到的上清液过滤，获得羊胚胎提取物，其特征在于，在所述绞碎羊胚胎与所述冷冻步骤之间，还包括将所述绞碎羊胚胎步骤得到的羊胚胎碎片浸泡在水中的步骤；所述离心步骤中的离心时温度为-15 -10°c ；所述上清液的过滤是指将上清液依次通过分子量为10万的超滤膜和分子量为1万的超滤膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将羊胚胎碎片浸泡在水中的步骤中， 所述水与羊胚胎碎片的质量比> 10 1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷冻、融解和研磨步骤顺序进行一次为一次循环，重复所述循环3次，其中所述冷冻温度为-30°C。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述研磨步骤是采用胶体磨研磨1 池。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述羊胚胎为怀孕11 13周的羊胚胎。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羊胚胎为怀孕12周的羊胚胎。
7.一种含羊胚胎提取物的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由按权利要求 1 6中任一所述方法提取的羊胚胎提取物和胸腺肽按质量比0. 8 1. 2 0. 8 1. 2组成。
全文摘要
本发明提供了一种提取羊胚胎提取物的方法及含有该提取物的药物组合物，其中提取羊胚胎提取物的方法包括绞碎羊胚胎、冷冻、溶解、研磨以及离心步骤，然后将离心步骤得到的上清液过滤，获得羊胚胎提取物，在绞碎羊胚胎与冷冻步骤之间，还包括将绞碎羊胚胎步骤得到的羊胚胎碎片浸泡在水中的步骤；离心步骤中的离心温度控制在-15～-10℃的范围；上清液的过滤是指将上清液依次通过分子量为10万的超滤膜和分子量为1万的超滤膜。本发明提供的羊胚胎中具有生物活性物质的提取方法，在-10℃下离心提取上清液，能有效保持提取物的生物活性。之后依次采用分子量为10万分子量和1万分子量的超滤膜进行过滤，在保留具有生物活性物质的同时，除去易至肥胖的蛋白质，使得该提取物只具有美容功效而不至增肥。
文档编号A61K38/17GK102274241SQ20111022856
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者周伟 申请人:周伟