专利名称：Plga新城疫dna疫苗纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及新城疫DNA疫苗的制备方法。
背景技术：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、致死性传染病，常呈败血症，是危害养禽业的最重要传染病之一，被国际兽医局定为I类传染病。控制ND最根本的措施是进行有效的疫苗接种，目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和灭活疫苗，但二者在实际应用中均存在一定的局限性。ND油乳剂灭活疫苗通过注射免疫鸡体后可产生较高水平的血液循环抗体，但在抵抗呼吸道和消化道病原感染的黏膜系统中却有局限性，很难阻止病原通过黏膜组织侵入动物体内，且对已经进入细胞的病毒很难发挥作用；ND弱毒活疫苗虽然可以产生一定的黏膜免疫和体液免疫，但受免疫方法和途径影响，产生的循环抗体较低，维持期短。饮水免疫很容易造成疫苗被消化道降解，导致疫苗吸收效率低；滴鼻点眼也只能使疫苗在鼻腔内存在 15min，致使疫苗不能有效进入机体激发有效的黏膜免疫；气雾免疫产生的黏膜免疫效果较好，但容易诱导慢性呼吸道疫病，且弱毒苗均不能产生较高的血清抗体等。DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA疫苗大动物实验、 人体临床实验结果表明DNA疫苗存在着给药剂量较大，生物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了 DNA疫苗的研究进展。因此，如何提高新城疫疫苗的免疫效果，研制出既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部黏膜免疫的新型疫苗已成为ND疫苗研究的焦点。近年来随着新型材料学和制剂新技术的发展，迫切需要一种新的和改进的疫苗递送方法以降低传染病的死亡率。目前，制备载疫苗抗原纳米粒所采用的载体材料主要有天然高分子聚合物壳聚糖、明胶，合成聚合物PLA、PLGA等。目前，国外DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速，取得了不少阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少，尤其是新城疫DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。
发明内容
本发明提供了 PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法。本发明PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒按以下步骤制备一、称取40mg的聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于ImL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入200 μ g新城疫病毒F48E9株的F基因DNA质粒，冰浴条件下超声乳化30s，得初乳液，然后加入2mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，在冰浴条件下超声乳化60s，得复乳液；二、将复乳液逐滴加入到IOmL质量浓度为0. 5%的聚乙烯醇中进行纳米粒固化并挥发多余的二氯甲烷，以500r/min勻速搅拌证，得固化液；
三、取3000g固化液4°C离心15min，收集纳米粒，然后用ddH20洗涤3次，经真空冷冻干燥后即得PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒F48E9株的F基因 DNA质粒的浓度为0. 5% ；步骤一中超声乳化的功率均为50w。本发明PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒具有巨大的应用潜力，本发明PLGA新城疫 DNA疫苗纳米粒递送系统对新城疫DNA疫苗具有保护作用，提高细胞转运效率，提高免疫效果，可肌注、点眼，也可口服，诱导黏膜免疫等特点。同时，在保证药物作用的前提下，减少了给药剂量、减轻或避免了毒副反应、可延长免疫保护期，避免了多次反复给药，且载体材料 PLGA本身无毒，生物相容性好，可生物降解，因而是一种具有广阔应用前景的新型载体疫苗。本发明为新城疫DNA疫苗在临床上广泛应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递药系统，将促进新城疫DNA疫苗在家禽养殖的实际应用；在此基础上可将该研究成果应用到更多的动物疫苗和药物体系中，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患，将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨大的。经透射电子显微镜观察本发明制备的pDNA-PLGA-NPs形态完整呈圆球形，表面光滑，分散性较好，无明显的粘连、塌陷等现象，粒径为^^；士了；化！！！，粒径分散度为0. 41。Zeta电位分析本发明制备的pDNA_PLGA_NPs的kta电位为+2. 7mV,包封率为 (91. 8士0. 3) %。本发明制备的pDNA-PLGA-NPs黏膜免疫比肌肉注射更能活跃地激活黏膜免疫应答部位，产生高水平的特异性IgG和IgA，说明纳米粒黏膜免疫递送系统不仅在黏膜局部产生免疫应答，还可引起全身性的体液免疫应答和细胞免疫应答；同时克服了常规疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且用本发明方法所制备处的NDV-CS-NPs易于保存， 稳定性高、包封率高、毒性小、药物生物利用度高、成本低、易于工业化生产。使用本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率(包封率为91. 8士0.3% )，可以保持体内最佳的药物浓度，体外释放试验结果在前两天质粒释放速度很快，质粒释放量占总包裹量的31. 25% ；在第2d到第IOd间， pDNA-PLGA-NPs中的质粒DNA每天的释放量达到包裹总量的4. 53%;在第IOd以后，是质粒 DNA释放的后期，到第16d质粒DNA的释放达到93. 14%。因此，本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒可实现药物的缓释。本发明方法具有工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了 DNA疫苗的活性等优点，试验筛选的pDNA-PLGA-NPs的制备方法也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。本发明pDNA-PLGA-NPs可用于鸡新城疫免疫，经口服给药，给药量为200 μ g质粒 DNA。
图1是具体实施方式
一中PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的透射电子显微镜观察图；图2是具体实施方式
一中PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的粒径分布图；图3是具体实施方式
一中PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的kta电位图；图4是具体实施方式
一中PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的体外释放曲线图；图5是具体实施方式
一中PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒抗DNase I降解的电泳图， 1泳道为Markers，2泳道为未被包裹的裸DNA，3-6泳道为pDNA-PLGA-NPs所包裹的DNA ；
图6是具体实施方式
一中Western-blotting检测目的蛋白的表达的电泳图，1泳道为Markers，2泳道为转染后处理的pDNA-PLGA_NPs，3泳道为质粒pVAXl_F (ο)，4泳道为空白纳米粒，5泳道为未转染的BHK细胞。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒按以下步骤制备一、称取40mg的聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于ImL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入200 μ g新城疫病毒F48E9株的F基因DNA质粒，冰浴条件下超声乳化30s，得初乳液，然后加入2mL质量浓度为2%的聚乙烯醇，在冰浴条件下超声乳化60s，得复乳液；二、将复乳液逐滴加入到IOmL质量浓度为0. 5%的聚乙烯醇中进行纳米粒固化并挥发多余的二氯甲烷，以500r/min勻速搅拌证，得固化液；三、取3000g固化液4°C离心15min，收集纳米粒，然后用ddH20洗涤3次，经真空冷冻干燥后即得PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒F48E9株的F基因 DNA质粒的浓度为0. 5% ；步骤一中超声乳化的功率均为50w。本实施方式步骤一中新城疫病毒F48E9株的F基因DNA质粒的制备与纯化是按如下步骤进行用限制性内切酶EcoR V和)(ba I将新城疫病毒F48E9株的F基因真核表达质 SpVAXl-F(o)进行双酶切，将阳性质粒转化到E. coli.感受态细胞DH5a中，过夜培养12h 后，随机挑取单菌落，接种于LB液体培养基(含Kana抗性)中，37°C空气浴摇床培养16h， 以备大提质粒用。采用碱裂解法大量提取质粒DNA，质粒的大量提取和纯化参见《Molecular Cloning =A Laboratory Manual (3rd ed)》质粒DNA大量制备的SDS碱裂解法和聚乙二醇 (PEG8000)纯化方法，并进行适当改进。真核表达质粒pVAXl-F(o)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室构建和保存。碱裂解法大量提取质粒DNA具体步骤如下1)挑取生长于LB平板上的单个菌落接种于5mL液体LB培养基(含Kana，100 μ g/ mL)中，37 °C振荡培养过夜到对数晚期OD6tltl值为0. 6 ；2)按1/1000的比例将细菌培养物转接到IOOOmL LB液体培养基中，37°C、300r/ min震荡培养16h，留ImL菌液用于小提质粒鉴定；3)将菌液4°C、6000r/min离心8min，细菌沉淀用300mL预冷的STE振荡重悬，4°C、 6000r/min 再次离心 8min ；4)将洗过的细菌沉淀物重悬于IOOmL溶液I中，剧烈振荡，加入0. 05g溶菌酶粉末，轻轻混勻，放入37°C水浴锅中温浴；5)加入IOOmL新鲜配制的溶液II (现用现配)，反复轻轻颠倒混勻，室温作用 8min。此时拿出的溶液澄清；6)加入IOOmL冰预冷的溶液III，温和振荡数次，使溶液III分散均勻，此时可看到有白色沉淀析出，冰上静置30min，4°C、9000r/min离心30min ；7)用4-6层纱布将离心后的上清过滤至另一个离心瓶中，加入0. 6倍体积的异丙醇，混勻充分，室温放置lOmin，22°C、9000r/min离心30min ；
8)弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀和管壁，干燥后用IOmL TE (pH8. 0)溶解；(可4°C 过夜)9)将溶有粗DNA的TE溶液转入另一离心管中，加入IOmL (与TE等体积)冰预冷的5mol/L的LiCl，充分混勻，4°C、10000r/min离心15min ；(去除高分子RNA和杂蛋白)10)将上清转移至另一管中，再加入等体积的异丙醇，充分混勻，室温静置15min， 22°C、10000r/min 离心 15min ；11)弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀和管壁，待沉淀干燥后用IOmL TER (RNase浓度为25mg/mL)溶解；(消化污染的小RNA，可4°C过夜)12)加入等体积PEG-NaCl，混勻，4°C、10000r/min离心15min ；(沉淀出大分子质粒DNA，使小分子量DNA和RNA留在上清中)13)弃上清，用IOmLTE溶解质粒DNA ；14)加等量的酚、酚/氯仿/异戊醇05/M/1)、氯仿各抽提一次，22°C、10000r/ min离心15min ；(除去蛋白)15)轻轻吸取上层水相溶液至另一离心管中，加入1/10体积的3mol/L pH5. 2 NaAC，再加2. 5倍体积的冰预冷的无水乙醇沉淀DNA 2h以上或过夜；16)4°CU0000r/min离心30min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，离心弃上清；17)在超净台中通风干燥后，用ImL TE (pH8. 0)溶解DNA沉淀；18)用TE稀释到适当浓度后测OD26tl并计算质粒DNA浓度；在EP管上标记好浓度和日期后放-20°C保存原液。本实施方式方法制备的PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒(简称pDNA_PLGA-NPs) 在-20。C条件下保存3个月，然后透射电镜观察(如图1所示)，形态完整呈圆球形，表面光滑，分散性较好，无明显的粘连、塌陷等现象，粒径为G33. 5士7. 5)nm(如图2所示)，粒径分散度为0. 41。Zeta电位分析本发明制备的pDNA-PLGA-NPs的Zeta电位为+2. 7mV(如图3 所示)。本实施方式制备的PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒，包封率测定，在制备纳米粒前，将质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，经与DNA标准分子Marker比较准确测定新城疫DNA疫苗质粒含量，此为投入的总药量。吸取50 μ L纳米粒固化后的离心上清液，经琼脂糖凝胶电泳测定上清中的DNA含量，确定未包裹进纳米粒的质粒DNA含量。PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的包封率的计算公式如下总DNA含量(μ g) = DNA浓度X体积未包裹的DNA含量(μ g)=上清中DNA浓度X体积包封率(％ )=(总DNA含量-未包裹的DNA含量)/总DNA含量X 100 %本实施方式制备的pDNA-PLGA-NPs的包封率平均为91. 8士0. 3%。本实施方式制备的DNA疫苗纳米粒在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，体外释放试验结果(如图4所示)表明，在前两天质粒释放速度很快，质粒释放量占总包裹量的31. 25% ；在第2d到第IOd间，pDNA-PLGA-NPs 中的质粒DNA每天的释放量达到包裹总量的4. 53% ；在第IOd以后，是质粒DNA释放的后期，到第16d质粒DNA的释放达到93. 14%。因此，本实施方式制备的DNA疫苗纳米粒可实现药物的缓释。
本实施方式通过1 %琼脂糖凝胶电泳检测PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒抗DNase I 降解，结果是未被包裹的裸DNA经DNase I作用30min后即被完全降解，而pDNA-PLGA_NPs 所包裹的DNA即使作用时间长至池也能保持其完整性，说明纳米粒的包裹能抵抗DNase I 的降解，起到了保护作用(如图5所示)。通过间接免疫荧光试验和flfestern-blotting检测pDNA-PLGA-NPs体外表达(1) pDNA-PLGA-NPs 的脂质体转染将单层BHK细胞用胰酶消化下来后，以适当密度接种于六孔细胞培养板内，37°C、 5% CO2培养至70% -80%状态。此时吸去培养液，用不含抗生素和血清的新鲜DMEM培养基洗涤细胞，洗2遍，待用。将纳米粒中的质粒DNA提取出来，以质粒DNA pVAXl-F(o)作为阳性质粒分别在脂质体LipOfectamineTM2000介导下转染BHK细胞。具体操作步骤按照说明书进行。取4. 0 μ g质粒加入300 μ L不含血清和抗生素优化的DMEM，此为A液；将10 μ L脂质体加入到另一装有300 μ L优化DMEM的EP管中，此为B液；A、B液分别静置2_;3min后， 将A、B液轻轻混合，室温静置30min (不可超过45min，否则脂质体会对质粒有毒害作用)。 将混合液加入到之前准备好的细胞培养孔中，前后左右轻轻晃动混勻，于37°C、5 % CO2培养证后，弃去培养物，换成含GIBCO血清和适量抗生素的DMEM维持培养基，继续培养。同时，以空白纳米粒和空白细胞作为阴性对照。再采用间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。具体操作步骤如下1)将转染后培养72h的细胞培养液弃掉，用PBS缓冲液(pH 7. 4)洗涤2次，每次轻轻晃动5min ；2)用中性甲醛固定IOmin后再用PBS洗3次；3)加入ImL 1/100稀释的NDV阳性血清，37°C作用lh，PBS洗涤3次，每次5min ；4)加入FITC标记的二抗(1/5000稀释)37°C继续作用lh， 再用PBS洗涤三次每次5min力)加入适量甘油-水(1/9)，荧光显微镜下观察目的蛋白表达情况。试验结果是从pDNA-PLGA-NPs中提取出的质粒DNA和阳性质粒pVAXl-optiF均能观察到特异性荧光，转染的空白纳米粒和未转染的细胞均没有检测到荧光。(2) Western-blotting检测目的蛋白的表达BHK细胞转染后72h，收集细胞，用PBS洗涤1次，在细胞沉淀中加入适量 2 X SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴煮沸8min，进行SDS-PAGE分离蛋白。试验结果是转染后处理的pDNA-PLGA-NPs和质粒pVAXl-F(o)都能检测到相同大小的蛋白，与预期结果一致， 蛋白分子大小约为58kDa ；而空白纳米粒和未转染的BHK细胞均没有检测到目的蛋白的表达(如图6所示)。用CCK-8试剂盒(购自Dojindo公司)测定本实施方式制备的pDNA-PLGA-NPs递送系统的安全性评价将BHK细胞用含血清的DMEM培养基稀释成2 X IO6个/mL细胞悬液， 以每孔100 μ L的量加入到96孔培养板中，37°C培养证；之后，向每孔加入被DMEM培养基稀释过的pDNA-PLGA-NPs，37°C>5% CO2继续培养过夜，第2d向每孔加10 μ L CCK-8试剂培养证；最后于450nm波长条件下测定各孔的吸光值，计算细胞存活率(％ )。细胞存活率(％) = [ (As-Ab) / (Ac-Ab) ] X100%As 试验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、纳米粒混悬液)Ab 对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8)Ac 空白孔(不含细胞和纳米粒混悬液的培养基、CCK-8)实验结果测得细胞的存活率为(80. 14士8. 27) %，表明制备的pDNA-PLGA-NPs的细胞毒性较小，构建的新城疫DNA疫苗PLGA纳米粒黏膜免疫递送系统具有较高的安全性。通过SPF鸡免疫接种试验，检测本实施方式制备的pDNA-PLGA-NPs的免疫效果。检测步骤如下将2周龄SPF鸡随机分为7组，每组25只。分组情况见表1。其中，裸DNA pVAXl-F(o)质粒含量为200 μ g，根据包封率的换算使载DNA纳米粒组免疫的质粒DNA含量也为200μ g。肌肉注射组采用股四头肌多点注射；一免后两周以后以相同的剂量加强免疫，第7组首免采用滴鼻免疫法，加强免疫时用相同的剂量进行肌肉注射。分别于一免后第 13d和第27d，每组各取3只鸡剖杀，取脾做淋巴细胞增殖试验。整个免疫效果的考察持续监测到一免后第49d。表1免疫分组
权利要求
1.PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒按以下步骤制备一、称取40mg的PLGA溶于ImL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入200μ g新城疫病毒 F48E9株的F基因DNA质粒，冰浴条件下超声乳化30s，得初乳液，然后加入2mL质量浓度为 2%的聚乙烯醇，在冰浴条件下超声乳化60s，得复乳液；二、将复乳液逐滴加入到IOmL质量浓度为0.5%的聚乙烯醇中进行纳米粒固化并挥发多余的二氯甲烷，以500r/min勻速搅拌证，得固化液；三、取3000g固化液4°C离心15min，收集纳米粒，然后用ddH20洗涤3次，经真空冷冻干燥后即得PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒F48E9株的F基因DNA 质粒的浓度为0. 5% ；步骤一中超声乳化的功率均为50w。
2.根据权利要求1所述的PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中PLGA分子量为40000 75000，LA/GA = 50/50，特异性粘度为0. 37dL/g。
全文摘要
PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法，它涉及新城疫DNA疫苗的制备方法。方法一、PLGA溶于二氯甲烷中，加新城疫病毒F48E9株的F基因DNA质粒，乳化后加聚乙烯醇，再乳化得复乳液；二、将复乳液逐滴加入到聚乙烯醇中进行纳米粒固化并挥发多余的二氯甲烷，搅拌得固化液；三、固化液离心，收集纳米粒并洗涤3次，经真空冷冻干燥后即得PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒。本发明PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒递送系统对新城疫DNA疫苗具有保护作用，提高细胞转运效率，提高免疫效果，可肌注、点眼，也可口服，诱导黏膜免疫等特点，可用于鸡新城疫免疫，而且纳米粒易于保存，稳定性高、包封率高、毒性小、药物生物利用度高。
文档编号A61J3/00GK102327623SQ20111028186
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者赵凯 申请人:黑龙江大学