专利名称：一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物兽药技术领域，涉及ー种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗。
背景技术：
鸡球虫病是ー种严重危害养鸡业生产发展的寄生原虫病，毎年因此而导致的经济损失高达20亿英镑以上。随着鸡球虫抗药性和药物残留问题的日趋严重，人们期待用更理想的方法代替抗球虫药的使用。然而球虫活疫苗的成功研制和应用提供了ー种可代替药物控制鸡球虫病的技术手段，但却存在成本高、难保存、散毒及潜在的致病威胁等缺点。因此随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显示出在未来畜禽疫病控制中的诱人前景，它与传统疫苗相比，具有成本低、稳定、便于贮藏和运输、安全性高、在体内維持时间长、制备简单等优点。国内外ー些学者已经构建了一些鸡球虫DNA疫苗，但多集中在单价疫苗的研究上，关于多价DNA疫苗的研究未见报道。能够感染鸡的球虫公认的有7种，危害较大的有4种，分别是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、毒害艾美耳球虫(E. necatrix)、巨型艾美耳球虫(E. maxima)和堆型艾美耳球虫(E. acervulina),在临床上,这4种球虫多为混合感染，给养鸡业 带来了巨大的危害，因此，研制能够同时抵抗4种球虫混合感染的多价DNA疫苗显得尤为重要。同时随着分子生物学及免疫学技术的日益成熟，抗原分子表位的研究成了近年来新的发展趋势。研究表明，T细胞免疫应答反应在抗球虫免疫应答中处于核心地位，因而选择鸡球虫能够编码集中的T细胞表位的多种基因片段串联起来，将其构建成球虫多表位DNA疫苗，这样既増加了 T细胞表位的浓度和密度，又增强了重组抗原的反应范围。因此本试验诣在构建出抗球虫混合感染的多价多表位DNA疫苗。IL-2是细胞介导免疫中的ー种重要的细胞因子，具有广谱的免疫增强作用，它能促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的分化増殖，维持T细胞生长，促进NK细胞和B细胞功能。许多研究表明，IL-2与球虫基因联合插入到DNA疫苗载体中所构建的免疫调节型DNA疫苗，产生的免疫保护效果要明显优于单独构建的DNA疫苗。本发明运用DNAstar软件，对E. tenella的TA4、5401、pEtK2和mic4抗原基因，E. necatrix 的 NA4 抗原基因，E. maxima 的 EMCDPK 抗原基因和 E. acervulina 的 LDH和 3-1E抗原基因的抗原表位进行分析，每个基因选取I到2段T细胞表位比较集中的序列进行动物保护试验，筛选出免疫保护效果最好的抗原T细胞表位，并将这4种球虫的T细胞表位同时克隆到同一 DNA疫苗载体pVAXl中，同时串联具有免疫调节作用的chIL-2作为基因佐齐U，构建出能够抵抗4种球虫混合感染的免疫调节型多价多表位DNA疫苗，并进行免疫保护性试验，检测其对临床上危害最为严重的4种球虫的抵抗力，以期为该疫苗在临床上的应用提供參考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够预防多种鸡球虫混合感染的免疫调节型多价多表位的DNA疫苗。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种鸡艾美耳球虫(Eimeria spp)多价多表位DNA疫苗，该疫苗包含其中插入T 细胞表位集中的 4 个基因片段NA4-1 (E. necatrix)、TA4-1 (E. tenella)、EMCDPK-1 (Ε·maxima)以及 LDH-2 (E. acervulina)，NA4-1、TA4-1、LDH-2、EMCDPK_1 核苷酸序列分别为 SEQID NO.1的第1-312个喊基，第319-645个喊基，第652-984个喊基，第991-1299个喊基。所述的4个基因片段NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1和LDH-2通过连接成融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1的形式插入真核表达载体中，该融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1 序列如 SEQ ID NO. 40 所示。一种鸡艾美耳球虫多价多表位DNA疫苗，包含真核表达载体以及其中插入的T细胞表位集中的4个基因片段序列为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基所示的NA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第319-645个碱基所示的TA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第652-984个碱基所示的LDH-2以及序列为SEQ ID NO.1的第991-1299个碱基所示的EMCDPK-1 ;以及序列为SEQ ID NO.1的第1309-1740个碱基所示的鸡白介素_2基因chIL_2。所述的NA4-1、TA4-1、EMCDPK-1、LDH-2 和 chIL_2 连接在一起形成序列为 SEQ IDNO.1所示的的融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-1L-2，插入到真核表达载体pVAXl中组成免疫调节型多价多表位DNA疫苗pV AXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2，质粒谱图见图1。该DNA疫苗可以在制备预防和/或治疗鸡球虫病的药物制剂中的应用。本发明建立在本实验室下列发现之上含有E. tenella、E. necatrix、Ε· maxima子孢子阶段抗原基因TA4、NA4、EMCDPK和在E. acervulina不同发育阶段(卵囊，子孢子，裂殖体，裂殖子)均有表达的抗原基因LDH的真核质粒载体能够为鸡提供针对艾美耳球虫的有效免疫保护；将chIL-2基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。生产本发明鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗的方法，简而言之，其技术路线如下1.多价多表位DNA疫苗的4种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选运用DNAstar软件对E. tenella的TA4(李祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号ZL 200510124048. 4)、5401(黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAXl.O-5401-1FN-Y的研究.南京农业大学硕士论文，2006)、pEtK2 (谢昆等.柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析.中国兽医科学，2007，37 (03) =200-204)和mic4(陈益.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA-1L-2-mic4的研究.南京农业大学硕士论文，2005)抗原基因，E. necatrix的NA4 (李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号ZL200810155080. 2)抗原基因，E. maxima 的 EMCDPK(Mohammed Ali A. Shah. Researchon the Mult1-epitopes DNA Vaccines against Chicken Coccidiosis.南京农业大学博士学位论文，2010)抗原基因和E. acervulina的LDH(宋鸿雁.堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究.南京农业大学博士学位论文，2010)和3-1E (周婷婷.五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较.南京农业大学硕士学位论文，2008)抗原基因的抗原表位进行分析，每个基因选取I到2段T细胞表位比较集中的序列通过动物保护试验，筛选出免疫保护效果最好的抗原T细胞表位NA4-1 (E. necatrix)、TA4-1 (E. tenella)、EMCDPK-1 (E. maxima)以及 LDH-2 (e. acervulina)。2.免疫调节型多价多表位 DNA 疫苗 pVAXl-TA4-l-NA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的构建。3.免疫调节型多价多表位 DNA 疫苗 p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1 -1L-2 在鸡体内转录与翻译情况检测4.免疫调节型多价多表位 DNA 疫苗 pVAXl-TA4-l-NA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的免疫保护性检测本发明具有以下优点和效果1.该疫苗是DNA疫苗，与传统疫苗相比，具有安全性高、在体内維持时间长、制备简单、热稳定性良好、便于贮藏和运输、使用省时省力等优点。2.鸡球虫临床上多为混合感染，本发明两种疫苗均包含危害严重的4种球虫的抗原基因片段，能够抵抗4种球虫的混合感染。3. T细胞免疫应答反应在球虫免疫应答中处于核心地位。本发明两种疫苗所选用的4个基因，都编码集中的T细胞表位，特异性地诱导T细胞免疫应答反应；通过选择最佳和最具免疫保护潜カ的T细胞表位诱生特异性免疫应答，能尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响；4个片段串联以增加表位浓度和密度，增强重组抗原的反应范围。4.鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，包括chIL-2。它能促进⑶4+T细胞和⑶8+T细胞的分化増殖，维持T细胞生长，促进NK细胞和B细胞功能。DNA疫苗pVAXl_TA4-l_NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-1L-2含有chIL_2基因，增强了该疫苗的免疫保护效果。试验证明，该疫苗在抗球虫感染中，不仅能够抵抗4种球虫的混合感染，而且具有良好的免疫保护效果。
图1 为 DNA 疫苗 pVAXl-TA4-l-NA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的结构示意图。图2为利用DNAstar对候选抗原基因的抗原表位分析結果。图 3 为 pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2 的 RT-PCR 检测图，M DNA 分子量标准物 DL2000 ;1_5 分别为 NA4-1 (326bp)、TA4-1 (343bp)、LDH-2 (349bp)、EMCDPK-1 (329bp)、chIL-2 (432bp)的检测；6 :空白对照。图4为以大鼠抗NA4重组蛋白多克隆抗体对pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2_EMCDPK-1-1L-2进行Western-blot检测结果图，M :蛋白Marker，1:注射部位(腿肌)裂解上清；2 :非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。图5为以大鼠抗TA4重组蛋白多克隆抗体对pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-1-1L-2进行Western-blot检测结果图；M :蛋白Marker，1:注射部位(腿肌)裂解上清；2 :非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。
图6为以大鼠抗LDH重组蛋白多克隆抗体对pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2_EMCDPK-1-1L-2进行Western-blot检测结果图；M :蛋白Marker，1:注射部位(腿肌)裂解上清；2 :非注射部位肌肉(胸部)裂解上清。
具体实施例方式基础材料1.孢子化卵囊江苏株柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，每3个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80%以上(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京中国农业大学出版社，1998.)。2.实验动物0龄的小公雏购自南京青龙山鸡场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。3.质粒与菌种宿主菌E. coli DH5a、BL21、质粒pMD18-T_mic4(陈益·鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA-1L-2-mic4的研究.南京农业大学硕士论文，2005)pET-28a(+)-NA4(李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号ZL 200810155080. 2)、pcDNA-TA4-Xa-chIL_2 (ZL 200510124048. 4实施例 3)、pET-28a(+)-TA4(即专利号ZL 200510124048. 4 实施例 4 中的 pET_TA4)、pET-28a(+)-LDH (宋鸿雁.堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究.南京农业大学博士学位论文，2010)，pMD18-T-pEtK2 (谢昆.柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-1L-2的研究.南京农业大学硕士论文，2004)和pMD18-T_5401 (黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗PVAX1.0-5401-1FN-Y的研究.南京农业大学硕士论文， 2006)，pMD18-T-3E-l (周婷婷.五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较·南京农业大学硕士学位论文，2008)、pMD18-T-EMCDPK (Mohammed Ali A. Shah. Researchon the Mult1-epitopes DNA Vaccines agamst ChickenCoccidiosis.南京农业大学博士学位论文，2010)真核表达载体pVAXl (Invitrogen公司)。4.工具酶与试剂Trizol试剂为Promega公司产品；DEPC为Amresco公司产品；β -巯基乙醇为Fluka公司产品；反转录酶AMV、01igo(dT) 18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量标准物DL2000、T4DNA Ligase、限制性内切酶，水饱和酚、琼脂糖胶回收试剂盒均为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；其余试剂为国产分析纯。5.主要仪器设备冷冻台式离心机(Eppendorf centrifuge 5417R);紫外可见分光光度计(Bio-Rad) ;PCR仪(HYBAID公司)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304C型，北京市六一仪器厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)。实施例1.多价多表位DNA疫苗的4种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选I多价多表位DNA疫苗候选抗原基因的抗原表位分析利用DNAstai^fE. tenella的4个抗原基因TA4(李祥瑞.用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号ZL 200510124048. 4，SEQN0.1中的第1-648个核苷酸)、mic4(陈益.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA-1L-2-mic4的研究.南京农业大学硕士论文，2005)、pEtK2 (谢昆.柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-1L-2的研究.南京农业大学硕士论文，2004)和5401(黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAXl. 0-5401-1FN- Y的研究.南京农业大学硕士论文，2006)，E. necatrix的NA4 (李祥瑞等.预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗.中华人民共和国发明专利，专利号ZL200810155080. 2)，E. acervulina的LDH(宋鸿雁·堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究.南京农业大学博士学位论文，2010)和3E-1 (周婷婷.五种鸡堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护效果比较.南京农业大学硕士学位论文，2008)以及 E. maxima 的 EMCDPK (Mohammed Ali A. Shah. Research on theMult1-epitopes DNA Vaccines against Chicken Coccidiosis.南京农业大学博士学位论文，2010)基因序列进行抗原表位分析，各确定1-2段T细胞表位比较集中的序列(见图2)，TA4基因中T细胞表位比较集中的序列为TA4-1 (TA4基因的第40-366个核苷酸)，mic4基因中T细胞表位比较集中的序列为mic4-l (mic4基因的第109-387个核苷酸)和mic4_2 (mic4基因的第487-771个核苷酸)，pEtK2基因中T细胞表位比较集中的序列为pEtK2_l (pEtK2基因的第43-450个核苷酸)和pEtK2-2 (pEtK2基因的第508-954个核苷酸)，5401基因中T细胞表位比较集中的序列为5401-1(5401基因的第463-852个核苷酸)，NA4基因中T细胞表位比较集中的序列为NA4-1 (NA4基因的第61-369个核苷酸)和NA4-2 (NA4基因的第343-681个核苷酸)，LDH基因中T细胞表位比较集中的序列为LDH-1 (LDH基因的第52-366个核苷酸)和LDH-2(LDH基因的第385-717个核苷酸)，3E_1基因中T细胞表位比较集中的序列为3E-1-K3E-1基因的第34-243个核苷酸)和3E_1_2(3E_1基因的第268-501个核苷酸)，EMCDPK基因中T细胞表位比较集中的序列为EMCDPK-1 (EMCDPK基因的第325-633个核苷酸)和EMCDPK-2 (EMCDPK基因的第886-1206个核苷酸)。 选择参数为I)Hydropathy-Hopp-Woods-通过计算蛋白质序列上的最大局部亲水性寻找蛋白质的抗原决定簇。2) Antigenicity-AMPH1-根据序列预测免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点。3) Antigenicity-Rothbard-Taylor-预测含有特定基序(motif)的潜在了淋巴细胞抗原决定簇。4) Antigenicity-Jameson-Wolf-通过联合现有的蛋白质结构预测方法预测潜在的蛋白质抗原决定族。2多价多表位DNA疫苗的4种鸡球虫候选多表位基因片段的筛选2. 14种鸡球虫候选多表位基因片段的克隆与DNA疫苗的构建根据所选定的序列，利用软件primer premier5. O设计以下14对特异性引物，由Invitrogen公司合成,引物序列及扩增模板见表I。表I用于克隆候选多表位基因片段的引物序列及扩增模板
权利要求
1.一种鸡艾美耳球虫多价多表位DNA疫苗，其特征在于该疫苗包含真核表达载体以及其中插入的T细胞表位集中的4个基因片段序列为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基所示的NA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第319-645个碱基所示的TA4-1、序列为SEQ ID NO.1 的第652-984个碱基所示的LDH-2以及序列为SEQID NO.1的第991-1299个碱基所示的 EMCDPK-1。
2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的4个基因片段NA4-1、TA4-1、 EMCDPK-1和LDH-2通过连接成融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1的形式插入真核表达载体中，该融合基因NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1序列如SEQ ID NO. 40所示。
3.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为pVAXl。
4.权利要求1 3中任一项所述的DNA疫苗在制备预防鸡球虫病的药物中的用途。
5.一种鸡艾美耳球虫多价多表位DNA疫苗，其特征在于该疫苗包含真核表达载体以及其中插入的T细胞表位集中的4个基因片段序列为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基所示的NA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第319-645个碱基所示的TA4-1、序列为SEQ ID NO.1 的第652-984个碱基所示的LDH-2以及序列为SEQID NO.1的第991-1299个碱基所示的EMCDPK-1 ；以及序列为SEQ ID NO.1的第1309-1740个碱基所示的鸡白介素_2基因 chIL_2ο
6.根据权利要求5所述的DNA疫苗，其特征在于所述的NA4-1、TA4-1、 EMCDPK-1、LDH-2和chIL-2连接在一起形成序列为SEQ ID NO.1所示的的融合基因 NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1 -1L-2,插入到真核表达载体pVAXl中组成免疫调节型多价多表位 DNA 疫苗 pVAXl-NA4-l-TA4-l-LDH-2-EMCDPK-l-1L-2。
7.权利要求5 6中任一项所述的DNA疫苗在制备预防和/或治疗鸡球虫病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物兽药技术领域，公开一种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗。一种鸡艾美耳球虫多价多表位DNA疫苗，包含真核表达载体以及其中插入的T细胞表位集中的4个基因片段序列为SEQ ID NO.1的第1-312个碱基所示的NA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第319-645个碱基所示的TA4-1、序列为SEQ ID NO.1的第652-984个碱基所示的LDH-2以及序列为SEQ ID NO.1的第991-1299个碱基所示的EMCDPK-1；以及序列为SEQ ID NO.1的第1309-1740个碱基所示的鸡白介素-2基因chIL-2。该疫苗在抗球虫感染中，不仅能够抵抗4种球虫的混合感染，而且具有良好的免疫保护效果。
文档编号A61K39/012GK103028111SQ20111030730
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者李祥瑞, 宋小凯, 严若峰, 徐立新, 任喆 申请人:南京农业大学