专利名称：一种甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属靶向性纳米材料技术领域，具体涉及一种肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术：
肝癌、肝炎等肝脏疾病是严重威胁人类健康的常见病和多发病，常规剂型的药物经静脉、口服或局部注射后，药物分布于全身，毒副作用较大。靶向给药系统通过载体材料可将药物选择性输送至肝脏的病变部位，降低对正常组织的毒副作用，减少用药剂量和给药次数，提高药效。纳米粒是由天然或合成高分子材料制成的粒径10 1000 nm固态胶体粒子，其作为新型给药载体可提高药物的溶解性和稳定性、改变药物体内分布、延长药物作用时间，且具有良好的缓控释效果。纳米粒表面经过特异性配体的修饰，可实现药物的主动靶向。实质细胞是肝脏的主要组成部分和代谢场所，肝脏的多数病变均发生于实质细胞。甘草酸是存在于甘草根、茎部的活性成分。哺乳动物肝实质细胞膜表面已被证实存在甘草酸特异性受体(Negishi M et al. Biochim Biophys Acta 1991，1066 (1) 77-82)，且在肿瘤组织中过量表达(Ilicheva TN et al. Vopr Onko 1998，44 (4) 390-394)。国内外已有研究表明，以甘草酸修饰的脂质体或纳米粒可在肝脏中高度蓄积，且具有良好的肝实质细胞靶向性(Osaka S et al. Biol Pharm Bull 1994，17 (7) 940-943 ； Lin AH et al. Int J Pharmaceut 2008，359 (1-2)247-253)。壳聚糖是自然界唯一存在的碱性多糖，具有良好的生物相容性且无毒可降解，但壳聚糖仅溶于酸性溶液，生理条件下不稳定，易聚集沉淀，壳聚糖的水溶性衍生物可有效改善其体内性质。壳聚糖及其衍生物已被广泛应用于生物医药、食品、化妆品等领域，可作为纳米药物载体的组成材料。中国专利CN1760223用壳聚糖水溶性衍生物制备黏膜粘附性纳米粒，表面可吸附亲水性药物。甘草酸作为靶向配体修饰壳聚糖纳米载体的研究较少，中国专利CN101006983A公开了一种甘草酸盐修饰壳聚糖/羧化壳聚糖复合载药纳米粒的制备方法，通过静电相互作用形成纳米粒，仅适于包载水溶性药物；仅证明该纳米粒可靶向至肝实质细胞，未表明其对肝癌细胞具有主动靶向性；且与壳聚糖相比，甘草酸盐修饰壳聚糖/ 羧化壳聚糖复合纳米粒的细胞摄取仅提高约2倍，并未有效发挥甘草酸的主动靶向作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种稳定性和重复性好、安全可靠的核壳型肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用。本发明的基本方案如下
亲水性的羧甲基壳聚糖和疏水性的甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯在水溶液中通过引发剂作用，接枝聚合得到两亲性共聚物；该两亲性共聚物自组装形成具有疏水内核、亲水外壳的聚合物羧甲基壳聚糖纳米粒；疏水性药物通过疏水相互作用载入纳米粒内核。本发明依据甘草酸对肝实质细胞的高度靶向性，将甘草酸分子共价连接至该羧甲基壳聚糖纳米粒的亲水表面，实现纳米粒对肝癌细胞的主动靶向，减小药物对正常组织的毒副作用。本发明的制备避免使用有机溶剂，且在PH 3^12的范围内均不会产生沉淀析出。具体说来，本发明提供的肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒，是由亲水性的羧甲基壳聚糖和疏水性的聚甲基丙烯酸烷基酯、聚丙烯酸烷基酯或聚氰基丙烯酸烷基酯接枝共聚形成的具有疏水内核、亲水外壳的核壳结构纳米粒，亲水外壳的表面共价连接有甘草酸；
其中，羧甲基壳聚糖与疏水性单体甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯的质量体积比为1:0.251:4 (g/ml)，甘草酸基团的含量为纳米粒质量的2 40%。所述的羧甲基壳聚糖为氧取代羧甲基壳聚糖，分子量范围为10，00(Γ500，000 Da, 脱乙酰度>85%。所述的甲基丙烯酸烷基酯为甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、 甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸异丁酯和甲基丙烯酸己酯中的一种或一种以上。所述的丙烯酸烷基酯为丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸己酯中的一种或一种以上。所述的氰基丙烯酸烷基酯为氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸丙酯、 氰基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸异丁酯、氰基丙烯酸己酯中的一种或一种以上。所述的肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒粒径为10(T300 nm。本发明的肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法如下
(1)将羧甲基壳聚糖溶解于水中，加热至3(Γ50V，加入疏水性的甲基丙烯酸烷基酯、 丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯，搅拌，加入引发剂，升温至7(T85 °C，反应纩24 h，纯化，冷冻干燥，得羧甲基壳聚糖纳米粒；
(2)将甘草酸溶解于pH8. (Γ10. 0的碳酸盐缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，冰浴下避光搅拌6 12 h，得甘草酸氧化产物甘草酸醛；
(3)将步骤(1)的纳米粒产物分散于水中，加入步骤(2)的甘草酸醛溶液中，室温下避光搅拌12 36 h;加入硼氢化钠水溶液，室温下避光搅拌12 36 h ；纯化，冷冻干燥，得甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒。所述的羧甲基壳聚糖为氧取代羧甲基壳聚糖，分子量范围为10，00(Γ500，000 Da,
脱乙酰度>85%。所述的甲基丙烯酸烷基酯为甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、 甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸异丁酯和甲基丙烯酸己酯中的一种或一种以上。所述的丙烯酸烷基酯为丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸己酯中的一种或一种以上。所述的氰基丙烯酸烷基酯为氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸丙酯、 氰基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸异丁酯、氰基丙烯酸己酯中的一种或一种以上。步骤(1)中，羧甲基壳聚糖与疏水性甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯的质量体积比为1:0. 1:4 (g/ml)。步骤(1)中的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾的一种，用量为反应体系的0. 0Γ0. 2%，g/mL。引发剂过少则反应不完全，过多则聚合反应过快，优选0. 05%。步骤(2)中，高碘酸钠与甘草酸的摩尔比为1:广4:1。步骤(3)中，甘草酸醛与纳米粒质量比为0.25:广4:1，质量比高于4:1时，纳米粒易产生沉淀，优选甘草酸醛与纳米粒质量比为1:广4:1。步骤(3)中，硼氢化钠与甘草酸醛的摩尔比为1:广4:1。作为上述肝肿瘤靶向性甘草酸修饰 羧甲基壳聚糖纳米粒的应用，本发明还提供一种肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖载药纳米粒。该载药纳米粒以上述的纳米粒为载体，包载疏水性药物制成；其中，疏水性药物与肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5 1:20。其中，所述疏水性药物为抗癌药物和分子探针中的一种或几种的混合物。所述抗癌药物为紫杉醇、阿霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、全反式维甲酸、喜树碱中的一种或几种的混合物；所述疏水性分子探针为荧光标记物、放射性分子、磁性分子、温度敏感型或PH敏感型分子等。上述肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖载药纳米粒的制备方法如下 将肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒分散于PH 7. 4的磷酸缓冲液中，力口
入用有机溶剂溶解的疏水性药物，室温搅拌0. 5^4 h，冰浴下脉冲式超声，透析除去残留有机溶剂，得载药纳米粒悬液。其中，疏水性药物与肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为 1:5 1:20。所述的有机溶剂为乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中的一种。所述的脉冲式超声的条件为输出功率100 W，工作2 s,间歇2 S。本发明的肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒可作为包载疏水性抗癌药物和分子探针的静脉注射给药载体，用于肝脏疾病的治疗。本发明的优点在于
(1)将甘草酸的趋肝性与壳聚糖衍生物纳米粒优良的生物学性能相结合，制备了一种新型肝肿瘤靶向性给药载体，兼具被动靶向和主动靶向双重功效。本发明的纳米粒表面亲水，且甘草酸修饰可增加其亲水性，避免网状内皮系统的清除，实现体内长循环，载药纳米粒在肿瘤新生血管渗漏处可通过EPR效应聚集在肿瘤组织。纳米粒上的靶向基团(甘草酸) 可被肝肿瘤细胞表面特异性受体的识别、结合，显著提高细胞摄取效率，与未修饰羧甲基壳聚糖纳米粒相比，甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的细胞摄取提高10倍，更有效发挥甘草酸的主动靶向作用，从而增加药物的胞内浓度，提高药效，达到靶向治疗的目的。(2)本发明的纳米粒甘草酸修饰度较高，易与肝癌细胞表面受体结合，靶向能力较强。(3)本发明的纳米粒分散均勻，多分散性系数均小于0. 2，分布范围较窄。同时，本发明的纳米粒均带有较强的表面电荷，室温保存和生理条件下均稳定，不易产生凝聚和沉淀。(4)本发明的纳米粒结构致密，可通过超声直接、快速包载疏水性药物，保护药物活性。所载药物在体内释放缓慢，可防止药物到达靶点前对正常组织的毒性。(5)本发明的纳米粒以羧甲基壳聚糖为骨架材料，无毒且无免疫原性，生物相容性良好，体内可降解，降解产物对生物体无害。
(6)羧甲基壳聚糖中含有羧基，具有抑酶作用。(7) 本发明各种原料廉价易得，纳米粒合成工艺简单，条件可控，重复性好。纳米粒可在水溶液中经共聚物自组装形成，引入靶向基团的方法简捷方便，连接键牢固，且制备过程中无需使用表面活性剂等有机溶剂，安全可靠。本文所用术语
“CMCNP”指羧甲基壳聚糖纳米粒，其组成为羧甲基壳聚糖-甲基丙烯酸甲酯两亲性共聚物。“CMCNP-GL”指甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒。“PTX/CMCNP”指载紫杉醇羧甲基壳聚糖纳米粒。“PTX/CMCNP-GL”指载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒。
图1为纳米粒的透射电镜图，(A)羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例1)，(B)甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例18)。图中标尺为100 nm。图2为羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例1)与甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例17、18、19)的血清稳定性。图3为羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例1)与甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例17、18、19)在肝癌细胞2 h的细胞摄取。图4为紫杉醇溶液和载紫杉醇纳米粒(实施例24、25、26、27)与肝癌细胞共培养 24 h的体外细胞毒性。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，浓度为质量体积百分数(w/v)。实施例1羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量10，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至40°C，加入0.5 mL甲基丙烯酸甲酯，搅拌20 min后，加入0.05 g过硫酸铵，缓慢升温至70°C，继续反应24 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例2羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量10，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至30°C，加入0.25 mL甲基丙烯酸甲酯，搅拌10 min后，加入0.01 g过硫酸铵，缓慢升温至75°C，继续反应12 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例3羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量10，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至50°C，加入4 mL甲基丙烯酸甲酯，搅拌30 min后，加入0.2 g过硫酸铵，缓慢升温至 85°C，继续反应2 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例4羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量10，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至50°C，加入1 mL丙烯酸甲酯，搅拌30 min后，加入0. 1 g过硫酸钾，缓慢升温至80°C， 继续反应8 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干
O实施例5羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量100，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至45°C，加入2 mL甲基丙烯酸乙酯，搅拌30 min后，加入0.05 g过硫酸铵，缓慢升温至70°C，继续反应6 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化， 冷冻干燥。实施例6羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量100，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。 加热至35°C，加入3 mL丙烯酸乙酯，搅拌20 min后，加入0.02 g过硫酸铵，缓慢升温至 75°C，继续反应4 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例7羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量100，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至40°C，加入1 mL氰基丙烯酸甲酯，搅拌10 min后，加入0.05 g过硫酸铵，缓慢升温至80°C，继续反应10 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化， 冷冻干燥。实施例8羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量100，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至50°C，加入0.5 mL甲基丙烯酸丙酯，搅拌20 min后，加入0.15 g过硫酸钾，缓慢升温至85°C，继续反应14 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例9羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量300，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至30°C，加入0.25 mL甲基丙烯酸丁酯，搅拌20 min后，加入0.1 g过硫酸铵，缓慢升温至70°C，继续反应16 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例10羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量300，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至45°C，加入4 mL氰基丙烯酸异丁酯，搅拌30 min后，加入0.2 g过硫酸钾，缓慢升温至80°C，继续反应18 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化， 冷冻干燥。实施例11羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量500，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至40°C，加入2 mL丙烯酸己酯，搅拌10 min后，加入0.2 g过硫酸铵，缓慢升温至75°C，继续反应20 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。
实施例12羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
取分子量500，000 Da的羧甲基壳聚糖lg，加至100 mL水中，室温搅拌至完全溶解。加热至50°C，加入0.5 mL氰基丙烯酸乙酯，搅拌20 min后，加入0.05 g过硫酸钾，缓慢升温至85°C，继续反应22 h。将反应得到的乳白色纳米粒悬液置14，000 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例13甘草酸醛的制备
将甘草酸(GL)溶于pH 9.0的碳酸缓冲液，取NaIO4适量溶于水，甘草酸和NaIO4摩尔浓度均为0.05 mol/L。搅拌下将NaIO4溶液缓慢滴加至上述甘草酸溶液中，NaIO4与甘草酸的摩尔比为1:1。冰浴避光搅拌6 h，得甘草酸氧化产物，记为甘草酸醛。 实施例14甘草酸醛的制备
将甘草酸(GL)溶于pH 8.0的碳酸缓冲液，取NaIO4适量溶于水，甘草酸和NaIO4摩尔浓度均为0.05 mol/L。搅拌下将NaIO4溶液缓慢滴加至上述甘草酸溶液中，NaIO4与甘草酸的摩尔比为2:1。冰浴避光搅拌9 h，得甘草酸氧化产物，记为甘草酸醛。 实施例15甘草酸醛的制备
将甘草酸(GL)溶于pH 10.0的碳酸缓冲液，取NaIO4适量溶于水，甘草酸和NaIO4摩尔浓度均为0.05 mol/L。搅拌下将NaIO4溶液缓慢滴加至上述甘草酸溶液中，NaIO4与甘草酸的摩尔比为4:1。冰浴避光搅拌12 h，得甘草酸氧化产物，记为甘草酸醛。 实施例16醛基的检测
用新制的Cu(OH)2溶液与GL醛产物溶液混合加热，有红色沉淀(Cu2O)证明有醛基存在。实施例17甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例1的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例13的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:1，室温避光搅拌24 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为1:1，室温搅拌24 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例18甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例1的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例13的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为2:1，室温避光搅拌24 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为1:1，室温搅拌24 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例19甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例1的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例13的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为4:1，室温避光搅拌24 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为1:1，室温搅拌24 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例20甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例3的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例14的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为0. 25:1，室温避光搅拌12 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为2:1，室温搅拌36 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例21甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例6的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例15的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为0. 25:1，室温避光搅拌12 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为4:1，室温搅拌12 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例22甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例9的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例14的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为0. 5:1，室温避光搅拌36 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为1:1，室温搅拌12 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例23甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例12的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于水中，搅拌下将纳米粒悬液缓慢加入实施例15的甘草酸醛溶液中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为0.5:1，室温避光搅拌36 h。将NaBH4溶于水，逐滴加入上述反应体系，NaBH4与甘草酸的摩尔比为1:1，室温搅拌36 h。超声后将产物置3，500 Da半透膜中透析纯化，冷冻干燥。实施例24载紫杉醇羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例1的羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0.2 Μ,ρΗ 7. 4)，紫杉醇溶于无水乙醇，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例25载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例17的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 Μ, pH 7. 4)，紫杉醇溶于无水乙醇，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例26载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例18的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于无水乙醇，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例27载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例19的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于无水乙醇，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例观载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例20的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 Μ, pH 7. 4)，紫杉醇溶于无水乙腈，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:10。室温搅拌0.5 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例四载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例21的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于无水丙酮，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:10。室温搅拌2 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例30载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例22的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于四氢呋喃，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:20。室温搅拌0.5 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例31载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例23的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，紫杉醇溶于N，N- 二甲基甲酰胺，搅拌下将紫杉醇溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，紫杉醇和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:20。室温搅拌4 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例32载阿霉素甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例18的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，阿霉素溶于无水乙醇，搅拌下将阿霉素溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，阿霉素和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例33载喜树碱甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备
将实施例18的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M, pH 7. 4)，喜树碱溶于无水乙醇，搅拌下将喜树碱溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，喜树碱和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h，冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例34载5-氟尿嘧啶甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备将实施例18的甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒均勻分散于磷酸缓冲液(0. 2 M，pH 7. 4), 5-氟尿嘧啶溶于无水乙醇，搅拌下将5-氟尿嘧啶溶液滴加至甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒悬液中，喜树碱和甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5。室温搅拌1 h， 冰浴下脉冲式超声仪超声(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，产物置3，500 Da半透膜中，透析纯化。实施例35透射电镜表征纳米粒形态
将实施例1的羧甲基壳聚糖纳米粒与实施例18的甘草酸修饰的羧甲基壳聚糖纳米粒用适量水分散后滴加至载有碳膜的铜网上，室温下晾干，透射电镜观察并拍照，见附图1。由图可见纳米粒均呈呈核壳状球形，分散均勻，大小均一。与羧甲基壳聚糖纳米粒相比，甘草酸修饰后纳米粒粒径减小，表面亲水层加厚。实施例36甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的粒径、电势
Zetasizer Nano电势及粒度测定仪测定羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例1)与甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例17、18、19)的粒径和Zeta电势。粒径测定参数=He-Ne激光 (波长633nm)，散射角θ =90°，测定温度23 ° C。Zeta电势测定参数=He-Ne激光(波长 653nm)，散射角θ =14°，测定温度23 ° C。每份样品平行测定3次。测定结果见表1。如表1所示，甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒电势绝对值均大于25mV，表明纳米粒较稳定。纳米粒的粒径范围为102-202 nm，体内分布过程中可先被肝脏吞噬，易于通过病变部位的渗透性和滞留作用在肿瘤部位聚集。纳米粒粒径大小受甘草酸接枝率的影响。少量的甘草酸修饰使羧甲基壳聚糖纳米粒粒径增大，随GL修饰量的提高，粒径减小。实施例37载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的粒径、电势、包封率及载药量
粒径、Zeta电势
Zetasizer Nano电势及粒度测定仪测定载紫杉醇羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例24)与载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例25、26、27)的粒径和Zeta电势。粒径测定参数=He-Ne激光(波长633nm)，散射角θ =90°，测定温度23 ° C。Zeta电势测定参数He-Ne激光(波长653nm)，散射角θ =14°，测定温度23 ° C。每份样品平行测定3 次。测定结果见表1。紫杉醇包封率和载药量
层析用硅胶装柱(6(Γ100目)，排尽气泡。将载紫杉醇羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例24) 和载紫杉醇甘草酸修饰使羧甲基壳聚糖纳米粒(实施例25、26、27)分别分散于水中制得纳米粒悬液，各取0.5 mL上样，以水洗脱，根据WXJ-9388型紫外检测仪280 nm处显示的峰值收集纳米粒洗脱液，精确测量其体积。取适量纳米粒洗脱液，用10倍体积甲醇溶解，涡旋2 min，12，000 rpm离心20 min，取上清液20 μ L过0. 45 μ m滤膜，高效液相色谱(HPLC)测定包载于纳米粒中的紫杉醇浓度。再用乙醇与水混合溶剂梯度洗脱，同法收集游离紫杉醇洗脱液，精确测量其体积。HPLC测定游离紫杉醇浓度。按下式计算紫杉醇包封率 包封率(％)= AXIOO/ (A+B)，载药量(％)= AXlOO/ ( A+C) 其中A为包载于纳米粒中的紫杉醇含量(mg) ；B为存在于纳米粒悬液中游离紫杉醇含量(mg) ；C为纳米粒的质量(mg)。如表1所示，与空白纳米粒相比，载药后各纳米粒粒径均略增加，Zeta电势均无变化。经GL表面修饰后，CMCNP对紫杉醇的包封率与载药量显著提高，且随GL修饰度的增加而增加。 表1甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒和载紫杉醇甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的粒径、电势、包封率(n=3)
权利要求
1.一种肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒，其特征在于是由亲水性的羧甲基壳聚糖和疏水性的聚甲基丙烯酸烷基酯、聚丙烯酸烷基酯或聚氰基丙烯酸烷基酯接枝共聚形成的具有疏水内核、亲水外壳的核壳结构纳米粒，亲水外壳的表面共价连接有甘草酸；其中，羧甲基壳聚糖与疏水性单体甲基丙烯酸烷基酯、丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯的质量体积比为1:0.251:4 g/ml，甘草酸基团的含量为纳米粒质量的2 40%。
2.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于所述的羧甲基壳聚糖为氧取代羧甲基壳聚糖，分子量范围为10，000 500，000 Da。
3.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于所述的甲基丙烯酸烷基酯为甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸异丁酯和甲基丙烯酸己酯中的一种或一种以上；所述的丙烯酸烷基酯为丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸己酯中的一种或一种以上；所述的氰基丙烯酸烷基酯为氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸丙酯、氰基丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸异丁酯、氰基丙烯酸己酯中的一种或一种以上。
4.根据权利要求1-3之一所述的纳米粒，其特征在于纳米粒为球形，粒径为10(Γ300nm0
5.一种如权利要求1一4之一所述的肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)将羧甲基壳聚糖溶解于水中，加热至3(Γ50V，加入疏水性的甲基丙烯酸烷基酯、 丙烯酸烷基酯或氰基丙烯酸烷基酯，搅拌，加入引发剂，升温至7(T85 °C，反应214 h，纯化，冷冻干燥，得羧甲基壳聚糖纳米粒；(2)将甘草酸溶解于pH8. (Γ10. 0的碳酸盐缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，冰浴下避光搅拌6 12 h，得甘草酸氧化产物甘草酸醛溶液；(3)将步骤(1)的纳米粒产物分散于水中，加入步骤(2)的甘草酸醛溶液中，室温下避光搅拌12 36 h;加入硼氢化钠水溶液，室温下避光搅拌12 36 h;纯化，冷冻干燥， 得甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒；其中，甘草酸醛与羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为 0.25:1 4:1 g/ml 。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾的一种，用量为反应体系的0.0广0. 2% g/mL。
7.根据权利要求5所述的纳米粒的制备方法，其特征在于高碘酸钠与甘草酸的摩尔比为1:广4:1，硼氢化钠与甘草酸醛的摩尔比为1:广4:1。
8.一种肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖载药纳米粒，其特征在于以权利要求广4之一所述的纳米粒为载体，包载疏水性药物制成；其中，疏水性药物与肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒的质量比为1:5 1:20。
9.根据权利要求8所述的载药纳米粒，其特征在于所述疏水性药物为抗癌药物和分子探针中的一种或几种的混合物。
10.根据权利要求9所述的载药纳米粒，其特征在于所述抗癌药物为紫杉醇、阿霉素、 表阿霉素、5-氟尿嘧啶、全反式维甲酸、喜树碱中的一种或几种的混合物；所述疏水性分子探针为荧光标记物、放射性分子、磁性分子、温度敏感型或PH敏感型分子。
11.一种如权利要求8-10之一所述的载药纳米粒的制备方法，其特征在于具体步骤如下将权利要求1一4之一所述的肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒分散于pH 7. 4的磷酸缓冲液中，加入用有机溶剂溶解的疏水性药物，室温搅拌0. 5^4 h，冰浴下脉冲式超声，透析除去残留有机溶剂，得载药纳米粒悬液。
12.根据权利要求11所述的载药纳米粒的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中的一种。
13.根据权利要求11所述的载药纳米粒的制备方法，其特征在于所述脉冲式超声的条件为输出功率100 W，工作2 S，间歇2 S。
全文摘要
本发明属于纳米材料技术领域，具体为一种肝肿瘤靶向性甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用。本发明的纳米粒呈核壳型，以疏水性聚合物为内核包载药物，以羧甲基壳聚糖为亲水外壳并共价连接肝靶向配体甘草酸。其制备方法为在引发剂作用下，羧甲基壳聚糖与疏水单体接枝共聚并自组装形成纳米粒；将甘草酸氧化得甘草酸醛溶液，按一定比例与纳米粒混合引入靶向基团，药物通过超声载入。与现有技术相比，其制备方法简单易控、重复性好，稳定性和安全性较好，显著增强抗肿瘤药物的靶向性和抑瘤效果。该纳米粒作为疏水性药物或分子探针的靶向递送载体，可用于肝脏疾病的治疗及诊断。
文档编号A61K9/14GK102357079SQ20111033352
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者印春华, 施丽丽 申请人:复旦大学