专利名称：保肝抗肝纤维化活性石斛多糖及其抗体亲和层析制备方法
保肝抗肝纤维化活性石斛多糖及其抗体亲和层析制备方法技术领域
本发明属于植物提取物以及植物提取物的制备方法领域，具体涉及一种抗肝纤维化活性石斛多糖提取物及其抗体亲和层析制备方法。
背景技术：
肝脏是人体内最重要的解毒器官，病毒因子、酒精、药物等毒害物质与肝脏的频繁接触会导致肝损伤。肝损伤会造成细胞坏死、凋亡、炎症、纤维化等病理变化，最终导致肝纤维化等各种肝脏疾病。肝纤维化是各种肝病恶化发展为肝硬化和肝癌的共同病理基础，是导致肝病患者死亡的主要原因，对人类健康和生活质量有着极大的危害性。目前对肝损伤的治疗主要依赖于药物，但它们的疗效有限，而且这些药物的长期服用会产生新的肝损伤； 而当前临床上尚缺乏疗效确切、无明显毒副作用的抗肝纤维化药物。因此，对肝损伤、肝纤维化进行早期预防显得尤为必要。研究表明，许多可食动植物原料中含有预防肝损伤、抑制肝纤维化的活性化学成分，如果以这些活性化学成分为保健因子研制出保肝保健食品，对肝损伤、肝纤维化的有效预防将具有重要意义。
石斛是卫生部规定的可用于保健食品的物品之一，作为传统饮品在我国已有2000 多年的食用历史。据报道，铁皮石斛多糖对环孢素A致大鼠肝损伤有保护作用，霍山石斛多糖对亚硒酸钠致大鼠肝损伤、肝纤维化有保护作用。当前，石斛多糖主要通过水提醇沉法获得，如，公开号分别为CN 101015649A、CN 101407558A、CN 101407557A的发明专利公开了铁皮石斛和金叉石斛多糖的水提醇沉制备方法。霍山石斛多糖是其发挥生理活性的物质基础。目前，霍山石斛多糖的获得是通过水提醇沉或水提醇沉后再通过离子交换柱进一步精制。水提醇沉法获得的霍山石斛多糖产品纯度低，纯度不到30% 虽然通过离子交换柱进一步精制后提高了纯度，但需要反复操作，产品得率低，一般只有40%左右。发明内容
为了解决现有霍山石斛多糖制备方法得率低、纯度低等不足，本发明的目的在于提供一种产品纯度高、质量可控、纯化效率高的具有保肝抗肝纤维化霍山石斛多糖的抗体亲和层析制备方法。
本发明保肝抗肝纤维化活性石斛多糖的化学结构式如下
权利要求
1. 一种保肝抗肝纤维化活性石斛多糖，其特征是该活性石斛多糖的化学结构式如下该活性石斛多糖的分子量为2. 2X IO4道尔顿，它是以葡萄糖和甘露糖为主链、半乳糖为分支的半乳葡甘聚糖，其中，葡萄糖、甘露糖和半乳糖的摩尔比为31 10 8。
2.保肝抗肝纤维化活性石斛多糖的提取、分离纯化方法，其特征在于具体操作步骤如下(1)原料预处理取粉碎的石斛，用石油醚于温度50°C回流5h，脱脂、脱色，放置于温度 25°C环境，以挥发除去有机溶剂，得到石斛药渣；(2)热水浸提取石斛药渣，按料液质量体积比1g 30ml加入蒸馏水，于温度80°C 浸提60 min，得到浸提液；将浸提液在转速15000 r/min条件下离心分离15 min，得到的离心沉淀物用80°C热水再浸提两次；合并三次收集的离心上清液，得到石斛浸提液；将石斛浸提液于温度60°C条件下，减压浓缩到浓缩液体积与石斛药渣质量的比例为1 ml 3g，得到石斛浓缩液；石斛浓缩液用截留分子量为3000道尔顿的透析袋透析3天以除去小分子物质，得石斛透析截留液；(3)醇沉在石斛透析截留液中加入体积分数为95%的乙醇，使石斛透析截留液中乙醇终体积分数达到80%，于温度4°C静置72小时；在温度4°C、转速12000 r/min条件下，离心分离15分钟，取沉淀，得到石斛沉淀物；(4)脱蛋白取石斛沉淀物，加入蒸馏水，配制成100mg/ml的石斛多糖水提液A，取石斛多糖水提液A，将氯仿按石斛多糖水提液A 1/5体积加入，随之再加入氯仿体积1/5的丁醇，混合，剧烈振摇20 min,然后在温度10°C、转速12000 r/min条件下，离心分离15分钟， 分去水层和溶液层交界处的变性蛋白质，得石斛多糖水提液B ；取石斛多糖水提液B，将氯仿按石斛多糖水提液B 1/5体积加入，随之再加入氯仿体积 1/5的丁醇，混合，剧烈振摇20 min，然后在温度10°C、转速12000 r/min条件下，离心分离 15分钟，分去水层和溶液层交界处的变性蛋白质，得石斛多糖水提液C;取石斛多糖水提液C，将氯仿按石斛多糖水提液C 1/5体积加入，随之再加入氯仿体积 1/5的丁醇，混合，剧烈振摇20 min，然后在温度10°C、转速12000 r/min条件下，离心分离 15分钟，分去水层和溶液层交界处的变性蛋白质，得石斛多糖水提液；(5 )纯化①DEAE-52离子交换树脂柱分级取石斛多糖水提液，通过DEAE-52高效阴离子交换树脂柱，用苯酚硫酸法跟踪检测流出液，收集蒸馏水洗脱部分的主峰流出液A ；主峰流出液A用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析3天，收集透析浓缩液A ； kphacryl S-200凝胶树脂柱分级取透析浓缩液A，通过kphacryl S-200凝胶树脂柱，用苯酚硫酸法跟踪检测流出液，收集蒸馏水洗脱部分的主峰流出液B;主峰流出液B用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析3天，收集透析浓缩液B ；取透析浓缩液B，依次通过DEAE-52离子交换树脂柱分级和kphacryl S-200凝胶树脂柱分级，重复DEAE-52离子交换树脂柱分级和kphacryl S-200凝胶树脂柱分级操作步骤 8次，收集最后一次的透析浓缩液经冷冻干燥，得到活性石斛多糖；(6)活性石斛多糖的化学结构表征通过全水解分析、Smith降解反应、甲基化分析、红外光谱分析，以及核磁共振波谱分析方法确定了活性石斛多糖的化学结构式如下
3.根据权利要求2所述的保肝抗肝纤维化活性石斛多糖的提取、分离纯化方法，其特征在于所述石斛为新鲜的霍山石斛或干燥的霍山石斛。
4.抗体亲和层析制备保肝抗肝纤维化活性石斛多糖的方法，其特征在于具体操作步骤如下(1)制备免疫原取活性石斛多糖溶解于PH值9.2的碳酸盐缓冲液中，配制成质量分数为10 mg/ml的活性石斛多糖溶液，然后加入牛血清白蛋白，使活性石斛多糖溶液中的牛血清白蛋白的质量分数为10 mg/ml，搅拌混勻，置于温度37°C的恒温箱中反应3d，得到反应体系；加入乙醇胺，使反应体系中乙醇胺质量分数达到1%时终止反应，得反应液；反应液通过kphadex G-150凝胶柱分离，分部收集；分别采用苯酚-硫酸法和Bradford法测定每一管中活性石斛多糖和牛血清白蛋白含量，计算每摩尔活性石斛多糖分子连接的牛血清白蛋白摩尔分子数；取每摩尔活性石斛多糖分子连接有5摩尔牛血清白蛋白分子的偶联物为活性石斛多糖-牛血清白蛋白免疫原，得到多糖复合物免疫原；(2)免疫小鼠将5mg多糖复合物免疫原溶于5 mL生理盐水中，与等体积的弗氏完全佐剂双推法混勻，得到免疫原溶液；采用腹腔注射免疫8周龄的雌性小鼠，每只小鼠注射免疫原溶液0.2 ml ;1周后的第七天，取5 mg多糖复合物免疫原溶于5 mL生理盐水中，与等体积弗氏不完全佐剂混勻，得免疫原混合液；每只雌性小鼠腹腔注射0. 2 ml免疫原混合液进行加强免疫，加强免疫重复3次，每周1次；最后1次免疫后的第七天，剪尾取血，用酶联免疫分析法(ELISA)测定小鼠血清中活性石斛多糖特异性抗体的效价；选择血清中活性石斛多糖特异性抗体效价高于1 10000的小鼠用于细胞融合，并在细胞融合前4-5天，腹腔接种0.2 ml不含佐剂的质量分数为1.0 mg/mL的多糖复合物免疫原水溶液进行冲击免疫， 获得免疫小鼠；(3)细胞融合在无菌条件下取免疫小鼠的脾淋巴细胞制成每毫升含IXlO3 IXlO4 个细胞的细胞悬液，将细胞悬液于温度4 °C、转速1000 r/min的条件下离心10分钟，取离心沉淀，得到免疫小鼠的脾淋巴细胞；取IXlO8个免疫小鼠的脾淋巴细胞与2X107个Balb/c小鼠SP2/0肿瘤细胞混合，预热至37°C，缓慢加入Iml预热至37°C的质量分数为50% 的聚乙二醇溶液，再慢慢加入10 ml预热至37 ！的含质量分数为20%胎牛血清的DMEM完全培养基，细胞悬浮，于温度4°C、转速1000 r/min条件下离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入DMEM完全培养基5ml，细胞重新悬浮，分装于96孔细胞培养板中，于温度37 °C、体积分数为5%的二氧化碳(CO2)气体、95%湿度的条件下培养1天，然后加入4XHAT培养液50 μ 1， 第6天用HAT培养液置换出96孔细胞培养板的培养孔中的1/2DMEM完全培养基，第11天用HT培养液置换出HAT培养液，获得融合细胞；(4)制备活性石斛多糖单抗杂交瘤细胞株将融合细胞接种于HAT选择培养基上，以多糖复合物免疫原为抗原，采用间接酶联免疫分析法检测融合细胞分泌的活性石斛多糖特异性抗体的效价，选择抗体效价高于1 1000的融合细胞，得到能分泌活性石斛多糖特异性抗体的杂交细胞；采用有限稀释法对所述杂交细胞在96孔细胞培养板中进行克隆化，采用间接酶联免疫分析法检测96孔细胞培养板上的克隆分泌在培养上清液中的活性石斛多糖特异性抗体的效价，选择抗体效价高于1 100的单细胞克隆，得到阳性克隆；取阳性克隆采用有限稀释法在96孔细胞培养板中进行三次克隆化，选择能分泌活性石斛多糖特异性抗体的阳性克隆，得到杂交瘤细胞克隆；选择抗体反应强、生长良好的杂交瘤细胞克隆接种于HAT培养基上，于温度37 °C、体积分数为5%的二氧化碳(CO2)气体、95%湿度的条件下培养三天，得到活性石斛多糖单抗杂交瘤细胞株；(5)制备活性石斛多糖单克隆抗体取10周龄的雌性小鼠，腹腔注射0.5 ml降植烷； 第七天每只雌性小鼠接种处于对数生长期的活性石斛多糖单抗杂交瘤细胞株5 X IO6个；第十四天采集雌性小鼠的腹水，将腹水于温度4 °C、转速5000 r/min的条件下，离心15分钟， 收集上清液；采用辛酸一硫酸铵沉淀法沉淀上清液中的抗体A，抗体A通过kphadex G-150 凝胶柱层析，获得抗体B ；分别采用PAGE和SDS-PAGE法鉴定抗体B的纯度，同时用间接酶联免疫分析法测定抗体B对活性石斛多糖的特异性；收集条带均一、清晰可见的抗体B，冷冻干燥，得到活性石斛多糖单克隆抗体；(6)制备活性石斛多糖单抗免疫亲和层析柱(A)琼脂糖(SepharoseMB载体与抗体的偶联取IOg活性石斛多糖单克隆抗体溶解于偶联缓冲液中，然后置于截留分子量为2000 道尔顿的透析袋中透析M小时，取透析截留液配制成质量分数为0. 5 mg/ml的活性石斛多糖单克隆抗体水溶液，所述偶联缓冲液的PH值为8. 2，偶联缓冲液是含有0.5 Mol/L氯化钠(NaCl)和0. 1 Mol/L碳酸氢钠(NaHCO3)的水溶液；取经溴化氰活化的琼脂糖4B15g， 用所述偶联缓冲液快速抽洗5次，迅速倒入活性石斛多糖单克隆抗体溶液中进行偶联，紫外扫描以监控偶联过程；用偶联缓冲液洗除未偶联的活性石斛多糖单克隆抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；(B)封闭活化基团将琼脂糖-抗体偶联复合物加入到6倍体积的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液中，保持3小时以封闭琼脂糖4B中未反应的基团；所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的PH值为8.0，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为含有0.5 Mol/L氯化钠和0.1 Mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸的水溶液；(C)装柱将空柱用10倍柱体积的pH值7. 2、浓度0. 01 Mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后在底部放置一疏水筛板，并放入空柱1/8体积的pH值7. 2、浓度0. 1 Mol/L的磷酸缓冲液，得到预处理空柱；将步骤(A)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物先用10倍琼脂糖-抗体偶联复合物体积的、pH值 4. 5的含有0. 5Mol/L氯化钠的0. 1 Mol/L磷酸缓冲液洗涤三次，然后用10倍琼脂糖-抗体偶联复合物体积的、PH值8.0的含有0.5 Mol/L氯化钠的0. 1 Mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗涤三次，再用5倍琼脂糖-抗体偶联复合物体积的、pH值7. 2、浓度0. 1 Mol/L的磷酸缓冲液洗涤三次，得到琼脂糖-抗体偶联复合物胶体；将琼脂糖-抗体偶联复合物胶体倒入预处理空柱中；待下沉，在琼脂糖-抗体偶联复合物胶体顶部加一滤纸片，并用10倍柱体积的pH值7. 2、浓度0. 1 Mol/L的磷酸缓冲液冲洗，以排除柱床中的气泡，最后用pH值7. 2的含有质量分数为0. 01%叠氮化钠的0. 1 Mol/L磷酸缓冲液保存，得到活性石斛多糖单抗免疫亲和层析预装柱；(7)抗体亲和层析制备活性石斛多糖(a)平衡用平衡缓冲液以2 ml/min的流速平衡活性石斛多糖单抗免疫亲和层析预装柱，通过紫外检测观0 nm处吸光值监控预装柱已平衡至基线，得到平衡层析柱；所述平衡缓冲液为PH值8. 0的含有0. 5 Mol/L氯化钠的0. 1 Mol/L Tris-HCl水溶液；(b)上样取石斛粗多糖配制成质量浓度为0. 2 mg/ml的上样液， 将50 ml上样液以2 ml/min的流速通过平衡层析柱，得到层析载样柱；(c)洗脱用平衡缓冲液以2 ml/min的流速清洗层析载样柱，通过紫外检测洲0 nm处吸光值监控载样柱已清洗至基线；用PH值4. 5的含有0. 5 Mol/L氯化钠的0. 1 Mol/L磷酸洗脱液以1 ml/min的流速将石斛多糖从层析载样柱洗脱下来，洗脱液体积为层析载样柱体积的5倍；用苯酚硫酸法跟踪检测收集各管中石斛多糖含量，收集石斛多糖主峰流出液；石斛多糖主峰流出液冷冻干燥或喷雾干燥，得到活性石斛多糖；活性石斛多糖的化学结构式如下
5. 一种保肝抗肝纤维化活性石斛多糖的用途，其特征在于，该活性石斛多糖具有保肝、 抗肝纤维化活性，可用于制备保肝保健品以及治疗肝纤维化的药物。
全文摘要
本发明公开了一种具有保肝抗肝纤维化活性的石斛多糖的化学结构式(见图)，它是以葡萄糖和甘露糖为主链、半乳糖为分支的半乳葡甘聚糖，它的分子量约为2.2×104道尔顿，分子组成中的葡萄糖、甘露糖和半乳糖的摩尔比为31︰10︰8。本发明还分别公开了活性石斛多糖的提取、分离纯化方法、活性石斛多糖的抗体亲和层析制备方法。本发明制备的石斛多糖具有明显的保肝、抗肝纤维化生理活性，可用于制备保肝的保健品和治疗肝纤维化的药物。
文档编号A61P1/16GK102504043SQ20111036902
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者查学强, 潘利华, 罗建平 申请人:合肥工业大学