专利名称：一种从猪血浆中提取凝血酶拮抗剂的方法
技术领域：
本发明属食品深加工领域，是农副产品综合利用开发。
背景技术：
早在19世纪末期，凝血酶就被苏格兰的生理学家发现并命名，直到1951年凝血酶被纯化出来并对其进行测序之后，人们对凝血酶的研究和了解才越来越深入。凝血酶的生理功能与其丝氨酸蛋白酶的活性有关，能裂解纤维蛋白原而形成纤维蛋白凝块，从而促进血液凝块的形成。20世纪中期，人们就开始将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。后来美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时未产生抗体的过敏反应和其他不良反应等，因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆。凝血酶拮抗剂是一种可以在动物体内抑制凝血酶活性的物质，其可以以凝血酶为靶点，用凝血酶拮抗剂来抑制血栓的生成，即是临床治疗血栓的方法之一，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种凝血酶拮抗剂的提取方法，该方法工艺简单。所述方法包括血浆分离，加入缓冲液，凝胶柱层析等。1新鲜的检疫合格的猪血液加入2 3%的柠檬酸三钠抗凝，加入时缓慢搅拌防止出现溶血现象。2使用4°C离心机在转速5000r/min，离心20min分离出血浆。3在猪血浆里按1 10的比例加入0. 1 0. 5mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7. 0)，
4°C下静置过夜。4混合液用离心机分离，离心转速为4000 7000r/min，离心15 30min，收集上清液。5上清液用葡聚糖kphadex G50凝胶柱分离纯化，用0. 15mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱未接和的杂蛋白，直到用紫外可见光分光光度计在^Onm处无杂蛋白吸收峰。6用0.2mol/L的CH3COONa缓冲液(pH4. 5)洗脱结合蛋白，用自动分离器收集洗脱液。
具体实施例方式实施例1检疫合格的新鲜猪血加入2%柠檬酸三钠抗凝，边加边缓慢搅拌，放置出现溶血。使用高速冷冻离心机分离血液，在4°C条件下，用5000rpm的转速离心20min，收集上清液。2在50ml血浆中加入500ml的0. 4mol/L的pH7. 0的iTris-HCl缓冲液，4°C下静置 24h.
3此时混合液出现浑浊，使用离心机离心分离，离心转速设置为5000r/min，离心时间设置为20min，收集上清液。4将上清液用葡聚糖kphadex G50凝胶柱过滤，先是用0. 15mol/L pH7. 0的 Tris-HCl缓冲液洗脱未结合的杂蛋白，用紫外可见光分光光度计在^Onm检测直到无杂蛋白吸收峰出现，再用0. 2mol/L pH4. 5的CH3COONa缓冲液洗脱结合蛋白，用自动分离器回收洗脱液，即为凝血酶拮抗剂粗品。
权利要求
1.本发明涉及到一种从猪血浆中提取凝血酶拮抗剂的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤a)在猪血浆中按1 10比例加入0. 1 0. 5mol/L的1Tris-HCl缓冲液，4°C下静置过夜；b)过夜的混合液用离心机分离，转速为4000 7000r/min，离心15 30min；c)收集上清液过葡聚糖凝胶柱，用0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱未结合的杂蛋白；d)用紫外可见光分光光度计监测洗脱情况，直到无杂蛋白吸收峰；e)用0.2mol/L的CH3COONa缓冲液(pH4. 5)洗脱结合蛋白，用自动分离器收集洗脱液。
2.根据权利要求la，Ic所述的使用的Tris-HCl缓冲液，其特征在于所用到的 Tris-HCl 缓冲液 pH 7. 0。
3.根据权利要求Ic所述的葡聚糖凝胶柱，其特征在于所用的SkphadexG50。
4.根据权利要求Id洗脱杂蛋白，其特征是在^Onm处检测吸收峰。
全文摘要
本发明提供了一种从猪血浆中提取凝血酶拮抗剂的方法。本方法选用国内资源浪费严重的猪血液作为原料，提取凝血酶拮抗剂，具体方法包括沉淀，离心分离及凝胶层析等方法。
文档编号A61K35/14GK102488710SQ20111041537
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者刘欢, 吴涵, 潘风光, 王楠 申请人:吉林大学