专利名称：一种提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程领域，涉及一种提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法。 具体涉及一种在灵芝菌丝体液体发酵中利用中药提取物以及通过调控中药种类、浓度和添加时间等因素诱导灵芝次生代谢产物灵芝三萜类化合物的产生与积累的方法。
背景技术：
灵芝(Ganoderma lucidum)是我国最著名的高等药用真菌。作为药物已有2000 多年的历史。目前在灵芝中研究较多的化学成分有多糖类、三萜类、核苷类、留醇类、生物碱类、呋喃类、氨基酸多肽类、油脂类、微量元素等物质。灵芝三萜是灵芝的主要活性成分之一。据文献报道，灵芝三萜具有抗肿瘤、保肝作用，抑制组胺释放、血管紧张素转化酶等活性。而通过各种方法(如紫外诱变选育)促使得到更多的灵芝的有效活性成分，已成为国内外学者研究和关注的热点。灵芝代谢产物可能与中草药的有效成分发生复方、协同作用，如灵芝在添加中草药培养液的环境中可能加速灵芝萜类的形成，增加其生物活性。中药的某些成分可能促进灵芝的生长和有效成分的产生，使灵芝的原有作用得到补充或增强，从而具有更强的保健、 预防或治疗功能，以便于进一步制作出配伍更佳的新型复合发酵制剂，用于功能性食品的开发等方面。三萜类化合物为灵芝主要药用成分之一，国内外已经有很多报道，另外通过添加外源物的方法研究其对灵芝菌丝体生物量和三萜类化合物含量的影响也有不少报道，如把中药提取液作为灵芝外源诱导物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法。本发明的目的可以通过以下技术方案实现—种提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其在于在灵芝菌丝体液体发酵时，采用含中药提取物的培养基进行灵芝菌丝体液体发酵培养。上述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其在于包括以下步骤(1)称取中药材，制备中药提取物；(2)向PDA培养基中加入步骤1制备的中药提取物，制备含有中药提取物的PDA培
养基；(3)向步骤(2)制备的含有中药提取物的PDA培养基中接入灵芝菌种，菌种接种量为5% 15% ；在温度沘 30°C，转速120 150r/min条件下，摇床培养7 10d。上述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其在于所述的中药提取物的制备方法为称取中药材，加4 10倍量的水浸泡0. 5 池后，加热提取2 3次，每次提取时间为15 40min，过滤，合并滤液并浓缩滤液后，将浓缩液置于容量瓶中定容，得到中药提取物。
上述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其在于步骤O)中按生药量计算，所述PDA培养基中中药材的添加量为50 800mg/mL。上述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其在于用于制备所述中药提取物的中药材为板蓝根、连翘、泽泻、黄芪或酸枣仁。优选为板蓝根、连翘或酸枣仁。上述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其在于按生药量计算，板蓝根添加量为50 800mg/mL，连翘添加量为50 100mg/mL，泽泻添加量为100mg/mL，黄芪添加量为50mg/mL，酸枣仁添加量为100mg/mL。进行灵芝菌丝体液体发酵时，不能直接将中药材加入培养基中，需要先制备制备中药提取液，再将中药提取液加入到培养基中制成含中药提取物的培养基。IOOOmL含中药提取物的PDA液体培养基，培养基组成为马铃薯汁IOOOmL,葡萄糖20克，中药提取物。具体做法是马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加水IOOOmL煮沸 10 30分钟，纱布过滤，再加20g葡萄糖，充分溶解后，用中药提取液部分代替水定容至1 升，分装到三角瓶，115°C灭菌30分钟，冷却后贮存用于灵芝培养。本发明利用在液体发酵基础中添加中药提取液，提高灵芝菌丝体的三萜产量。本发明的有益效果通过本发明的方法，可显著提高灵芝菌丝体液体发酵时三萜类化合物的产量，且方法简单，与常规培养方法相比采用本发明方法可使液体发酵的灵芝菌丝体中三萜类化合物的产量提高对％ 845%。
具体实施例方式下面结合实例对本发明做进一步详细说明实施例11.称取中药材板蓝根5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加热至沸腾，再用文火保持沸腾状态30min，倒出提取液，补加5倍重量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出提取液。将两次提取液过滤，合并滤液并浓缩后，将浓缩液置于50mL容量瓶中定容，按照生药量计算，得到浓度为lOOmg/mL的板蓝根提取液。分别按照上述方法制备50mL 浓度为 200mg/mL、400mg/mL、800mg/mL、1200mg/mL、 1600mg/mL的板蓝根提取液。2.分别用50mL不同浓度的板蓝根提取液部分代替水配制IOOmL PDA培养基，则所配制的PDA培养基中板蓝根的生药量分别为50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL、 600mg/mL、800mg/mL。每个样品设三个重复。115°C灭菌30分钟。分别以10%接种量接入灵芝液体菌种，28°C，150r/min培养7天。3.发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定三萜含量。取烘干的菌丝粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95 %乙醇定容，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液4000r/min离心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞试管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷却，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表1。与比较例相比产量增加明显，三萜产量增加百分比见表2。实施例2
1.称取中药材连翘5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加热至沸腾，再用文火保持沸腾状态30min，倒出提取液，补加5倍重量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出提取液。将两次提取液过滤，合并滤液并浓缩后，将浓缩液置于50mL容量瓶中定容，按照生药量计算，得到浓度为lOOmg/mL的连翘提取液。按照上述方法制备50mL浓度为200mg/mL的连翘提取液。2.分别用50ml不同浓度的连翘提取液部分代替水配制IOOml PDA培养基，则所配制的PDA培养基中连翘的生药量分别为50mg/mL、100mg/mL。每个样品设三个重复。115°C 灭菌30分钟。分别以10%接种量接入灵芝液体菌种，28°C，150r/min培养7天。3.发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定三萜含量。取烘干的菌丝粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95 %乙醇定容，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液4000r/min离心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞试管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷却，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表1。三萜产量增加百分比见表2。实施例31.称取中药材泽泻10g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加热至沸腾，再用文火保持沸腾状态30min，倒出提取液，补加5倍重量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出提取液。将两次提取液过滤，合并滤液并浓缩后，将浓缩液置于50mL容量瓶中定容，按照生药量计算，得到浓度为200mg/mL的泽泻提取液。2.用50mL浓度为200mg/mL的泽泻提取液部分代替水配制IOOmLPDA培养基，则所配制的PDA培养基中泽泻的生药量为100mg/mL。样品设三个重复。115°C灭菌30分钟。 以10%接种量接入灵芝液体菌种，28°C，150r/min培养7天。3.发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定三萜含量。取烘干的菌丝粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液4000r/min离心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞试管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷却，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表1。三萜产量增加百分比见表2。实施例41.称取中药材黄芪5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加热至沸腾，再用文火保持沸腾状态30min，倒出提取液，补加5倍重量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出提取液。将两次提取液过滤，合并滤液并浓缩后，将浓缩液置于50mL容量瓶中定容，按照生药量计算，得到浓度为lOOmg/mL的黄芪提取液。2.用50mL浓度为100mg/mL的黄芪提取液部分代替水配制IOOml PDA培养基，则所配制的PDA培养基中黄芪的生药量分别为50mg/mL。每个样品设三个重复。115°C灭菌 30分钟。分别以10%接种量接入灵芝液体菌种，28°C，150r/min培养7天。3.发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定三萜含量。取烘干的菌丝粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液4000r/min离心lOmin，取上清液0. IOmL于IOmL具塞试管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷却，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表1。三萜产量增加百分比见表2。实施例51.称取中药材酸枣仁10g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加热至沸腾，再用文火保持沸腾状态30min，倒出提取液，补加5倍重量冷水于药渣中，再煮沸20min，倒出提取液。将两次提取液过滤，合并滤液并浓缩后，将浓缩液置于50mL容量瓶中定容，按照生药量计算，得到浓度为200mg/mL的酸枣仁提取液。2.用50mL浓度为200mg/mL的酸枣仁提取液部分代替水配制IOOmLPDA培养基，则所配制的PDA培养基中酸枣仁的生药量为100mg/mL。样品设三个重复。115°C灭菌30分钟。以10%接种量接入灵芝液体菌种，28°C，150r/min培养7天。3.发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定三萜含量。取烘干的菌丝粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液4000r/min离心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞试管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷却，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。检测结果见表1。三萜产量增加百分比见表2。比较例1.配制IOOmL PDA培养基，设三个重复。115°C灭菌30分钟。以10%接种量接入灵芝液体菌种，28°C，150r/min培养7天。2.发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定三萜含量。取烘干的菌丝粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液4000r/min离心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞试管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷却，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm处测定吸光度，测定灵芝三萜含量。测得灵芝三萜产量为0. 07g/L。表1添加不同种类不同用量中药提取液的培养基培养灵芝菌丝体时三萜产量
权利要求
1.一种提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于在灵芝菌丝体液体发酵时，采用含中药提取物的培养基进行灵芝菌丝体液体发酵培养。
2.根据权利要求1所述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于包括以下步骤(1)称取中药材，制备中药提取物；(2)向PDA培养基中加入步骤1制备的中药提取物，制备含有中药提取物的PDA培养基；(3)向步骤( 制备的含有中药提取物的PDA培养基中接入灵芝菌种，菌种接种量为 5% 15% ；在温度28 30°C，转速120 150r/min条件下，摇床培养7 10d。
3.根据权利要求2所述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于所述的中药提取物的制备方法为称取中药材，加4 10倍量的水浸泡0. 5 池后，加热煮沸提取2 3次，每次提取时间为15 40min，过滤，合并滤液并浓缩滤液后，将浓缩液置于容量瓶中定容，得到中药提取物。
4.根据权利要求2所述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于步骤 ⑵中按生药量计算，所述PDA培养基中中药材的添加量为50 800mg/mL。
5.根据权利要求1 3所述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于用于制备所述中药提取物的中药材为板蓝根、连翘、泽泻、黄芪或酸枣仁。
6.根据权利要求5所述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于所述的中药材为板蓝根、连翘或酸枣仁。
7.根据权利要求5所述的提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，其特征在于按生药量计算，板蓝根添加量为50 800mg/mL，连翘添加量为50 100mg/mL，泽泻添加量为 100mg/mL，黄芪添加量为50mg/mL，酸枣仁添加量为100mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种利用中药提取物提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法。本发明灵芝菌丝体的培养采用液体培养，在灵芝菌丝体液体发酵时，采用含中药提取物的培养基进行灵芝菌丝体液体发酵培养。将不同浓度的中药提取液(如板蓝根、连翘、泽泻、黄芪、酸枣仁)加入灵芝液体培养基中接种培养，培养后测定灵芝菌丝体三萜产量显著提高。本方法具有成本低，无污染，易实现工业化生产等优点。
文档编号A61K36/074GK102488719SQ201110439918
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月25日 优先权日2011年12月25日
发明者任昂, 师亮, 李梦娇, 林龙, 穆大帅, 赵明文 申请人:南京农业大学