专利名称：用于贝伐单抗联合疗法的基于肿瘤组织的生物标志的制作方法
用于贝伐单抗联合疗法的基于肿瘤组织的生物标志本发明提供了用于改善患有胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的患者的无进展存活的方法，其通过相对于在诊断为胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的患者中的对照水平測定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平通过与化学疗法方案组合用贝伐单抗(bevacizumab) (Avastin )治疗来进行。本发明进一歩提供了用于评估患者对与化学疗法方案组合的贝伐单抗(Avastin )的敏感性或响应性的方法，其通过相对于诊断为胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的患者中的对照水平測定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平来进行。因而，本发明涉及胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的生物标志的鉴定和选择，所述生物标志与对与化学治疗方案，诸如基于奥沙利钼(oxaliplatin)的化学疗法组合的血管发生抑制剂，例如贝伐单抗(Avastin )的敏感性或响应性相关联。在这方面，本发明涉及使用相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中建立的対照的VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达概况，来鉴定对将血管发生抑制剂，例如贝 伐单抗(Avastin )添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者。本发明进一步涉及用于改善患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的无进展存活的方法，其通过相对于在诊断为胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌的患者中的对照測定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的肿瘤特异性表达水平通过将血管发生抑制剂，例如，贝伐单抗(Avastin )添加至标准的化学疗法，例如，基于奥沙利钼的化学疗法来进行。作为依照本文中所描述的方法来測定VEGFA, HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的备选或在依照本文中所描述的方法来测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平外，相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中建立的对照水平的肿瘤样品中的血管数目可以作为生物标志测定，所述生物标志为对将血管发生抑制剂，例如贝伐单抗(Avastin )添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者的指示物。本发明还提供了用于鉴定对血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗(AvastiiT )敏感或响应的患者(依照本发明的方法来测定并限定)的试剂盒和组合物。血管发生对于癌症形成是必需的，其不仅调节原发性肿瘤大小和生长，而且还影响侵入性和转移性潜力。因而，已经调查了介导血管生成过程的机制作为用于定向抗癌疗法的潜在靶物。早先在血管生成调控物的研究中，发现了血管内皮生长因子(VEGF)信号传导途径优先调节多种癌症类型中的血管生成活性，并且已经开发出多种治疗剂来在多个点调控此途径。这些疗法包括贝伐单抗、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)和瓦他拉尼(vatalanib)等。虽然血管生成抑制剂在临床中的使用已经显示成功，但是，不是所有患者都响应或不能完全响应血管发生抑制剂疗法。此类不完全响应根本的机制是未知的。因此，不断需要鉴定对抗血管生成癌症疗法敏感或响应的患者人群。虽然许多血管发生抑制剂是已知的，但是最主要的血管发生抑制剂是贝伐单抗(Avastin )。贝伐单抗是ー种重组人源化单克隆IgGl抗体，其特异性结合并阻断VEGF (血管内皮生长因子)的生物学效果。VEGF是肿瘤血管发生(肿瘤生长和转移，即肿瘤散布至身体的其它部分需要的ー种必需过程)的一种至关重要的驱动物。Avastin 在欧洲已经得到批准，用于治疗晚期阶段的四种常见癌症类型结肠直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和肾癌，这些癌症毎年共同引起超过250万例死亡。在美国，Avastin 是第一种得到FDA批准的抗血管生成疗法，并且现在它已经过批准用于治疗5种肿瘤类型结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑(成胶质细胞瘤)和肾(肾细胞癌)。至今已经用Avastin治疗了超过50万名患者，并且具有超过450项临床试验的全面临床项目正调查在不同背景(例如，晩期或早期阶段疾病)的多种癌症类型(包括结肠直肠、乳腺、非小细胞肺、脑、胃、卵巢和前列腺)的治疗中进ー步使用Avastin。重要地,Avastin 已经显示了有希望作为共治疗剂，其在与一大批化学疗法和其它抗癌治疗组合时表明效力。已经发表了 III期研究，其表明组合贝伐单抗与标准的化学治疗方案的有益效果(见例如，Saltz等，2008, J.Clin.Oncol. , 26:2013-2019;Yang 等，2008，Clin. Cancer Res. , 14:5893-5899;Hurwitz等，2004, N. Engl. J. Med.，350:2335-234 2)。然而，如在血管生成抑制剂的先前研究中的，这些中的ー些III期研究已经显示了一部分患者经历对将贝伐单抗(Avastin )添加至其化学治疗方案的不完全响应。因而，需要确定那些如下的患者的方法，所述患者响应或有可能响应包含血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗(Avastin )的联合疗法。如此，本发明根本的技术问题是提供用于鉴定患有或易于患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的方法和手段，所述患者可以受益于对化学治疗方案，例如基于奥沙利钼的抑制剂添加血管发生抑制剂，特别是贝伐单抗(Avastin )。通过提供权利要求书中表征的实施方案来解决该技术问题。因此，本发明提供了一种通过对所述化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的化学疗法方案的治疗效果的方法，所述方法包括(a)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平；并(b)对相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平具有升高的VEGFA水平、和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。本发明涉及ー种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的化学疗法方案的治疗效果的方法，所述方法包括(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平；并(c)对相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平具有升高的VEGFA水平、和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。因此，本发明提供了ー种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的无进展存活的方法，所述方法包括(a)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平；并(b)对相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平具有升高的VEGFA水平、和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。因此，本发明提供了ー种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的无进展存活的方法，所述方法包括(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平；并(c)对相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平具有升高的VEGFA水平、和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。在一个备选的实施方案中，本发明涉及ー种用于鉴定对将贝伐单抗添加至化学疗法方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括(a)自怀疑患有或易于患有胃肠癌，特别是mCRC的患者获得样品；并(b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平； 由此相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平，升高的VEGFA水平，和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平指示所述患者对将贝伐单抗添加至所述方案的敏感性。作为依照本文中所描述的方法来测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的备选或在依照本文中所描述的方法来测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平外，相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中建立的对照水平的肿瘤样品中的血管数目可以作为生物标志测定，所述生物标志为对将血管发生抑制剂，例如贝伐单抗(Avastin )添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者的指示物。因此，本发明的方法涵盖測定所述样品中的血管数目，其中此类血管数目測定例如在固体组织样品诸如组织活组织检查和/或组织切除中是有可能的或预期是有可能的，如熟练技术人员认可的。可以通过本文中所描述的任何方法或如本领域中对于此类测量已知的那样实施血管数目測定。一种用于血管数目測定的例示性方法是通过使用对ー种或多种内皮细胞标志物特异性的ー种或多种抗体来检测内皮细胞的标志物。在优选的实施方案中，肿瘤细胞不表达内皮细胞的生物标志。因为血管结构自内皮细胞形成，所以ー种或多种内皮细胞标志物区别血管结构与肿瘤(细胞)，容许容易地测定血管数目。熟练技术人员，例如病理学家会能够容易地确定适合于检测/区分内皮细胞(特别是相对于肿瘤细胞)的抗体及用于检测此类抗体及随后分析样品的方法两者。依照本发明的方法来分析样品可以是手动的，如熟练技术人员，例如病理学家实施的，如本领域中已知的，或者可以是自动化的，其使用为了加工井分析病理学图像，例如，为了测定组织活组织检查或切除中的血管数目或其它分析而设计的商品化软件(例如，MIRAX SCAN、Carl Zeiss AG、Jena, Germany)来实现。一种公认为在依照本发明的方法測定血管数目中使用的内皮细胞标志物的例示性抗原是⑶31。例如,通过以产品号M0823可购自Dako A/S (Glostrup, Denmark)的抗体克隆JC70A识别抗原⑶31，其用途被本发明的方法涵盖。因而，本发明涵盖测定患者样品中的CD31的肿瘤特异性表达水平或表达样式(I)作为所述患者中所述患者对将贝伐单抗添加至化学治疗方案的敏感性或响应性的指示物，或(2)作为方法的一部分以改善所述患者的无进展存活，其中所述患者患有或预期患有胃肠癌，特别是mCRC。因为⑶31对内皮细胞染色，并且较大的血管数目与较大的内皮细胞数目相关联，所以样品中的血管数目也与肿瘤特异性CD31表达水平正相关。因而，本发明涵盖用于改善患有胃肠癌的患者的无进展存活的方法，包括測定所述患者中的肿瘤特异性血管数目和/或肿瘤特异性⑶31表达水平，并对相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平具有増加的血管数目(和/或升高的CD31表达)的患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单杭。类似地，本发明涵盖ー种用于鉴定对将贝伐单抗添加至化学疗法方案响应或敏感的患者的体外方法，包括測定所述患者中的肿瘤特异性血管数目和/或肿瘤特异性CD31表达水平，并且由此相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平，来自所述患者的肿瘤样品中増加的血管数目(和/或升高的⑶31表达)指示患者对将贝伐单抗添加至所述方案的敏感性。因而，本发明解决了鉴定的技术问题，因为令人惊讶地，显示了相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中测定的对照水平，VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种在给定患者中的肿瘤特异性表达水平与施用与化学疗法方案组合的血管发生抑制剂的那些患者中的治疗效果相关联。具体地，令人惊讶地，将VEGFA、HER2和/或神经毡蛋白的肿瘤特异性表达水平的变化鉴定为响应将贝伐单抗(Avastin )添加至基于奥沙利钼的化学治疗方案的胃肠癌患者的无进展存活改善的标志物/预测物。展现出对将贝伐单抗(Avastin ) 添加至化学疗法方案的响应或敏感性的患者鉴定为相对于自诊断为转移性胃肠癌的患者获得的样品中建立的对照水平具有下列ー项或多项升高的VEGFA表达、降低的神经毡蛋白表达和降低的HER2表达。此外，在如本文中所描述的VEGFA、HER2和/或神经毡蛋白中的一种或多种的表达改变外，令人惊讶地，将相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中建立的对照水平，给定患者的肿瘤特异性血管数目(其与ー种或多种内皮细胞标志物，例如CD31的肿瘤特异性表达水平相关联)増加鉴定(I)为无进展存活改善的标志物/预测物之一，和/或(2)为与施用与化学疗法方案组合的血管发生抑制剂的胃肠癌患者中的治疗效果相关联的标志物/预测物之一。术语“标志物”和“预测物”可以互换使用，指VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平，如本文中所描述的。在VEGFA、HER2和/或神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平外，本发明还涵盖使用术语“标志物”和“预测物”来指依照本文中所描述的方法的内皮细胞标志物，例如CD31的肿瘤特异性血管数目和/或肿瘤特异性表达水平。本发明还涵盖使用术语“标志物”和“预测物”来指VEGFA、HER2和神经毡蛋白的肿瘤特异性表达水平中的任何两项或更多项的组合，和肿瘤特异性血管数目。在本发明的上下文中，“VEGFA”指图6中显示的以SEQ ID N0:1例示的血管内皮生长因子蛋白A。术语“VEGFA”涵盖具有氨基酸序列SEQ ID NO: I的蛋白质及其同系物和同等型。术语“VEGFA”还涵盖VEGFA的已知同等型，例如，剪接同等型，例如，VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，及其变体、同系物和同等型。在本发明的上下文中，术语“VEGFA”还涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO: 1，或者与其变体和/或同系物的氨基酸序列，及所述序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，只要变体蛋白质(包括同等型)、同源蛋白质和/或片段被ー种或多种VEGFA特异性抗体，诸如可购自Abcam,Inc (Cambridge, Massachusetts, U. S. A.)的抗体克隆 SP28 识别。在本发明的上下文中，“ HER2”指属于表皮生长因子受体家族的I型跨膜蛋白，又称为c-erbB2、ErbB2或Neu，其在图7中显示、以氨基酸序列SEQID NO: 2例示。在本发明的上下文中，术语“HER2”还涵盖HER2的同系物、变体和同等型，包括剪接同等型。术语“HER2”进ー步涵盖与氨基酸序列SEQ ID NO: 2、或与HER2同系物、变体和同等型中的ー种或多种的序列，及所述序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，只要变体蛋白质(包括同等型)、同源蛋白质和/或片段被ー种或多种HER2特异性抗体，诸如以可购自Dako A/S (Glostrup, Denmark)的 Herceptest 提供的抗体识别。所述 Herceptest 中的
HER2特异性抗体是ー种针对人HER2蛋白的合成C端胞质内片段(与匙孔!戚血蓝蛋白偶联
的免疫原)的亲和纯化的家兔抗体。商品化的且适合于依照本发明的方法使用的其它例示性抗 HER2 抗体包括但不限于可购自 Ventana Medical Systems S. A. (IllkirchjFrance)的克隆 4B5 ;可购自 Novocastra/Leica GmbH(WetzIer, Germany)的克隆 CB11、5A2、10A7、和CBEl 中的一种或多种；可购自Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, USA)的克隆 SP3 和可购自 InvitrogenTM(Carslbad，CA，USA)的克隆 TAB25Otj在本发明的上下文中，“神经毡蛋白”指神经毡蛋白-I蛋白，即ー种又称为NRP-I，且在图8中显示、以氨基酸序列SEQ ID N0:3例示的I型跨膜蛋白如本文中所使用的，“神经毡蛋白”也可以指神经毡蛋白-2/NRP-2，其与NRP-I共享约44%同源性，如本领域中已知的。在本发明的上下文中，术语“神经毡蛋白”还涵盖NRP-I和/或NRP-2的同系物、变体和同等 型。术语“神经毡蛋白”进ー步涵盖与氨基酸序列SEQ ID勵:1，或与殿 -1和/或殿卩-2同系物、变体和同等型(包括剪接同等型)中的ー种或多种的序列，及所述序列的片段具有至少85%、至少90%或至少95%同源性的蛋白质，只要变体蛋白质(包括同等型)、同源蛋白质和/或片段被ー种或多种NRP-I和/或NRP-2特异性抗体，诸如可购自R&D Systems, Inc.(Minneapolis, Minnesota, U. S. A.)的克隆 446915 识别。作为测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平的备选或在测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平外，本发明还涵盖测定血管数目作为本文中所描述的方法中使用的生物标志之一。如本领域中已知的及本文中所描述的，可以例如通过检测ー种或多种内皮细胞标志物，例如CD31的免疫组织化学方法来评估患者样品，例如包含肿瘤组织的样品内的血管数目。⑶31被认为是ー种适合于测定肿瘤样品中的血管数目的内皮细胞标志物，并且通常使用特异性抗体诸如以产品号M0823以克隆JC70A可购自Dako A/S (Glostrup, Denmark)的抗CD31抗体探査。作为测定VEGFA, HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平的备选或在测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的肿瘤特异性表达水平外，本发明进一步涵盖Dako A/S抗体克隆JC70A (产品号M0823)用于依照本文中所描述的方法測定血管数目、检测内皮细胞、和/或检测内皮细胞标志物的表达水平的用途。因而，本发明涵盖测定蛋白质，包括但不限于如本文中所描述的氨基酸序列的表达水平。在此上下文中，本发明涵盖检测VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的同系物、变体和同等型；所述同等型或变体包含等位变体或剪接变体等。还涵盖的是检测与如本文中所描述的VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种或其片段同源，例如与氨基酸序列 SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2 或 SEQ ID NO:3 或其片段具有至少 60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白质。或者/另外，本发明涵盖检测由如下的核酸序列或其片段编码的蛋白质的表达水平，所述核酸序列与编码SEQ ID NO: I、SEQ ID N0:2或SEQ ID勵:3或其片段、变体或同等型的核酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在此上下文中，术语“变体”意指VEGFA、HER2、和/或神经毡蛋白氨基酸序列、或编码所述氨基酸序列的核酸序列与以SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3鉴定和/或以上文所鉴定的GenBank登录号可获得的独特序列差别在于突变，例如，删除、添加、替代、倒位等。另夕卜，术语“同系物”指与如SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3中所显示的一种或多种多肽或其片段具有至少60%，更优选地至少80%且最优选地至少90%序列同一'丨生的分子。本发明进一步涵盖測定患者样品中的血管数目，该数目与如本领域中已知的ー种或多种内皮细胞标志物的肿瘤特异性表达，例如CD31的肿瘤特异性表达水平相关联。在此上下文中，本发明涵盖检测ー种或多种内皮细胞标志物或其变体的同系物、变体和同等型，并且可以包含内皮细胞标志物的等位变体或剪接变体等。还涵盖的是检测与如本领域中已知的ー种或多种内皮细胞标志物同源，例如与内皮细胞的已知标志物或其片段，例如CD31或其片段的氨基酸序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的蛋白质。或者/另外，本发明还涵盖检测由如下的核酸序列或其片段编码的蛋白质的表达水平，所述核酸序列与编码内皮细胞标志物，例如CD31或其片段、变体或同等型的核酸序列是至少 60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的。为了测定氨基酸或核酸序列与如本文中所描述的氨基酸或核酸序列是否具有某种程度的同一性，技术人员可以手工或者通过使用本领域中已知的或本文中所描述的计算机程序使用本领域中公知的手段和方法，例如比对。 依照本发明，术语“相同”或“百分比同一性”在两种或更多种氨基酸或核酸序列的上下文中指相同的，或者如使用如本领域中已知的序列比较算法，或者通过手动比对和视觉检查测量的，为了在比较窗里，或在指定区里得到最大对应而比较和比对时具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，与例如SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ IDN0:3的氨基酸序列，或内皮细胞的已知标志物，例如CD31的氨基酸序列的60%或65%同一性，优选地，70-95%同一性,更优选地,至少95%同一性)的两种或更多种序列或亚序列。认为具有例如60%至95%或更大序列同一性的序列是基本上相同的。此类定义也适用于测试序列的互补物。优选地，所描述的同一'丨生存在于长度为至少约15至25个氨基酸或核苷酸的区域里，更优选地，在长度为约50至100个氨基酸或核苷酸的区域里。本领域技术人员会知道如何使用例如算法，诸如那些基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl. AcidsRes. 2(1994), 4673-4680)或 FASTDB (Brut lag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245)的算法来測定序列间的百分比同一性，如本领域中已知的。虽然FASTDB算法在其计算中通常不考虑序列中的内部不匹配删除或添加，SP缺ロ，但是这可以手动校正以避免％同一性的过度评估。然而，CLUSTALW在其同一性计算中确实考虑序列缺ロ。本领域技术人员也可用的是BLAST (基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))和 BLAST 2. 0 算法(Altschul, 1997, Nucl. AcidsRes. 25:3389-3402;Altschul, 1993J.MoI.EvoI. 36:290-300;Altschul, 1990，J.Mol.Biol. 215:403-410)。用于核酸序列的BLASTN程序使用作为缺省的字长度(W)为11、预期(E)为10、11=5、,4、和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用作为缺省的字长度(W)为 3、和预期(E)为 10。BL0SUM62 评分矩阵(Henikoff (1989) PNAS89:10915)使用比对(B)为50、预期(E)为10、M=5、N=4、和两条链的比较。如上文所讨论的BLAST算法产生氨基酸和核苷酸序列两者的比对以測定序列相似性。由于比对的局部性质，BLAST特别可用于测定精确匹配或鉴定相似序列。BLAST算法输出的基本单元是高得分区段对(High-scoring Segment Pair, HSP)。HSP由任意的但相等长度的两个序列片段组成，所述序列片段比对是局部最大的，并且对于所述序列片段，t匕对得分满足或超过用户设置的阈值或截留得分。BLAST方法寻找询问序列与数据库序列间的HSP，以评估找到的任何匹配的统计学显著性，并且仅报告那些满足用户选定的显著性阈值的匹配。參数E建立用于报告数据库序列匹配的统计学显著性阈值。E解读为整个数据库搜索的背景内的HSP (或HSP组)的偶然发生的预期频率的上界。在程序输出中报告其匹配满足E的任何数据库序列。使用BLAST的类似计算机技术可以用于搜索蛋白质或核苷酸数据库诸如GenBank或EMBL中的相同或相关分子。此分析比基于膜的多重杂交快得多。另外，可以改良计算机捜索的灵敏性以测定任何特定匹配是否分类为精确的或类似的。捜索的基础是乘积得分，其定义为
%序列同一性χ %最大BLAST得分100
并且考虑两个序列间的相似性程度和序列匹配长度两者。例如，在乘积为40的情况中，匹配在1-2%的误差内会是精确的；而在70吋，匹配会是精确的。虽然较低的得分可以鉴定相关分子，但是通常通过选择那些显示15和40间乘积得分的分子来鉴定相似的分子。关于能够产生序列比对的程序的另ー个例子是CLUSTALW计算机程序(Thompson, 1994, Nucl. Acids Res. 2:4673-4680)或 FASTDB(Brutlag, 1990, Comp. App.Biosci. 6:237-245)，如本领域中已知的。可以分开认为VEGFA、HER2和/或神经毡蛋白的肿瘤特异性表达水平是个别标志物，或者在两个或更多个的组中，是表达概況，以预测患者对将贝伐单抗添加至化学疗法方案的敏感性。因此，本发明的方法涵盖基于ー种或多种标志物的表达水平来測定表达概況。作为依照本文中所描述的方法来測定VEFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的备选或在其之外，也可以使用相对于诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中建立的对照水平，在肿瘤样品中的血管数目作为ー种或多种生物标志，所述生物标志为对将血管发生抑制剂，例如，贝伐单抗(Avastin )添加至标准的化学疗法敏感或响应的患者的指示物。依照本发明，在N01966群体中令人惊讶地发现了，较大的贝伐单抗治疗效果与肿瘤细胞上高的CD31表达(高的血管数目)、较高的VEGFA表达、较低的神经毡蛋白表达和较低的HER2表达有夫。标志物VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平可以通过本领域中已知的适合于測定患者样品中的特定蛋白质水平的任何方法来评估，并且优选地，通过采用对VEGFA、HER2、神经毡蛋白和/或⑶31中的一种或多种特异性的抗体的免疫组织化学(“IHC”)方法来測定。此类方法是本领域中公知的且常规执行的，并且相应的商业抗体和/或试剂盒是容易地可获得的。例如，用于VEGFA、HER2、神经毡蛋白和CD31的商品化抗体/测试试剂盒可以分别以克隆 SP28 获自 Abeam, Inc (Cambridge, Massachusetts, U. S. A.),以Herceptest 获自 Dako A/S (Glostrup, Denmark),以克隆 446915 获自 R&D Systems, Inc.(Minneapolis, Minnesota, U. S. A.),和以克隆 JC70A 获自 Dako A/S (Glostrup, Denmark)。优选地，使用抗体或试剂盒制造商的试剂和/或方案推荐来评估本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平。技术人员还会知道通过IHC方法来测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的其它手段。因此，本领域技术人员无需过度负担便可以常规并可再现地确定本发明的一种或多种标志物/指示物的表达水平。然而，为了确保精确的且可再现的结果，本发明还涵盖在可以确保测试规程的确认的专门实验室中测试患者样品。优选地，在含有或怀疑含有癌细胞的生物学样品中评估VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平。样品可以是自患有、怀疑患有或诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者获得的胃肠组织切除、胃肠组织活组织检查或转移性损伤。优选地，样品是结肠直肠组织的样品、结肠直肠肿瘤的切除或活组织检查、已知的或受怀疑的转移性胃肠癌损伤或切片、或已知或怀疑包含循环癌细胞，例如胃肠癌细胞的血液样品，例如，外周血样品。样品可以包含癌细胞，即肿瘤细胞和非癌性细胞两者，并且在优选的实施方案中，包含癌性和非癌性细胞两者。在包括测定样品中的血管数目的本发明的方面，样品包含癌/肿瘤细胞和作为内皮细胞的非癌性细胞两者。熟练技术人员，例如，病理学家可以容易地辨别癌细胞与非癌性，例如，内皮细胞，以及测定样品内的血管数目，例如，通过对样品染色以检测内皮细胞标志物，例如CD31来进行。作为直接測定血管数目的备选或在直接測定血管数目外，也可以测定ー种或多种内皮细胞标志物，例如CD31的表达水平，该水平与血管数目相关联。获得包含组织切除、活组织检查和体液的生物学样品，例如包含癌/肿瘤细胞的血液样品·的方法是本领域中公知的。在本发明的上下文中，要在ー种或多种化学治疗剂外或作为与ー种或多种化学治疗剂的共疗法或共治疗施用贝伐单抗，所述化学治疗剂作为如本领域中已知的标准化学疗法方案的一部分施用。此类化学治疗剂的例子包括5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、吉西他滨(gemcitabine)-厄洛替尼(erlotinib)、卡培他滨和基于钼的化学治疗剂,诸如帕利他塞(paclitaxel)、卡钼(carboplatin)和奥沙利钼。用伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸的组合(又称为IFL)的标准化学治疗方案治疗的ー个例子。如所附实施例中所表明的，贝伐单抗对基于奥沙利钼的化学治疗方案的添加实现依照VEGFA、HER2、神经毡蛋白、和⑶31中的ー种或多种的表达水平限定并选择的患者和/或患者群体中的无进展存活的延长。如此，贝伐单抗可以与基于奥沙利钼的化学疗法方案组合。基于奥沙利钼的化学疗法方案的例子包括奥沙利钼、甲酰四氢叶酸、和5-氟尿嘧啶的组合，称为F0LF0X4方案(见例如de Gramont等，2000，J. Clin. Oncol. 18:2938-2947)和奥沙利钼和卡培他滨的组合，称为 XELOX 方案(见例如，Cassidy 等，2004，J. Clin. Oncol. 22:2084-2091)。因而，在本发明的某些方面，用与F0LF0X4或XELOX方案组合的贝伐单抗治疗依照本文中的方法鉴定的患者。常见的施用模式包括在固定的一段时间里以推注剂量或以输注的胃肠外施用，例如，在10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、3小吋、4小吋、5小时或6小时里施用总的每日剂量。例如，可以对结肠直肠癌患者以静脉内输注在30至90分钟里每三周作为XELOX方案的一部分或以5mg/kg的剂量以静脉内输注在2小时里每ニ周作为F0LF0X4方案的一部分施用7. 5mg/kg贝伐单抗(Avastin )(见例如Saltz等，2008，J. Clin. Oncol. 26:2013-2019)。技术人员会认可，本发明涵盖贝伐单抗的其它施用模式，如由特定患者和化学疗法方案确定的，而且治疗内科医生依照本领域中已知的方法最佳地确定特定的施用模式和治疗剂量。与化学疗法方案组合用贝伐单抗治疗依照本发明的方法选定的患者，并且可以用一种或多种别的抗癌疗法进ー步治疗。在某些方面，所述ー种或多种别的抗癌疗法是辐射。
在优选的实施方案中，收集自患者获得的样品，之后开始任何其它化学治疗方案或疗法，例如，用于治疗癌症或管理或改善其症状的疗法。因此，在优选的实施方案中，在施用化学治疗剂或开始化学疗法方案前收集样品。本发明还涉及诊断组合物或试剂盒，其包含适合于測定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的寡核苷酸或多肽。作为如本文中所描述的适合于测定VEGFA, HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的寡核苷酸或多肽的备选或在所述寡核苷酸或多肽外，本发明的试剂盒或诊断组合物还可以包含用于测定和/或检测内皮细胞标志物，例如，CD31的寡核苷酸或多肽，作为测定血管数目的手段，如本文中所描述的。如本文中详述的，寡核苷酸诸如DNA、RNA或DNA和RNA探针的混合物可以用于检测标志物/指示物蛋白质的mRNA水平，而多肽可以用于经由特异性蛋白质-蛋白质相互作用直接检测标志物/指示物蛋白质的蛋白质水平。在本发明的优选方面，作为用于VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种(和/或ー种或多种内皮细胞标志物，例如，CD31)的表达水平的探针涵盖的，且包含在本文中所描述的试剂盒或诊断组合物中的多肽是对这些蛋白质特异性的，或对其同系物和/或截短物特异性的抗体。 因而，在本发明的又一个实施方案中提供了ー种可用于实施本文中所描述的方法的试剂盒，其包含能够测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种(和/或ー种或多种内皮细胞标志物，例如，CD31)的表达水平的寡核苷酸或多肽。优选地，寡核苷酸包含对编码本文中所描述的ー种或多种标志物/指示物的mRNA特异性的引物和/或探针，而多肽包含能够与标志物/指示物蛋白质特异性相互作用的蛋白质，例如，标志物/指示物特异性抗体或抗体片段。在又一个实施方案中，本发明提供了贝伐单抗用于改善患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的无进展存活的用途，包括下列步骤(a)自所述患者获得样品；(b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平；并(c)对相对于在患有胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平具有升高的VEGFA和/或⑶31水平、和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。如所附实施例中证明的，本发明解决了鉴定的技术问题，因为可以令人惊讶地显示，相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平，给定患者中的VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平与施用与基于奥沙利钼的化学疗法方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果相关联。在本发明的上下文中，进ー步建立了相对于在诊断为胃肠癌，特别是mCRC的患者中測定的对照水平，更高的肿瘤特异性血管数目也与施用与基于奥沙利钼的化学疗法方案组合的贝伐单抗的患者中的治疗效果相关联。短语“响应”在本发明的上下文中指患有，怀疑患有或易于患有胃肠癌，特别是mCRC的受试者/患者显示对包括贝伐单抗添加的化学疗法方案的响应。技术人员会容易地能够确定依照本发明的方法用贝伐单抗治疗的人是否显示响应。例如，响应可以通过来自胃肠癌的痛苦降低，诸如降低和/或停止的肿瘤生长、肿瘤大小的縮小、和/或胃肠癌的一种或多种症状的改善，例如，胃肠出血、疼痛、贫血得到反映。优选地，响应可以通过胃肠癌的转移性转化的指数或mCRC的指数的降低或減少，例如，预防转移的形成或转移的数目或大小降低得到反映。短语“对…敏感”在本发明的上下文中指患有，怀疑患有或易于患有特别是mCRC的受试者/患者以某种方式显示对与化学疗法方案组合用贝伐单抗治疗的正面反应。患者的反应在与如上文所描述的“响应”的患者相比时可以是不太明显的。例如，患者可以经历较少的与疾病有关的痛苦，尽管可能没有測量到肿瘤生长或转移性指示物的降低，和/或患者对与化学疗法方案组合的贝伐单抗的反应可以仅是瞬时性质的，即肿瘤和/或转移的生长可以仅是暂时降低或停止的。
依照本发明的短语“患有…的患者”指显示胃肠癌，特别是mCRC的临床体征的患者。短语“易受”或“易子”在胃肠癌的上下文中指基于例如，可能的遗传素因、预先或最終暴露于危险的和/或致癌的化合物，或暴露于致癌性物理危险，诸如辐射，患者中的适应症疾病。短语“无进展存活”在本发明的上下文中指期间和在治疗后的期间依照治疗内科医生或调查人员的评估，患者的疾病不变坏，即不进展的时间长度。如技术人员会领会的，若与类似情况的患者的对照组的平均或均值无进展存活时间相比，患者经历更长的疾病不进展的时间长度，则患者的无进展存活得到改善或增强。如本文中所使用的，术语“施用”意指通过本领域中已知的适合于施用治疗性抗体的任何手段对需要此类治疗或医学干预的患者施用血管发生抑制剂，例如，贝伐单抗(Avastin )、和/或包含血管发生抑制剂，例如，贝伐单抗(Avastin )的药物组合物/治疗方案。非限制性施用路径包括通过ロ服、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、皮内、鼻内或支气管内施用(例如如通过吸入实现的)。在本发明的上下文中特别优选的是胃肠外施用，例如，静脉内施用。就用于治疗结肠直肠癌的贝伐单抗(Avastin )而言，依照EMEA的优选剂量是姆2周给予一次的5mg/kg或IOmg/g体重或姆3周给予一次的7. 5mg/kg或15mg/kg体重(关子评f言，见 http://www. ema. europa. eu/does/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Info rmation/human/000582/WC500029271. pdf (见第 2 页底部；以前以 http://www. emea. europa. eu/humandocs/PDFs/EPAR/avastin/emea-combined-h582en. pdf ロ」.犾得)。术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且包括但不限于单克隆和多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、人源化抗体、骆驼源化(camelized)抗体、单链抗体和抗体片段及片段构建体,例如,F(ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双特异性scFv、双抗体、单域抗体(dAb)和微型抗体,其展现出期望的生物学活性，特别是对VEGFA、HER2、神经毡蛋白和⑶31中的ー种或多种，或对其同系物、变体、片段和/或同等型的特异性结合。如本文中所使用的，“化学治疗剂”包括可以提供抗癌治疗效果，并且可以是化学药剂或生物药剂，特别是能够干扰癌或肿瘤细胞的化学药剂或生物药剂的任何活性剤。优选的活性剂是那些充当抗新生物(化学毒性或化学抑制性)药剂的，其抑制或阻止恶性细胞的形成、成熟或増殖。化学治疗剂的非限制性例子包括烷化剂诸如氮芥类(nitrogenmustards)(例如，双氯こ基甲胺(mechlorethamine)、环憐酸胺(cyclopho sphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil))、亚硝服类(nitrosoureas)(例如，卡莫司汀(carmustine) (BCNU)、洛莫司汀(Iomustine)(CCNU)、和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU))、乙撑亚胺类(ethylenimines) / 甲基蜜胺类(methy lame Iamines)(例如，三乙撑蜜月安(thri ethyl eneme lamine) (TEM)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(塞替派(thiotepa))、六甲蜜月安(hexamethy Ime lamine) (HMM，六甲蜜月安(altretamine)))、横酸焼基酯类(alkylsulfonates)(例如，白消安(busulfan))、和三嗪(例如，达卡巴嗪(dacarbazine) (DTIC))；抗代谢物诸如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate))、啼类似物(例如，5-氟尿啼氟脱氧尿啼ζ 、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosinearabinoside) (AraC，阿糖胞苷)、5_氮胞苷(azacytidine)、2，2，- ニ氟脱氧胞苷)、和卩票呤类似物(例如，6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(aZathi0prine)、2’ -脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)(喷司他丁(pentostatin))、红轻基壬基腺票呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarab ine phosphate)、和2_氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA));自天然产物开发的抗有丝分裂药物(例如，帕利他塞、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(例如，长春碱(vinblastine，VLB)、长春新碱(vincristine)、和长春瑞滨(vinorelbine))、泰索帝(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)、和磷酸雌莫司汀)、表鬼臼毒素类(epipodophylotoxins)(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如，放射菌素(actimomycin)D、道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))、丝裂霉素(mitomycin) C、放线菌素(actinomycin))、酶(例如，L-门冬酰胺酶)、和生物反应修饰剂(biological response modif ier)(例如，干扰素-α、IL-2、G_CSF、GM_CSF);混杂的药剂，包括钼配位复合物(例如，顺钼、卡钼)、蒽ニ酮类(anthracenediones)(例如，米托蒽醌(mitoxantrone))、取代的脲(BP，轻基脲(hydroxyurea))、甲基肼(methylhydrazine)衍生物(例如，N-甲基肼(MIH)、丙卡巴肼(procarbazine))、肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(mitotane) (o，p’ -DDD)、氨鲁米特(aminoglutethimide));激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂(例如，泼尼松(prednisone)和等同物，地塞米松(dexamethasone)、氨鲁米特(aminoglutethimide))、黄体酮(progestin)(例如，己酸轻孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)、醋酸甲轻孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate))、雌激素(例如，己烯雌酪(diethylstilbestrol)、乙炔基雌ニ醇(ethinylestradiol)及其等同物);抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen))、雄激素(例如，丙酸睾酮(testosterone propionate)、氟甲睾酮(fIuoxymesterone)及其等同物)、抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、促性腺素释放素类似物、亮丙瑞林(Ieuprolide))和非类固醇抗雄激素(例如，氟他胺)。在本发明的上下文中，提及氨基酸序列的“同源性”理解为指在序列的全长里至少80%的序列同一性，特别是至少85%，优选是至少90%且仍更优选是至少95%的同一性，如本文中所提供的SEQ ID NO所限定的。在本发明的上下文中，技术人员会理解同源性进ー步涵盖不同群体和民族中的标志物/指示物蛋白质的别的等位变异。如本文中所使用的，术语“多肽”指涵盖给定长度的氨基酸链的肽、蛋白质、寡肽或多肽，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。然而，本发明还涵盖此类蛋白质/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键已经被功能性类似物，例如，与20种基因编码氨基酸之一不同的氨基酸残基，例如，硒代半胱氨酸替换。肽、寡肽和蛋白质可以称作多肽。术语多肽和蛋白质在本文中可互換使用。术语多肽也指，并且不排除多肽的修饰，例如，糖基化、こ酰化、磷酸化等。此类修饰在基础教科书中充分描述，并且在专著及多卷研究文献中更为详细地描述。如本文中所使用的，术语“治疗”和“处理”指疾病或其任何參数或症状的补救、改善、严重性减轻、或时间过程的降低。优选地，所述患者是人患者，并且要治疗的疾病是是胃肠癌，特别是mCRC。术语“评估”此类患者指测定本文中所描述的ー种或多种标志物/指示物蛋白质，包括VEGFA、HER2、神经毡蛋白和CD31的表达水平，和/或基于相对于诊断为转移性结肠直肠癌的患者中建立的对照水平的此类标志物/指示物蛋白质的表达水平来选择此类患者的方法。在上文所描述的方法外，本发明还涵盖用于评估VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种的表达水平的其它免疫组织化学方法，诸如通过Western印迹和基于ELISA的检测来进行。可以在用于测定血管数目，包括測定ー种或多种内皮细胞标志物，例如CD31的肿瘤特异性表达水平的备选或其它方法中采用类似的方法。如本领域 中理解的，也可以通过本领域中已知的任何合适的方法，诸如Northern印迹、实时PCR、和RT PCR在mRNA水平评估本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平。基于免疫组织化学和mRNA的检测方法和系统是本领域中公知的，并且可以自标准的教科书，诸如 Lottspeich(Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag,1998)或 Sambrook 和Russell(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, CSH Press, Cold SpringHarbor, NY,U.S.A.，2001)推导出。所描述的方法特别可用于相对于诊断为转移性结肠直肠癌的群体中建立的对照水平，测定患者或患者组中的VEGFA、HER2、神经毡蛋白和/或CD31的表达水平。也可以通过利用免疫凝集、免疫沉淀(例如，免疫扩散、免疫电泳、免疫固定)、Western印迹技术(例如，(原位)免疫组织化学、(原位)免疫细胞化学、亲和层析、酶免疫测定法)等在蛋白质水平測定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种(和/或ー种或多种内皮细胞标志物，例如CD31)的表达水平。也可以通过物理方法，例如光度学来测定溶液中的纯化多肽的量。量化混合物中的特定多肽的方法通常取决于例如抗体的特异性结合。利用抗体特异性的特异性检测和定量方法包括例如免疫组织化学(原位)。例如，可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定本发明的标志物/指示物蛋白质在细胞或组织中的浓度/量。或者，可以实施Western印迹分析或免疫组织化学染色。Western印迹组合通过电泳分离蛋白质的混合物与用抗体的特异性检测。电泳可以是多维诸如2D电泳。通常，多肽在2D电泳中根据其表观分子量沿着一维及根据其等电点沿着另ー个方向分离。如上文所提及的，也可以在编码VEGFA、HER2和/或神经毡蛋白(和/或一种或多种内皮细胞标志物，例如CD31，以测定血管数目，如本文中所描述的)的相应基因的表达降低中反映依照本发明的标志物/指示物蛋白质的表达水平。因此，可以实施翻译前基因产物(例如，剪接、未剪接或部分剪接mRNA)的定量评估以评估相应基因的表达。本领域技术人员知道要在此上下文中使用的标准方法或者可以自标准的教科书(例如Sambrook, 2001,在上述引文中)推导出这些方法。例如,可以通过Northern印迹、实时PCR等获得关于编码VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种(和/或ー种或多种内皮细胞标志物,例如，CD31，以测定血管数目，如本文中所描述的)的mRNA的相应浓度/量的定量数据。在本发明的又一方面，可以有利地使用本发明的试剂盒来实施本发明的方法，并且可以在多种应用中，例如在诊断领域中或作为研究工具等采用。本发明的试剂盒的各部分可以个别地在管形瓶中或组合地在容器或多容器単元中包装。优选地，试剂盒的制造遵循标准的规程，其对于本领域技术人员已知的。依照采用例如本文中所描述的免疫组织化学技术的本文中所描述的发明方法，可以使用试剂盒或诊断组合物来检测VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的ー种或多种(和/或ー种或多种内皮细胞标志物，例如，⑶31，以测定血管数目，如本文中所描述的)的表达水平。虽然以使用贝伐单抗例示，本发明涵盖使用如本领域中已知的其它血管发生抑制剂以与标准的化学疗法方案组合使用。如本文中所使用的，术语“血管发生抑制剂”指改变血管发生(例如形成血管的过程)的所有药剂，并且包括阻断血管形成和/或停止或减缓血管生长的药剂。在贝伐单抗外，血管发生抑制剂的非限制性例子包括哌加他尼 (pegaptanib)、舒尼替尼、索拉非尼和瓦他拉尼。优选地，依照本发明的方法使用的血管发生抑制剂是贝伐单抗。如本文中所使用的，术语“贝伐单杭”涵盖满足在选自美国、欧洲和日本的国家或地区中获得作为相同或生物相似产品的销售授权必需的要求的所有相应的抗VEGF抗体或抗VEGF抗体片段。对于在本文中所描述的检测方法中使用，技术人员具有标记本发明涵盖的多肽或寡核苷酸的能力。如本领域中常规实施的，可以依照本领域中已知的标准方法来标记并显现检测mRNA水平中使用的杂交探针和/或IHC方法中使用的抗体或抗体片段，通常使用的系统的非限制性例子包括使用放射性标记物、酶标记物、荧光标签、生物素-亲合素复合物、化学发光等。本领域技术人员，例如主治内科医生容易地能够对如本文中选定并限定的患者/患者组施用与化学疗法方案组合的贝伐单杭。在某些背景中，主治内科医生会依照他/她的专业经验来修饰、改变或修改贝伐单抗和化学疗法方案的施用方案。因此，在本发明的某些方面，提供了如下的方法，其用干与化学疗法方案组合用贝伐单抗治疗或改善患有或怀疑患有胃肠癌的患者的无进展存活，其中在生物学样品(特别是胃组织切除、胃组织活组织检查或转移性损伤)的评估中表征所述患者/患者组，相对于诊断为转移性结肠直肠癌的患者中建立的对照水平，所述样品展现出下列ー项或多项升高的VEGFA表达水平、降低的神经毡蛋白表达水平和降低的HER2表达水平。本发明还提供了贝伐单抗在制备用于治疗患有或怀疑患有胃肠癌，特别是mCRC的患者的药物组合物中的用途，其中通过本文中所公开的蛋白质标志物/指示物状态(即，相对于诊断为转移性结肠直肠癌的患者中建立的对照水平，升高的VEGFA表达水平、降低的神经毡蛋白表达水平、和降低的HER2表达水平中的一项或多项)来选择或表征患者。或者/另外，本发明还涵盖使用VEGFA、神经毡蛋白和/或HER2作为标志物，如本文中所描述的，测定肿瘤特异性血管数目(其可以例如以升高的ー种或多种内皮细胞标志物，例如，CD31的水平为特征)，其中所述血管数目(和/或ー种或多种内皮细胞标志物的表达水平)的增加指示对将贝伐单抗添加至化学治疗方案敏感或响应的患者，或者对于本文中所描述的方法所针对的患者群体是选择性的。图显示了 图I :对于贝伐单抗对対照的依照肿瘤细胞生物标志亚组的进展前时间的森林图(Forest plot)。图2 :对于神经毡蛋白(图2A)、HER2 (图B)和VEGFA (图C)的肿瘤生物标志数据与进展或死亡前时间(time to progression or death)(中值截留)的关联。对于姆幅图，黒色实线安慰剂(F/F+P/X/X+P)和中值以上的生物标志表达(BA);长虚线(为灰色)贝伐单抗(BV)疗法(F+BV/X+BV)和中值以上的生物标志表达(BA);中等虚线贝伐单抗疗法(F+BV/X+BV)和中值以下的生物标志表达(BB);短虚线，安慰剂(F/F+P/X/X+P)和中值以下的生物标志表达(BB)。图3 :贝伐单抗至进展或死亡的时间对照内皮生物标志亚组的死亡的森林图。
图4:对于⑶31的内皮生物标志数据与进展或死亡前时间(中值截留)的关联；CD31>中值(图4A)、CD31>第2个三分位数(tertile)(图4B)。对于每幅图，灰色实线(在χ轴上在约第610天结束；实情(Fact) =右上矩形中的I):贝伐单抗疗法和低⑶31表达；灰色虚线(实情=右上矩形中的I):贝伐单抗疗法和高⑶31表达；黑色实线(在χ轴上的约第85天时结束；实情=右上矩形中的0):安慰剂和低⑶31表达，黒色虚线(在y轴上的存活概率为约0. 14时变得平整；实情=右上矩形中的0):安慰剂和高⑶31表达。图5 :具有高的和低的微血管密度的代表性患者中的肿瘤和内皮细胞的IHC染色。Nv，血管数目；W，血管体积。图6 :SEQ ID NO: 1，VEGFA的例示性氨基酸序列。图7 :SEQ ID NO:2，HER2的例示性氨基酸序列。图8 SEQ ID N0:3, NRP-I的例示性氨基酸序列。本发明通过以下非限制性实施例进ー步例示。实施例I自參与随机化III期研究的患者收集组织样品，所述随机化III期研究比较将贝伐单抗添加至第一线奥沙利钼-化学疗法方案XELOX和F0LF0X4以治疗转移性结肠直肠癌的结果(N016966 研究，见 Saltz 等，2008，J. Clin. Oncol. 26:2013-2019( “Saltz”)和Hurwitz 等，2004，N. Engl. J. Med. 350:2335-2342( “Hurwitz”))。对涉及血管发生和肿瘤发生的生物标志状态的调查掲示了，相对于整个患者群体中測定的对照水平的4种生物标志的表达水平与改善的治疗參数相关联。特别地，相对于整个患者群体中測定的对照水平展现出升高的VEGFA表达水平、升高的⑶31表达水平、降低的HER2表达水平和降低的神经毡蛋白表达水平中的ー项或多项的患者显示响应将贝伐单抗添加至XELOX或F0LF0X4方案的无进肢存活(progression free survival)延长。患者和免疫组织化学方法总共1401名患者參与N0169966研究，并且来自247名參与者的肿瘤样品可用于生物标志分析。表I中提供了生物标志分析中的247名患者的基线特征该特征一般与总体研究群体的特征相似(见Saltz ;见上文)。表I :基线特征生物标志群体(n=247)
权利要求
1.一种通过对化学疗法方案添加贝伐单抗来改善患有胃肠癌的患者的无进展存活的方法，所述方法包括 (a)自所述患者获得样品； (b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平；并 (c)对相对于在诊断为转移性结肠直肠癌的患者中测定的对照水平具有升高的VEGFA水平、和/或降低的J1ER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。
2.一种用于鉴定对将贝伐单抗治疗添加至化学疗法方案响应或敏感的患者的体外方法，所述方法包括 (a)自怀疑患有或易于患有胃肠癌的患者获得样品；并 (b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平； 由此相对于在患有转移性结肠直肠癌的患者中测定的对照水平，升高的VEGFA和/或⑶31水平，和/或降低的HER2和/或神经毡蛋白水平指示所述患者对将贝伐单抗添加至所述方案的敏感性。
3.权利要求I或2的方法，其中检测VEGFA的蛋白质表达水平。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中检测HER2的蛋白质表达水平。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中检测神经毡蛋白的蛋白质表达水平。
6.权利要求3-5中任一项的方法，其中通过免疫组织化学方法(IHC)来检测所述蛋白质表达水平。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述样品选自下组胃组织切除、胃组织活组织检查或转移性损伤。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述化学疗法方案是基于奥沙利钼的化学疗法方案。
9.权利要求8的方法，其中所述基于奥沙利钼的化学疗法方案是与卡培他滨组合的奥沙利钼的方案、或与甲酰四氢叶酸和5-氟尿嘧啶组合的奥沙利钼的方案。
10.权利要求9的方法，其中所述与卡培他滨组合的奥沙利钼的方案是XELOX方案。
11.权利要求9的方法，其中所述与甲酰四氢叶酸和5-氟尿嘧啶组合的奥沙利钼的方案是F0LF0X4方案。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中与一种或多种抗癌疗法共治疗所述患者。
13.权利要求12的方法，其中所述抗癌疗法是辐射。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在新辅佐或辅助疗法前获得所述样品。
15.—种可用于实施权利要求1-14中任一项的方法的试剂盒，其包含能够测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平的寡核苷酸或多肽。
16.寡核苷酸或多肽用于测定权利要求1-14中任一项的VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平的用途。
17.权利要求15的试剂盒或权利要求16的用途，其包含能够测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平的多肽，其中所述多肽适合于用于免疫组织化学方法和/或是对VEGFA、HER2、或神经毡蛋白特异性的抗体。
18.贝伐单抗用于改善患有胃肠癌的患者的无进展存活的用途，包括下列步骤(a)自所述患者获得样品； (b)测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平；并 (c)对相对于在诊断为转移性结肠直肠癌的患者中测定的对照水平具有升高的VEGFA水平、和/或降低的J1ER2和/或神经毡蛋白水平的所述患者施用与化学疗法方案组合的贝伐单抗。
19.如本文中所描述的发明。
全文摘要
本发明提供了用于改善患有胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的患者的无进展存活的方法，其通过相对于在诊断为胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的患者中的对照水平测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平通过与化学疗法方案组合用贝伐单抗治疗来进行。本发明进一步提供了用于评估患者对与化学疗法方案组合的贝伐单抗的敏感性或响应性的方法，其通过相对于诊断为胃肠癌，特别是转移性结肠直肠癌(mCRC)的患者中的对照水平测定VEGFA、HER2和神经毡蛋白中的一种或多种的表达水平来进行。
文档编号A61K39/395GK102711830SQ201180006497
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月18日 优先权日2010年1月19日
发明者D.福恩兹勒, P.德尔马, S.谢勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司