用于抑制炎性和神经性疼痛的材料和方法

专利名称：用于抑制炎性和神经性疼痛的材料和方法
技术领域：
本发明的一些方面涉及通过使用例如肽使脑衰蛋白响应调节蛋白2(collapsinresponse mediator protein2, CRMP-2)与突触前|丐通道复合体解偶联来抑制疼痛。
背景技术：
炎性疾病和神经损伤可导致失能性疼痛(incapacitating pain),其对于目前可用的治疗选择来说可变 为慢性的且难治性的。阿片样物质的治疗提供缓解作用，但却受到相当大副作用的限制。对于慢性难治性临床疼痛，鞘内递送齐考诺肽(ziconotide)(阻断神经元钙通道的合成芋螺毒素-conotoxin))已被批准，从而鉴定了 N型Ca2+通道(CaV2. 2)可作为治疗慢性疼痛的关键革巴标。Saegusa, H.，et al.，Suppressionof inflammatory and neuropathic pain symptoms in mice lacking the N-typeCa2+channel. EMBO J. 20，2349-2356 (2001)。部分原因在于诊断为慢性疼痛的患者数量增长，而他们中的大多数缺乏有效的治疗。对于用于控制疼痛的新材料和方法有极大的需求。本发明的一些方面力图解决这一需求。发明概述本发明的一些实施方案包括使CRMP-2与CaV2. 2之间的相互作用解偶联的化合物，这些化合物可包括式X-Z，其中X是与选自SEQ ID NO. :12和SEQ ID NO. :13的至少一种多肽具有至少80%同一性的多肽，并且Z是与选自SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO.、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. 9 和SEQ.1D NO. 10的至少一种多肽具有至少80%同一性的至少一种多肽，其中X与Z彼此融合。在一些实施方案中，所述化合物由X与Z通过肽键彼此融合而形成。在一些实施方案中，X是与选自SEQ ID NO. :11和SEQ ID NO. :12的至少一种多肽具有至少90%同一性的多肽。在一些实施方案中，Z是与选自SEQ.1D NO. USEQ.1D NO.3,SEQ.1D NO. 4,SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO.9和SEQ.1D NO. :10的至少一种多肽具有至少90%同一性的多肽。在一些实施方案中，化合物中的X是与选自SEQ ID NO. :11和SEQ ID NO. :12的至少一种多肽具有至少95%同一性的至少一种多肽。在一些实施方案中，X是与选自SEQ ID NO. :12和SEQ ID NO. 13的至少一种多肽具有至少90%同源性的多肽，并且在一些实施方案中，Z是与选自SEQ.1DNO. :1、SEQ.1D NO. 3,SEQ.1D NO. 4 SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1DNO. :8、SEQ.1D NO. :9和SEQ.1D NO. :10的至少一种多肽具有至少90%同源性的多肽，其中X与Z彼此融合。而在另一些实施方案中，X是与选自SEQ ID NO. : 12和SEQ ID NO. 13的至少一种多肽具有至少95%同源性的多肽，并且在一些实施方案中，Z是与选自SEQ.1DNO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9和SEQ.1D NO. :10的至少一种多肽具有至少95%同源性的多肽，其中X与Z彼此融合。在一些实施方案中，X是选自SEQ ID NO. :12和SEQ ID NO. :13的至少一种多肽。并且,在一些实施方案中，Z 是选自 SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4、SEQ.1DNO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9 和 SEQ.1D NO. :10 的多肽。在另一些实施方案中，本发明的化合物是SEQ ID NO. 11。一些实施方案提供治疗患者的方法，其包括以下步骤提供至少一种化合物，例如使CRMP-2与CaV2. 2之间的相互作用解偶联的多肽。代表性的化合物包括但不限于例如SEQ ID No. :11之多肽的化合物。在一些实施方案中，配制所述化合物用于向患者施用。一些实施方案还包括以下步骤向患者施用至少一个治疗有效剂量的所述化合物。在一些实施方案中，单个治疗剂量为约Img至约IOOmg所述化合物/约I千克患者体重。并且在另一些实施方案中，所述剂量为约Img至约20mg所述化合物/约I千克患者体重。而在另一些实施方案中，所述剂量可超出这些范围，并可很容易地为个体患者确定。在一些实施方案中，所述化合物用于治疗哺乳动物，例如小鼠、大鼠或人。一些实施方案包括用于治疗患者的药盒(kit)。这些药盒包含至少一种化合物,例如使CRMP-2与CaV2. 2之间的相互作用解偶联的多肽。代表性的化合物包括但不限于例如SEQ ID No. :11之多肽的化合物。在一些实施方案中，所述药盒包含至少一个治疗有效剂量的根据权利要求1的化合物或其可药用盐。在一些实施方案中，将所述药盒中的所述化合物配制用于注射。在一些实施方案中，所述药盒包含有助保持所述化合物之活性的至少一种其他材料。本发明的一些方面包括用于治疗疼痛和炎症的化合物，其包括式X-Z的化合物，其中X是与多肽S EQ ID NO. :13具有至少80%同一性的多肽，并且Z是与选自SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. :4、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9和SEQ.1D NO. :10的至少一种多肽具有至少90%同一性的至少一种多肽，其中X与Z彼此融合。本发明的一些方面包括使CRMP-2与CaV2. 2之间的相互作用解偶联的化合物。在一些实施方案中，这些化合物包含选自组A之肽的至少一种肽，其中组A包含SEQ.1D NO.1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. :4、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1DNO. 8,SEQ.1D NO. :9、SEQ.1D NO. :10 和 SEQ ID NO. :11。在一些实施方案中，所述化合物包括与选自组A的至少一种肽具有至少90%或95%同一性的肽。在一些实施方案中，所述化合物可包括与选自组A中肽的至少一种肽在严格条件下杂交的肽。在一些实施方案中，用于实践本发明的肽可包含非标准氨基酸。本发明的一些实施方案包括治疗人或动物患者的方法首先鉴定需要此类治疗的患者，然后向所述患者施用至少一个治疗有效剂量的使CRMP-2与CaV2. 2之间之相互作用至少部分地解偶联的至少一种化合物。在这些方法中的一些中，用于治疗患者的化合物选自这样的化合物所述化合物选自组A的肽，其中组A包含SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4,SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO.9、SEQ.1D NO. :10和SEQ ID NO. :11。在一些实施方案中，所述化合物包括与选自组A的至少一种肽具有至少90%或95%同一性的肽。在一些实施方案中，所述化合物可包括与选自组A中肽的至少一种肽在严格条件下杂交的肽。在一些实施方案中，用于实践本发明的肽可包含非标准氨基酸。在一些实施方案中，被治疗的患者已被诊断患有或者有风险发生与病理性炎症相关的疼痛。在一些患者中，所述疼痛可由例如糖尿病性神经病的病症或类似的病症引起。在一些患者中，所述疼痛可以是用另一些化合物治疗例如癌症、HIV-AIDS等病症的结果。在另一些实施方案中，将抑制剂多肽与来自触角足复合体(antennapediacomplex)之螺旋 3 的穿膜妝(penetratin) (RQIKIffFQNRRMKffKK ；Thoren, P. E.，Persson,D.，Isakson, P.， (ioksot; M. , OnfeIt,, A. & Norden, B. (2003) Uptake of analogs ofpenetratin, Tat (48-60)and oligoarginine in live cells.Bioch.Biophys. Res.Comm. 307，100-107)相融合。序列简述SEQ.1D NO. :1 提供多肽 CBD3。SEQ.1D NO. :2提供多肽对照(TAT-乱序肽(TAT-Scramble))，其具有与随机、非特异性多肽序列偶联的、SEQ.1D NO. 13的经修饰TAT序列。SEQ.1D NO. :3提供根据本公开内容的一个示例性多肽序列。SEQ.1D NO. :4提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。SEQ.1D NO. :5提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。SEQ.1D NO. :6提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。

SEQ.1D NO. :7提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。SEQ.1D NO. :8提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。SEQ.1D NO. :9提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。SEQ.1D NO. :10提供根据本公开内容的另一示例性多肽序列。SEQ.1D NO. 11提供这样的多肽，其具有与SEQ.1D NO. 1的多肽CBD3序列偶联的、SEQ.1D NO. 13的经修饰TAT序列。SEQ.1D NO. : 12提供I型人类免疫缺陷病毒的TAT细胞膜转导结构域的多肽序列。SEQ.1D NO. :13用于与根据本公开内容的示例性多肽序列偶联的经修饰TAT序列。附图简述图1A.例示Ca2+通道与CRMP-2之间相互作用的图。图1B.多种CRMP-2肽存在下测量的归一化CaV2. 2结合的图。图1C.以对照或CBD3测量的传感图(sensorgram)。图1D.示出对照或CBD3与CRMP-2体外结合的凝胶。图1E.示出细胞表面上存在CaV2. 2的图像。图1F.示出在过量表达的与GFP融合之CBD3存在下的CaV2. 2的图像。图1G.示出以CaV2. 2或CBD3测量的每个细胞CaV2. 2表达的条形图。图1H.示出在CBDl或CBD3存在下或者两者均不存在(即对照)下的表面CaV2. 2表达水平的免疫印迹。图11.表达CRMP-2或CRMP-2+CBD3之细胞的Ca2+电流密度描记线(trace)。
图1J.示出以CRMP-2或CRMP-2+CBD3测量的电流密度的条形图。图2A.对于对照细胞测量的单位Ca2+浓度对时间的描记线。图2B.对于表达CBD3之细胞测量的Ca2+浓度对时间的描记线。图2C.对于以对照、CBD3转染的细胞或未转染(non-transfected，NT)细胞测量的峰值Ca2+浓度的条形图。图2D.应用TAT或CBD3之前及之后的诱发EPSC的描记线。图2E.以TAT对照或TAT CBD3测量的化的条形图。图2F.以TAT对照或TAT-CBD3测量的双脉冲比值(paired-pulse ratio)变化的条形图。图3A. TAT对照肽存在下用辣椒素而释放iCGRP的时间过程。图3B.用TAT CBD3刺激后释放iCGRP的时间过程。图3C.以TAT对照或TAT CBDE测量的诱发iCGRP的条形图。图3D.以TAT对照或TAT CBD3测量的总iCGRP的条形图。图4A.通过经TAT对照或TAT CBD3处理之TRPVl通道的辣椒素敏感电流的电流描记线。图4B.以TAT对照或TAT CBD3预处理后由辣椒素诱发的峰值电流密度的条形图。

图5A.以TAT对照或TAT CBD3预处理后用辣椒素激发之后测量的血流变化。图5B.用辣椒素激发之后以及用TAT对照或TAT CBD3预处理后测量的血流变化的条形图。图6A.用TAT对照或TAT CBD3预处理的动物中测量的随时间变化的退缩次数。图6B.总退缩次数的条形图用TAT对照或TAT CBD3预处理动物。图6C.以载剂、TAT对照或TAT CBD3测量辣椒素诱发的防伤害行为(nocifensivebehavior)的条形图。图6D.用TAT对照或TAT-CBD3处理后I或4小时测量的在慢性神经性疼痛的ddC模型中测试的缩爪阈值(paw withdraw threshold)的条形图。图7A.显微照片，表达对照质粒之神经元的明视野图像。图7B.显微照片，表达CBD3质粒之神经元的明视野图像。图7C.显微照片，表达对照之神经元的绿色荧光蛋白(EGFP)的黑白版本。图7D.显微照片，表达CBD3之神经元的EGFP的黑白版本。图7E.表达CBD3之单个神经元的去极化描记线。图7F.表达对照之单个神经元的去极化描记线。图8A.在以对照、TAT对照或TAT CBD3追踪的细胞中测量总iCGRP释放之平均％的条形图。图8B.以对照、TAT对照或TAT CBD3处理的来自DRGS的iCGRP含量的条形图。图8D.以对照、TAT对照或TAT CBD3测量的总iCGRP含量的条形图。图9.以载剂(对照)、TAT对照或TAT CBD3处理的DRG在490nm下之吸光度的条形图。图10A.暴露于对照、TAT对照或TAT CBD310分钟之后DRG神经元中对不同剂量辣椒素的TRPVl响应。
图10B.过夜暴露于对照、TAT对照或TAT CBD3之后DRG细胞中对不同剂量辣椒素的TRPVl响应。图11.示出TAT分布的大鼠组织免疫印迹。图12A.以不同CRMP-2肽测量的CaV2. 2与CRMP-2之间的归一化结合。图12B.与CRMP-2或CaV2. 2抗体的免疫沉淀。图12C.与CaV2. 2相结合的CBD3或乱序肽的传感图。图12D.在TAT乱序肽或CRMP-2存在下测量的Ll-GST和Ct-dis_GST融合蛋白与CRMP-2相结合的抗体分析。图12E.示出CAD细胞表面上CaV2. 2的图像。图12F.示出当CBD2过量表达时在细胞表面上未检测到CaV2. 2的图像。图12G.暴露于CRMP-2或CBD3之后测量的CaV2. 2表面表达的条形图。图12H.示出在乱序肽或CBD3之一存在下测量的CaV2. 2水平的凝胶。图121.来自用载体、CRMP-2或CRMP2+CBD3转染之神经元的Ca2+电流。图12J.用载体、CRMP-2或CRMP2+CBD3之一处理之后测量的电流密度的条形图。图13A.例示FIT C-TAT CBD3穿入DRG细胞的微分干涉相差/荧光图像。图13B.与TAT乱序肽或与TAT CBD3共同孵育的DRG细胞的电流描记线。图13C.与TAT乱序肽或与TAT CBD3共同孵育的DRG细胞的电流密度对膜电位的作图。图13D.例示使用与TAT乱序肽、TAT-CBD3或TAT CBD3共同孵育的DRG细胞测量的峰值电流密度的条形图。图13E.应用对照TAT乱序肽或TAT-CBD3之后，板层II神经元中EPSC的描记线。图13F.例示使用TAT乱序肽或TAT CBD3肽测量的sEPSC比值、频率和振幅的条形图。图14A.示出暴露于TAT乱序肽后从脊髓切片释放的iCGRP的条形图。图14B.示出暴露于TAT-CBD3后从脊髓切片释放的iCGRP的条形图。图14C.示出暴露于不同条件下之后从脊髓切片释放的iCGRP的条形图。图14D.用TAT乱序肽或TAT-CBD3测量的释放实验结束时释放的总iCGRP的条形图。图15A.用于测量多种肽对脑膜血流之作用的实验示意图。图15B.示出用辣椒素激发以及暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3之后处理的脑膜血流的描记线。图15C.示出在不同条件下测量的脑膜血流变化的条形图。图15D.示出血流抑制作为TAT-CBD3浓度之函数的图。图16A.暴露于TAT乱序肽或TAT-CGD3后随时间变化测量的退缩的图。图16B.暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3后在阶段2中测量的退缩次数的条形图。图16C.暴露于不同试剂盐水、载剂、TAT乱序肽或TAT-CBD3之后测量的爪水肿的条形图。图16D.暴露于不同试剂载剂、TAT乱序肽或TAT-CBD3之后测量的伤害感受防伤害事件的条形图。
图16E.暴露于不同试剂之后测量的缩爪次数的条形图。图16F.注射FITC-TAT-CBD3之后用抗NeuN抗体FITC神经元染色进行染色的DRG细胞的图像。图16G. DRG细胞在其与NeuN相接触之后的图像。图16H.检测与细胞核相关标记之后的DRG图像。图161.经染色DRG细胞的合并图像。图17A.在旋转棒(rotarod)上之时间作为用载剂、TAT乱序肽或TAT-CBD3之一处理后之时间的函数的条形图。图17B.用载剂、TAT乱序肽或TAT-CBD3处理之后在水迷宫中对于时间测量的潜伏期。图17C.以用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理的量测量的在目的象限或路径长度中耗时量的条形图。图17D.暴露于FITC-TAT-CBD3的用FITC染为绿色的运动神经元的显微图片。图17E 用NeuN标记的神经元图像。图17F.低倍放大下暴露于FITC-TAT-CBD3的示出用NeuN Hoescht染色的运动神经元的合并图像。图17G.与图17E.相同，现为在高倍放大下可视化。

图17H.在高架迷宫测试中的开放或闭合臂中所消耗时间的条形图。图171. TAT乱序肽或TAT-CBD3的在明箱或暗箱中所消耗时间(左图)、转变次数(中图)、移动持续时间(右图)的条形图。图17J.不动持续时间(左图)或不动频率(右图)的条形图。图18A.在TAT乱序肽或CBD3存在下重组CRMP-2-His的免疫沉淀。图18B.免疫沉淀L1-GST和Ct-dis_GST_蛋白与CRMP-2体外结合。图19A.在未处理的细胞和用乱序肽处理的细胞中测量的相对于时间的钙释放。图19B.在未处理的细胞和用CBD3处理的细胞中测量的相对于时间的钙释放。图19C.例示在多种条件下测量的峰值钙释放的条形图。图19D.暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3之后测量的归一化的荧光最大变化的条形图。图20A.暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3之后测量的相对于时间的安培数变化的描记线。图20B.示出用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理的DRG神经元中电流与电压之间关系的图。图20C.在用TAT乱序肽或(5)或TAT-CBD3 (6)处理的DRG神经元中在+5mV mV下测量的电流密度的条形图。图20D.示出作为膜电位之函数的归一化通道计数的图。图20E.用FITC-TAT-CBD3处理的DRG神经元的去卷积图像(deconvolvedimage)。图21A.多种处理TAT乱序肽、TAT-CBD3或《-CTX之后在锥体神经元皮质层中测量的eEPSC的描记线。
图21B.暴露于TAT 乱序肽(6)、TAT_CBD3(11)或 -CTX(5)的 eEPSC 抑制百分比的条形图。图21C.用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理之前及之后从神经元测量的双脉冲比值的条形图。图22k.未处理的DRG神经元和用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理的神经元中测量的iCGRP释放的条形图。图22B.例示在DRG神经元中测量的iCGRP释放的条形图。图22C.始终暴露于高水平K+而测量的在DRG神经元中测量的iCGRP释放的条形图。图22D.在暴露于高水平K+的DRG神经元中测量的iCGRP释放的条形图。图22E.示出在不同条件下测量的从脊髓切片中的iCGRP释放的条形图。

图22F.暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3之后测量的总iCGRP释放的条形图。图22G.在490nm下测量的对照组细胞或暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3之细胞的光密度的条形图。图23A.响应于辣椒素以及不处理(浴)、用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理的通过TRPVI通道的非去敏化电流(nondesensitizing current)描记线。图23B.辣椒素激发和多种处理之后测量的累积峰值电流密度的条形图。图23C.不处理或用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理10分钟之后测量的相对于辣椒素浓度的归一化响应的图。图23D.不处理或用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理过夜之后测量的相对于辣椒素浓度的归一化响应的图。图23E.示出不暴露于肽或暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD310分钟后测量的在任何辣椒素激发中达到半峰值电流所需时间的条形图。图23F.示出不暴露于肽或过夜暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3后测量的在任何辣椒素激发中达到半峰值电流所需时间的条形图。图24A.大鼠组织中TAT-CBD3肽分布的斑点印迹分析。图24B.大鼠脑、CSF或血浆的FITC分析。图24C.动物组织中观察到的归一化荧光倍数的条形图。图24D.腹膜内注射TAT-CBD3之前大鼠的照片。图24E.注射TAT-CBD3之后大鼠的照片。图24F.注射TAT-CBD3之后大鼠的照片。图24G.注射TAT-CBD3之后5分钟大鼠的照片。图24H.不注射或注射TAT乱序肽或TAT-CBD3之后测量的尾扭结动物百分比的条形图。说明为了促进理解新技术之原理的目的，现将参照其优选的实施方案，并且将使用具体的语言来对其进行描述。但是，应当理解的是，并不因此旨在限制该新技术的范围，该新技术所属领域技术的人员通常会想到所考虑的对该新技术之原理的那些改变、修改和其他应用。
N型钙通道是多蛋白质复合物，包含成孔的a-亚基和辅助的a2/S、p和Y亚基。CaV2. 2通道位于背角板层I和板层2中的初级传入终端。CaV2.2的活化引起钙的流入和神经递质(例如，谷氨酸、P物质和降钙素基因相关肽(CGRP))的释放。CaV2.2通道还对伤害感受的传导至关重要，因为对这些通道的阻断减轻痛觉过敏(hyperalgesia)，缺乏CaV2. 2的小鼠表现出提高的对伤害感受的阈值，并且慢性压迫性神经损伤之后CaV2. 2的表达上调。还通过证明小直径的伤害感受神经元(其对于基础热伤害感受以及热和机械痛觉过敏至关重要)中天然存在CaV2. 2的选择性剪接形式(即，外显子37a)而突显了 CaV2. 2在疼痛中的重要性。总之，由于能够控制神经递质的调节释放，N型Ca2+通道是开发新镇痛剂的首要革G标。Zamponi, G. W.等，Scaffold-based design and synthesis of potentN-type calcium channel blockers. Bioorg. Med. Ch em. Lett. 19,6467-6472(2009)。CRMP与多种神经功能障碍有关，所述功能障碍包括阿尔茨海默病(Alzheimer’ sdisease)、神经系统副肿瘤综合征(paraneoplastic neurological syndrome)、脑缺血和中风、神经炎症和唐氏综合症脑(Down syndrome brain)。Ca2+稳态的改变在作为这些疾病之基础的神经元/轴突损伤的机制中似乎是关键的。例如，已在创伤性脑损伤和脑缺血中观察到Ca2+依赖的CRMP-2蛋白水解，且其可能是损伤后轴突再生的限制因素。数据显示，CRMP-2的过量表达以依赖于Ca2+通过CaV2. 2流入的方式提高CGRP的释放。因此，与Ca2+通道相互作用的蛋白质(例如，CRMP-2)代表了用于操控CGRP释放以调节疼痛的新靶标和神经病的未来治疗剂。通过使CaV2. 2与CRMP-2之间的相互作用解偶联，TAT CBD3肽可证明可用于上述疾病。对不能用常规镇痛剂和阿片剂(opiate)治疗的慢性和神经性疼痛，开发钙通道作为治疗靶标已表明很有希望。但是，通道阻断剂(例如齐考诺肽)受限于其送递方法、狭窄的治疗窗以及诸如低血压和健忘等的不良作用，迫使开发更好的抑制剂。靶向蛋白质与钙通道之相互作用的替代策略代表了治疗临床疼痛之药物发现的新途径。例如，药物加巴喷丁通过破坏通道运输、减少神经递质释放以及因此产生的脊椎敏化来靶向电压门控钙通道的a2Sl亚基。近来CRMP-2被鉴定为新的CaV2. 2调节子。Brittain，J. M.等，An atypical role for collapsin response mediator protein2(CRMP-2)in neurotransmitter release via interaction with presynaptic voltage-gatedCa2+channels. J. Biol. Chem. 284，31375-31390 (2009)。CRMP-2 是最初作为脑信号蛋白(semaphorin) 3A的生长锥瓦解介体而鉴定的胞质磷蛋白。CRMP-2已显示调节轴突数量和长度以及神经元极性。CRMP-2与CaV2. 2的相互作用以及CRMP-2的过量表达导致CaV2. 2的表面表达提高和Ca2+电流增强。CRMP-2的过量表达还提高CGRP从背根神经节(dorsalroot ganglia, DRG)中的刺激释放。另外，敲低CRMP-2显著地降低Ca2+电流和递质释放。这些发现的一个合理的推断是合适的通道运输和功能需要CRMP-2与CaV2. 2之间的生化相互作用。如文中所报道的那样，探索了以下假说使CRMP-2-CaV2. 2相互作用解偶联会引起Ca2+电流和神经递质释放的生理相关性降低，并且可抑制慢性的炎性和神经性伤害感受的过度敏感。这些发现表明，转录的反式激活因子TAT CBD3肽(而非TAT对照)在许多疼痛动物模型中有效。TAT CBD3肽诱导的对CaV2. 2的药理阻断在经受福尔马林诱导的触觉高伤害感受行为(tactile hypernociceptive behavior)、眼部施用辣椒素诱发的伤害防卫以及脑膜的神经源性炎症的啮齿动物中产生镇痛作用。TAT CBD3肽在逆转抗逆转录病毒的毒性神经病中观察到的慢性触觉高伤害感受行为中同样有效。TAT CBD3在许多疼痛模型中的镇痛活性表明在传入感觉神经元突触前末梢上的N型电压钙通道是炎性和神经性疼痛行为之间的共有环节。CBD3肽是为阻断CRMP-2与N型钙通道之间相互作用而设计的。如前所述，CRMP2与通道向膜运输从而提高钙电流密度有关。基于这些观察的一个假说是阻断此相互作用会对CaV2. 2的表面表达和电流密度有负面影响。如在此所述的那样，CBD3对这两种蛋白质之间的功能相互作用的影响最终导致神经递质释放的显著降低。由于N型钙通道还存在于初级传入感觉神经元(尤其是A-S和C纤维)的突触前末梢中，CBD3的作用不限于中枢神经系统。外周神经系统中包含CaV2. 2的神经元负责主要通过其在脊髓丘脑束中的连接而在板层I和板层II中传递伤害感受信号。通过这些通道的钙流入是作为P物质和CGRP从这些纤维释放之基础的主要机制。CaV2. 2的药理阻断不仅降低神经递质的释放，而且可降低脊髓板层I中突触后神经元的兴奋性。先前已显示CRMP2调节CGRP从源自背根神经节的初级神经元释放。通过使初级传入感觉神经元中CaV2. 2与CRMP2之间的相互作用解偶联，疼痛信号的传导可被弱化。这一假说的主要障碍是CBD3肽不能穿过质膜。蛋白转导结构域(例如人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1) TAT)可使肽穿透膜。肽与HIV-1TAT的缀合导致CBD3有效转导进入体外、离体和体内的细胞。应用TAT CBD3有效地降低辣椒素和福尔马林诱导的明显伤害感受，表明其能够减弱急性疼痛信号。CaV2. 2的表达在慢性和神经性疼痛的数种动物模型中上调。经过这些通道进入的钙影响A-S和C纤维的重复放电模式。已提出CaV2. 2负责引发与慢性和神经性疼痛病症相关的神经递质释放和兴奋性升高，并且CaV2. 2已成为治疗慢性疼痛的主要治疗靶标。肽-CaV2.2选择性阻断剂Co -芋螺毒素的合成版(prialt >本最近已完成临床试验。但是CaV2. 2的完全阻断不是没有副作用。尽管轻度取决于施用方法，用对人的治疗伴有精神症状、认知损害和体位性低血压，这很可能是由于CaV2. 2在中枢和交感神经系统中的重要性。当前的N型阻断剂的低治疗指数推进了对替代性治疗方法的寻找。TAT CBD3在慢性/神经性疼痛的动物模型中有效地消除对触觉刺激的伤害感受过度敏感。TAT CBD3可允许抑制疼痛过度敏感但不直接阻断CaV2. 2，而是通过抑制CaV2. 2功能之调节子CRMP-2的结合。发现用作镇痛剂的新小分子CaV2. 2抑制剂可引起治疗药理学的提高。先前的报道鉴定了 CRMP-2作为新的CaV2. 2调节子。CRMP-2是最初作为生长锥瓦解而鉴定的胞质磷蛋白，并且可调节轴突数量、长度及神经元极性。CRMP-2与CaV2. 2相互作用，且CRMP-2的过量表达导致CaV2. 2表面表达的提高，Ca2+电流增强，以及CGRP从DRG中的刺激释放。相反，敲低CRMP-2显著地降低Ca2+电流和递质释放。如本文中所报道的那样，使CRMP-2-CaV2. 2相互作用解偶联导致Ca2+电流和神经递质释放的生理相关性降低(图1A)，并且进而抑制持续的炎性和神经性过度敏感。CRMP-2-Ca2+通道解偶 联肽的表征。为破坏体内CRMP-2与CaV2. 2复合物的相互作用，合成了这样的肽，其覆盖CRMP-2的整个长度，包括先前被鉴定为对CRMP-2-CaV2. 2相互作用至关重要的三个CaV结合结构域(CBD1 3)。现在参照(图12)。CRMP-2肽抑制CaV2. 2-CRMP-2相互作用。(图12A)CaV2. 2与覆盖有脊髓裂解物的包容全长CRMP-2的15_mer肽(12个氨基酸重叠)的归一化结合。示出了肽#96的序列(标示为CBD3)。(图12B)在乱序肽或CBD3肽存在下从脊髓裂解物中用重组CRMP-2或CaV2. 2抗体进行的免疫沉淀未拉下CaV2. 2 (上)和CRMP-2 (中)，但拉下了 P -微管蛋白(下)。(图12C)与CaV2. 2胞质环I (LI)和C端的远端(Ct_dis)结合的CBD3 (1/3/5 u M ;实描记线)或乱序肽(1/3/5 u M ;虚描记线)的传感图。监控解离4分钟。RU，共振单位。(图12D)在乱序肽或CBD3肽(IOuM)存在下，Ll-GST和Ct-dis-GST融合蛋白与CRMP-2结合。用CRMP-2抗体探查与LI和Ct-dis结合的CRMP-2。在CAD细胞表面上检测到CaV2. 2 (图12E)，但当CBD3过量表达时没有检测到(图12F)。图12E和12F中比例尺10 ii m om。下方,所示箭头间界定的细胞表面的归一化表面强度(surfaceintensity，SI)。(图12H)显示表面CaV2. 2表达之细胞百分比的总结(n > 100)。(图121)用CaV2. 2抗体探测的表达载体(乱序肽)、CRMP-2的N端区域(CBDl)或CBD3的CAD细胞的生物素化(表面)级分的免疫印迹(n = 3)。(图12J)上方，电压方案(voltageprotocol)。下方，来自过量表达载体(EGFP)、CRMP_2或者CRMP-2+CBD3的海马神经元的示例描记线。(图12K)对于CRMP-2和CRMP-2+CBD3转染的神经元的峰值电流密度(pA/pF)(在+IOmV)。*，p < 0. 05 (相对于 CRMP-2)，t 检验。发现 CRMP-2 肽(484 498 位残基)(CBD3)与CaV2. 2结合(图12A)。从脊髓裂解物中的免疫沉淀证明CBD3肽抑制CRMP-2_CaV2. 2相互作用(图12B ;上 、中)，但不影响微管蛋白与CRMP-2的相互作用(图12B，下)。由于CRMP-2与CaV2. 2的第一细胞内环(LI)和C端的远端(Ct_dis)结合，所以对CBD3是否结合这些区域进行了研究。现在参照图18。CBD3肽抑制CRMP-2与CaV2. 2之间的结合。(图18A)在乱序肽或CBD3肽存在下用重组CRMP-2-His蛋白免疫沉淀(IP)降低了 CaV2. 2的量(i)，但不降低可从大鼠脑中捕获的￠-微管蛋白的量(ii)。在加入CRMP-2-His蛋白之前30分钟加入肽(每种10 ii M)。示出了 12个独立实验的代表性印迹。(图18B)在乱序肽或CBD3肽(IOiiM)存在下，Ll-GST和Ct-dis-GST融合蛋白与CRMP-2体外结合。我们先前已描述CaV2. 2的LI和Ct-dis区域的纯化。用CRMP-2抗体探查与LI和Ct_dis结合的CRMP-2。示出了4个独立实验的代表性印迹。在用脊髓裂解物进行的实验中获得了类似的结果(图18B和18D)。使用表面等离子共振确定了 CBD3肽(而非乱序肽)与固定的LI和Ct-dis蛋白结合(图12C)。此外，CBD3肽破坏CRMP-2与LI或Ct-dis区域之间的相互作用(图12D以及图18B和18C)。由于CRMP-2促进表面CaV2. 2的运输，对CBD3进行测试以确定是否可使CRMP-2与CaV2. 2解偶联以影响运输、表面表达、CaV2. 2活性和Ca2+流入。在CAD神经元细胞系中与CBD3共表达CaV2. 2导致通道几乎完全滞留在胞质聚集体中(图12E 12G)。CAD细胞的表面生物素化显示了 CBD3(而非乱序肽或CBD1)的表达阻止了共表达的CaV2. 2的表面表达(图12H)。另外，在海马神经元中CRMP-2与CBD3的共表达消除了 CRMP-2介导的CaV2. 2电流密度的升高(图121和12J)和CBD3的表达(而非乱序肽对照)，降低了海马神经元中去极化诱导的钙流入(图19A至19C)。由此看来，在体外，CBD3破坏CRMP-2_CaV2. 2相互作用，影响CaV2. 2运输以及Ca2+电流密度。现在参照图19。过量表达的CBD3或TAT-CBD3主要通过N型Ca2+通道降低Ca2+流入。(图19. A和19. B)使用Lipofectamine，用编码CBD3或乱序肽序列的DNA构建体转染体外培养5天的海马神经元，然后加载按比例计的Ca2+敏感性染料Fura-2AM(3 y M)。使用缩时宽视野荧光显微术记录响应于用氯化钾(KCl，30mM)使质膜去极化的[Ca2+]。变化。平均[Ca2+]。，从表达编码乱序肽序列(乱序肽)或CBD3序列(CBD3)之质粒的神经元和未转染(NT)的神经元中获得的响应。在两幅图中，n表示从中记录到Fura-2之神经元数目。(图19C)对于来自对照(n = 11)和CBD3(n = 11)或NT (每种条件n = 14)神经元的平均峰值。响应的总结。(图19D)使用Fura-2AM在DRG神经元中对Ca2+流入进行监测。在室温下将神经元用Fura-2AM加载25分钟，然后用载剂(0. 05% DMSO) UOuM TAT-乱序肽或TAT-CBD3处理10分钟。DRG在随后的成像实验期间浴于L-型通道阻断剂硝苯地平(10 y M ;左边的两个条)或L-和N型阻断剂(10 ii M硝苯地平+2 ii Mo-CTX ;右边的两个条)中。用45mM KCl刺激后监测Fura-2F34(I/F38(l的变化10分钟。值代表4个独立实验中相对于载剂处理细胞(经硝苯地平或经硝苯地平+ -CTX处理的)进行归一化的平均max A (F340/F38tl) 土 SEM(n > 100个细胞)，用星号标记统计显著性(p < 0. 05 ;t检验)。现在参照图13。TAT-CBD3降低DRG细胞中的Ca2+电流和脊髓切片的板层II神经元中的兴奋性突触传递。(图13A)显示FITC-TAT-CBD3强力地渗透入DRG(箭头)而非其他细胞(箭头)的代表性微分干涉相差/荧光图像。在下图中，细胞核用Hoechst染料染色。比例尺(图13B)响应于描记线之上所示电压阶跃(voltage step)的与TAT-乱序肽(10 u M ;绿色)或TAT-CBD3 (10 u M ;紫色)孵育的DRG的代表性电流描记线。(图13C)以b-样条曲线(b-spline line)拟合的b中所示电流的电流-电压关系。将峰值电流相对于细胞电容进行归一化。(图13D)在-1OmV测量与TAT-乱序肽、TAT-CBD3或TAT-CBD3+1 UMco-CTX孵育的DRG的峰值电流密度(pA/pF)。括号中的数字代表受试细胞数。*，p < 0.05，相对TAT-乱序肽。(图13E)处理前(左描记线)、使用IOiiM TAT-乱序肽(中描记线)或10 TAT-CBD3肽(右描记线)后脊髓切片板层II神经元中自发EPSC(sEPSC)的代表性描记线。下图是 放大的描记线。使用电压钳(钳制电压=_70mV)记录突触响应。(图13F) sEPSC频率与振幅的比值。*，p < 0.05，与基线相比。记录使用TAT-CBD3肽后sEPSC频率(而非振幅)的显著降低。通过与人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1) TAT蛋白的转导结构域融合使CBD3具有细胞穿透性，产生易于进入神经元的TAT-CBD3 (图13A)。将TAT-CBD3施用于DRG15分钟降低了 Ca2+电流 60%，这无法通过添加CaV2. 2阻断剂co-芋螺毒素(I u M)而被进一步阻断(图13E和13D)，表明TAT-CBD3对N型通道的选择性。通过在DRG中钙成像得到定性地相似的结果TAT-CBD3通过N型通道选择性地降低K+-诱发的Ca2+流入(图19D)。重要的是，TAT-CBD3不影响DRG中钠电流密度或门控(图20)。现在参照图20。TAT-CBD3不影响DRG神经元中Na+电流。(图20A)自_80mV的保持电位(holding potential)在_70mV至+50mV之间用递增的15ms去极化梯级方案引发的来自背根神经节(DRG)神经元的代表性钠电流描记线。为清楚起见，仅示出从-20至-70的描记线。用10 ii MTAT乱序肽(左)或10 ii M TAT-CBD3肽(右)处理5分钟的DRG的电流响应。(图20B)对(图20A)中例示的用TAT乱序肽或TAT-CBD3处理的DRG神经元的电流-电压(IV)关系的总结(n = 5 6)。(图20C)在+5mV下测量的用TAT乱序肽(n =5)或TAT-CBD3 (n = 6)处理的DRG神经元的峰值电流密度(pA/pF)。(图20D)在稳态活化(m - /V)和快速失活(h - /V)方案期间可用通道的归一化分数(G/V)。所述快速失活方案由以下部分组成_80mV保持细胞，进行在-120至-10mV(10-mV递增)的失活前脉冲电位500ms,而后使细胞变为0mV20ms以测量可获得的电流。使用500ms调节电流(conditioningcurrent)，因为其允许在这些细胞中进行测定的所有电位下使所有内源性钠通道转化为快速失活状态。在活化或失活的两种条件之间，中点(V1/2)和斜率因子(k)没有显著差异(p> 0. 05 ；t检验)。(图20E)用FITC-TAT-CBD3处理5分钟的DRG神经元的代表性去卷积图像，其示出肽的完全穿透(细胞内由FITC荧光(绿色)计量)。将微分干涉相差(DIC)图像与荧光图像叠加以例示非神经元细胞中完全不存在肽(参见具有白色箭头之细胞的实例)。细胞核用Hoechst染色来显示(蓝色)。比例尺30 U m。为确定使CRMP-2与CaV2. 2解偶联是否调节突触传递，在脊髓切片中进行了膜片钳记录用以测量板层II神经元中的突触响应(图13E和13F)，该神经元接收来自表达CaV2. 2的C-纤维初级传入的输入。这些神经元中的sEPSC由谷氨酸释放引起，并反映突触前机制(频率变化)和突触后机制(振幅变化)。向脊髓切片中注入TAT-CBD3使sEPSC频率降低了 57%而不改变振幅，说明是突触前的作用(图13F)。与此相反，TAT-乱序肽对兴奋性突触后电流(eEPSC)频率无影响(图13E和F)。来自脑皮质切片中层V锥体神经元的记录也显示，在TAT-CBD3存在下，从受刺激的突触前末梢中释放谷氨酸的概率降低(图21)。现在参照(图21)。TAT-CBD3降低皮质切片中的eEPSC振幅。(图21. A)在基线5Hz刺激下(黑色描记线)，以及施用10 ii M TAT-乱序肽(绿色描记线)、10 y M TAT-CBD3肽(紫色描记线)或Iu Mo-芋螺毒素-CTX ;红色描记线)的皮质层V锥体神经元中的诱发eEPSC的代表性描记线。使用电压钳记录(Vh = -70mV)以记录突触响应，刺激强度在120-300 ii A范围内，约为阈刺激的2倍。(图21B)在IOiiM TAT-乱序肽(n = 6)、10 y MTAT-CBD3 (n = 11)和I u Mco-CTX(n = 5)存在下，峰值eEPSC的百分比抑制的总结。记录了施用TAT-CBD3肽之后诱发eEPSC之振幅的显著降低(#，p < 0. 05)。(图21C)TAT_CBD3肽显著提高双脉冲比值(PPR)。通过用第一脉冲引发的eEPSC振幅除第二脉冲引发的eEPSC振幅(P2/P1)来计算PPR0女，p < 0. 05, TAT-CBD3相对于预处理(t检验)。

TAT-CBD3降低诱发的CGRP释放。现在参照图22。在DRG神经元和脊髓切片中，TAT-CBD3对K+或辣椒素刺激的递质释放的作用(不影响细胞活力)。释放实验前，成年小鼠DRG神经元在培养基中保存5 7天。(图22A)表示为每孔细胞总iCGRP平均百分含量土 s. e. m. (n = 12孔/条件)的免疫反应性降钙素基因相关肽(iCGRP)释放的条形图。从用含3. 5mM KCl (基础的，B)的普通HEPES缓冲液、含50mM KCl的HEPES缓冲液(S)和再次含3. 5mMKCl的HEPES缓冲液处理的细胞测量的神经肽释放。使DRG过夜暴露于TAT-乱序肽或TAT-CBD3肽(10 y M)(图22. A和22. B)或者包含于高K+暴露之前10分钟以及在其整个过程中(图22. C和22. D)。结果，总TAT肽暴露时间为12小时20分钟(图22. A和22. B)或30分钟(图22. C和22. D)。使用有Dunnett事后检验的AN0VA，星号(* )表示TAT-CBD3与对照(无处理)或TAT-乱序肽之间iCGRP释放的统计学上显著性差异(p < 0. 05)。在所有情况中，高细胞外K+刺激的释放显著高于基础释放。(图22. B和22. D)释放实验结束时测量的iCGRP总含量。在测试条件之间，iCGRP含量无显著差异。(图22E)从脊髓切片释放iCGRP的总结。测量从脊髓切片释放iCGRP :三次3分钟暴露于仅Ifepes缓冲液、含500nM辣椒素的Ifepes缓冲液，然后五次3分钟暴露于仅Ifepes以确立基线。每个柱均为总释放肽百分比/分钟的平均值土SEM(每种条件n = 5 7只动物)。在最后一次Ifepes暴露前，将TAT乱序肽或TAT-CBD3 (10 u M)(图22E)包含于六次3分钟孵育中，总暴露时间为18分钟。TAT乱序肽或TATCBD3不影响iCGRP的基础释放。在TAT处理之间比较诱发释放或由仅辣椒素刺激引起的释放。通过从三个辣椒素刺激的级分(21至27分钟)期间的iCGRP释放中减去在三个基础级分(12至18分钟)期间的iCGRP释放，得到诱发释放，并将其表示为每个处理组的总iCGRP含量百分t匕。在所有情况中，由辣椒素刺激的释放显著高于基础释放。(图22. F)灌注期间组织释放的iCGRP(fmol/mg)总含量和释放实验结束时测量的组织中的剩余量。20 y M TAT肽的脊髓释放数据如图3所示。(图22G)用TAT-乱序肽或TAT-CBD3 (10 u M)处理培养的背根神经节神经元12小时，然后使用MTT比色测定评估神经元存活。数据表示为490nm下相对于对照(0. 01% DMSO，二甲基亚砜；Sigma)的吸收百分吸光度的平均值土S. E. M.(每种条件n=8孔)。每种TAT肽都不影响细胞活力(p > 0. 05 ;t检验；N. S.，不显著)。通过小直径感觉神经元上突触前CaV2. 2的钙进入直接与递质释放偶联。测试了TAT-CBD3调节用10 ii M肽处理的分离的DRG神经元中释放iCGRP的能力。用TAT-CBD3 (而非TAT乱序肽)预处理20分钟或12小时，降低了由50mM氯化钾诱发的CGRP释放，而不影响静息释放(图22A至22D)。另外，总CGRP含量不受肽影响。孵育12小时之后测量的细胞活力未受到任何处理的影响(图22)。现在参照图14。TAT-CBD3降低辣椒素刺激的脊髓切片iCGRP释放。在三次3分钟暴露于仅Hepes缓冲液(白色条)、含肽Hepes缓冲液(白色条)、含500nM辣椒素及肽的H印es缓冲液(黄色条)中测量iCGRP释放，然后暴露于仅H印es (白色条)以重建基线。每个柱代表在每3分钟灌注样品中的iCGRP水平的平均值土SEM，表示为组织中每分钟总肽含量的百分比(n = 7只动物)。包含TAT乱序肽(图14A)或TAT-CBD3 (图14B) (20 u M)，如水平条所示。*，p < 0. 05，相对于不存在辣椒素的基础iCGRP释放(ANOVA，Dunnett事后检验)。这两种肽均不改 基础iCGRP释放(不显著；NS)。(图14C)基础释放为暴露于Hepes加肽的3个级分中释放的iCGRP量。刺激释放为暴露于500nM Cap+肽的3个级分中释放的iCGRP量。通过从三个辣椒素刺激级分(21至27分钟)期间的iCGRP释放中减去在三个基础级分(12至18分钟)期间的iCGRP释放而得到诱发释放，并将其表示为每组中的总iCGRP含量的百分比。在所有情况下，辣椒素刺激的释放显著高于基础释放。使用t检验，&和#，p < 0. 05，相对各自的TAT乱序肽。(图14D) iCGRP (fmol/mg)总含量为在灌注期间和在释放实验结束时自髓组织测量的所释放CGRP的总和。检测了 TAT-CBD3对辣椒素诱发的脊髓切片CGRP释放的影响。这种释放主要发生于神经元的中央末端，所述神经元表达瞬时受体电位香草素I型(TRPVl)通道，已显示其在疼痛转导中起重要作用。用肽灌注不改变基础iCGRP释放(图14A和14B)。然而，与TAT乱序肽(图14C)相比，用20 y M (而非IOuM) ( 0 22E和22F) TAT-CBD3灌注导致辣椒素诱发的iCGRP释放降低，但iCGRP总含量没有差异(图14D)。现在参照图23。TAT-CBD3不影响大鼠DRG神经元中辣椒素诱发的TRPVl响应。(图23A)载剂对照DMSO (浴)、TAT乱序肽或者TAT-CBD3肽处理10分钟(通过刻度移液管(recording pepette)施用)或过夜(培养基中12 16小时)之后响应于300nM辣椒素的TRPVl的代表性非去敏化电流描记线。与先前的报道一致，在不同条件下可观察到TRPVl通道的开启时间的细微差异(同样见下文)。这些可能是因为辣椒素(相对疏水的分子)通过脂膜的差异进入。(图23B)暴露于载剂对照DMSO(白色条)、TAT乱序肽(绿色条)或TAT-CBD3肽(紫色条)10分钟(左)或过夜暴露(右)之后响应于300nM辣椒素的峰值电流密度(PA/pF)的累积汇总数据。数据表示为平均值土S.E.M.。细胞数目示于括号中。(图23C)，暴露于载剂对照DMSO (黑色圆圈)、TAT乱序肽(绿色方块)或TAT-CBD3肽(紫色三角)10分钟(图23. A)或过夜暴露(图23. B)之后响应于多种浓度辣椒素的相对于最大辣椒素诱发电流进行归一化的峰值电流密度(PA/pF)的累积汇总数据。每种条件的细胞数示于括号中。线表示数据的最佳拟合。在任一辣椒素浓度下，对照相对于某一肽的归一化辣椒素响应无差异(双因素ANOVA ；10分钟条件下p = 0. 75，培养基中过夜条件下p =0. 07)。与对照或肽在移液管内孵育10分钟(图23. E)或在培养基中孵育过夜(图23. F)的细胞中达到半峰值电流振幅(秒)所需时间的总结。对照相对于某一肽在任何所测试辣椒素浓度下达到半峰值电流的时间无差异(双因素ANOVA ;10分钟条件下p = 0. 85，培养基中过夜条件下P = 0. 38)，表明组间活化率没有统计学上的差异。TAT-CBD3的描记线中明显的略微不同的开启率可能是因为疏水辣椒素(8甲基-N-香草基-6-壬酰胺)分子进入至TRPVl通道的细胞内结构域而引起电流之过程中的细胞间差异性。选择首图a中所示描记线来反映三种条件的平均电流密度的代表。虽然可获得有更相似开启时间的另一些描记线，但它们不一定是平均密度的最佳代表。TAT-CBD3对DRG神经元TRPVl电流记录(峰值振幅和活化率)无作用，这表明TAT-CBD3不是通过直接抑制TRPVl通道而发挥作用作用。TAT-CBD3影响大鼠体内硬膜(dura mater)血管舒张。现在参照图15。TAT-CBD3降低响应于辣椒素的脑膜血流改变。(图15A)激光多普勒流量测定法(Laser Doppler flowmetry)测量的实验范式(paradigm)。(图15B)在存在TAT乱序肽(30 u M，绿色描记线)或TAT-CBD3 (30 u M，紫色描记线，在施用Cap之前15分钟硬脑膜施用)预 处理的情况下响应于经鼻施用辣椒素(Cap，IOOnM)的中脑膜血流变化的代表性归一化描记线。激光多普勒流量测定法测量于IHz下采集，并且通过对每10个样本取平均值而进行分箱(binned)用于图示。每只动物的数据相对于第一个3分钟的基础数据进行归一化，水平虚线表示计算的基线。纵坐标表示血红细胞流量测量结果(任意单位，AU)。(图15C)在之前向硬脑膜施用或不施用TAT-CBD3(3、10或30iiM)或TAT乱序肽的情况下，经鼻施用Cap后血流变化的总结。辣椒素诱导的血流变化是CGRP依赖的，这是由于其可被先前经硬脑膜施用的CGRP拮抗剂(CGRP8_37)阻断。值为平均值土S.E.M。*，p<0.05，相对于载剂(非配对t检验)。每种条件下测试的动物数目示于括号中。(图15D)血流抑制(相对于平均的TAT乱序肽)百分比的浓度响应曲线给出3. 1±1. liiM(n = 4 5)的 IC50 值。硬膜受三叉神经的辣椒素敏感性感觉神经元支配，其介导与头痛相关的脑膜血管响应。由于感觉神经末端的CGRP释放引起血管舒张，使用测定辣椒素诱导的血流变化的体内激光多普勒血流测定法测试了 CRMP-2的潜在参与(图15A)。辣椒素诱导CGRP依赖的脑膜血管扩张(图15B和15C)，其在几分钟之内回至基线值。在经鼻施用辣椒素之前，经脑膜施用TAT-CBD3以剂量依赖方式抑制了辣椒素诱导的血流变化(图15C和15D)。TAT-CBD3单独施用不改变基础血流血流改变为_6±1，n = 5(载剂)；-9±3，n = 5 (TAT乱序肽)；以及-4±3，n = 4 (TAT-CBD3)。TAT-CBD3降低福尔马林诱导的防伤害行为。现在参照图16。TAT-CBD3降低急性的炎性疼痛和神经性疼痛。(图16A)皮下注射(爪背侧表面)福尔马林(2.5% ;50ia盐水)后退缩次数时间过程，注射福尔马林前30分钟用肽(3 100 ii M ;20 ill爪背侧表面)预处理动物(n = 4 10)。(图16B)肽对福尔马林诱导的阶段1(0 10分钟)和阶段2 (15 60分钟)中退缩次数的影响。*，p< 0.05，相对于注射福尔马林的动物。(图16C)福尔马林诱导爪水肿。注射盐水、福尔马林和福尔马林+肽(100 y M)之后I小时测量的爪厚度。*，p < 0. 05，相对于注射盐水的动物。(图16D)用TAT-CBD3的预处理减弱了辣椒素诱发的防伤害行为。经角膜滴入盐水(40 UL)中的载剂(0.3%DMS0)或肽(所示出的浓度)并记录防伤害行为。5分钟后，经角膜施用辣椒素(Cap ;3iiM，40iiL盐水)并记录防伤害行为。*，p < 0. 05，相对于30或IOOuM 丁八1'乱序肽或311]\0^1'-0803，#，？<0.05，相对于除311]\1 TAT-CBD3 外所有条件(有Dunnett事后检验的AN0VA)。(图16E)用ddC注射一次的动物表现出PWT (毫牛顿；mN)的下降，这在注射后第7天(PID7)被TAT-CBD3剂量依赖地降低。*，p < 0. 05，相对于ddC或TAT乱序妝(有Student-Newman-Keuls事后检验的AN0VA)。(图16F I)用抗-NeuN抗体标记注射FITC-TAT-CBD3之后15分钟分离的DRG。TAT-CBD3 (图16F，FITC ;绿色)在大多数神经元(图16G，NeuN ;红色)中积累。Hoechst (图16H，蓝色)指示细胞核染色。合并的图像(图161)比例尺，IOOii m(图16F I)。所有数据表示为平均值土 SEM。由于抑制CaV2. 2是抗伤害感受的，因此检验了 TAT-CBD3在疼痛动物模型中减弱伤害感受响应的能力。首先，检验了肽对福尔马林诱导的防伤害行为的影响。大鼠中皮下注射(于爪背侧表面)施用载剂(20 U 10.5% DMS0)，30分钟后注射福尔马林(2. 5%于50 yl中)，预期两阶段的福尔马林响应(图16A)。注射福尔马林后，动物立即出现高度的退缩(阶段I)，持续 10分钟，而后为第二退缩时段(阶段2)，60分钟消退。用30或100 y M TAT乱序肽预处理不改变福尔马林测试的任一阶段。相反地，用30或100 ii M TAT-CBD3预处理的动物在这两阶段中均表现出钝化的防伤害行为(图16A和16B)，表明TAT-CBD3抑制感觉神经元直接活化所介导的伤 害感受(阶段I)，且在一定程度上抑制与炎症和脊髓相关的伤害感受(阶段2)。用3 ii M TAT-CBD3预处理不影响福尔马林诱导的行为(图16A和16B)。注射福尔马林之前仅注射肽不诱导任何防伤害行为。与盐水相比，福尔马林(2.5%)引起爪厚度(同侧减对侧)的4倍改变(图16C)，这与炎症后通常观察到的水肿相符。TAT-CBD3不抑制福尔马林诱导的水肿。TAT-CBD3减弱辣椒素诱发的防伤害行为。为确定TAT-CBD3是否对辣椒素诱导的伤害感受有抑制作用，使用了辣椒素眼部擦拭测试(eye-wipe test)。角膜受三叉神经的传入神经支配,后者的 25%表达TRPV1。向角膜施用仅TAT-CBD3不诱导防伤害行为。用30或100 ii M TAT-CBD3预处理30分钟可减弱辣椒素诱导防伤害行为(图16D)，表明TAT-CBD3在作用的外周部位是抗伤害感受的。用3 u MTAT-CBD3预处理不影响防伤害行为；但100 u M TAT乱序肽显示非特异作用，延长伤害感受的响应时间(图16D)。TAT-CBD3减弱ddC诱导神经性疼痛行为。我们随后检验了所述肽在AIDS治疗诱导的疼痛性神经病动物模型中对慢性防伤害行为的影响。常用于AIDS治疗的核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)产生包括疼痛性神经病的副作用。大鼠中单次注射ddC七天之后对肽逆转触觉过度敏感的能力进行评价。单独的TAT-CBD3 对缩爪阈值(paw withdrawal threshold, PffT)没有影响。当腹膜内(1. p.)施用时，TAT-CBD3(而非TAT-乱序肽)引起PWT剂量依赖性的增长(图16E)。在以lmg/kg的剂量1. P.注射之后I小时观测到了触觉过度敏感的完全逆转。注射后4小时，TAT-CBD3诱导的过度敏感逆转降低了 50%，其可能是由于所述肽的降解和生物分布。为探究1.p.注射后肽的分布，采集了注射了 FITC-TAT-CBD3之动物的组织样本。现在参照图24。TAT-CBD3的生物分布和副作用。(图24. A)来自腹膜内注射了25mg/kg TAT-CBD3肽之大鼠的所示组织的斑点印迹分析。使大鼠在注射后15或60分钟时安乐死，将组织冷冻在液N2中。将每份组织的60 yg裂解物结合至PVDF膜并用抗TAT蛋白(其含有存在于TAT-CBD3肽中的转导结构域)的抗体进行免疫印迹。15分钟时，脾中检测到TAT-CBD3，并且其主要集中于腰椎背根神经节(DRG)和脊髓的腰段中。I小时时，还在肾、脑、脊髓中检测到TAT-CBD3，并且其在DRG中大量存在。(图24. B)来自腹膜内注射了 25mg/kg FITC-TAT-CBD3之大鼠的脑、脑脊液(CSF)或血浆的异硫氰酸荧光素(FITC)荧光分析。使大鼠在注射后15或60分钟时安乐死，并且使脑立即溶解于补充有蛋白酶抑制剂的冷的磷酸盐缓冲盐水中。通过心脏穿刺采集了氧化的血液。CSF通过22号针置于腰椎L4与L5水平之间从蛛网膜下隙采集。使用带有滤波器以检测荧光素的Victor X3多标记微孔板读取仪(Perkin Elmer)检测50 U I的脑或液体(三个重复)的荧光(激发/发射=490/530nm)。用线性回归拟合已知FITC-TAT-CBD3量的标准曲线(20个点)(R2 =0. 9729)，并在 400pM和0. 25 y M之间表现出线性，检出限接近 205pM。还显示了 95%置信限。(图24.B)然后将脑样本中平均荧光相对于蛋白质的量(使用BCA测定进行检测)进行归一化，最后对在来自未注射动物之组织中所观察到的归一化荧光的倍数进行作图。将CSF和血浆中的荧光水平先按体积归一化，随后相对于未处理的值进行归一化。注射后15分钟时，经计算的CSF中荧光浓度为约8. 27 PM，其比血浆中的高 95倍。注射后60分钟时，CSF水平的FITC荧光下降 85%，而血浆中FITC中的那些比15分钟时的值高 65%。腹膜内注射20mg/kg TAT-CBD3之前(图24. D)和之后(图24. E-G)的大鼠照片。示出了用 Windows Live Movie Maker 软件(Microsoft Inc.)从高清晰度视频记录(HTC Evo4G,Bellevue,Washington)中提取的代表性的单幅图像。为捕捉此高剂量TAT-CBD3的副作用，在注射所述肽之前用4%异氟烷麻醉大鼠(n = 3)，但也在非麻醉动物中观察到了相似的行为。(图24. E)记录开始于1. p.注射后约15秒的全身脊柱前弯症样扭弯(whole-bodylordosis-like contortion)(黑色箭头)和尾部扭结(tail kinking)(白色箭头)。注射前无明显此类扭弯或尾部动作(图24. D)。扭弯和尾部扭结动作在其首次出现后15秒消失(图24. F)。在60分钟的观察期中只观察到一次扭弯和尾部扭结动作。(图24. H)在多种条件下表现出尾部扭结动作之小鼠的百分比的总结(每种n = 7)。和大鼠相同，小鼠中只观测到一次尾部扭结动作。与大鼠相反，即使在50mg/kg剂量的TAT-CBD3下也没有在小鼠中观察到身体扭弯(n = 7)。注射之后，在DRG(图16F K)、脊髓(见图6E H) (15分钟)和脑(图24A C)(l小时)中检测到所述肽。在1.p.注射20mg/kgTAT-CBD3的动物中观测到瞬时扭弯，但在抑制过度敏感的更低剂量未观察到(见图5E)(数据未示出)。
这些结果说明TAT-CBD3 (其干扰CaV2. 2与CRMP-2的相互作用)，降低急性的炎性疼痛和神经性疼痛行为。TAT-CBD3不引起显著神经行为缺陷。现在参照图17。TAT-CBD3对感觉运动和认知功能无影响，但其有温和的抗焦虑作用。(图17A)从慢速(左)或快速(右)旋转棒跌落的潜伏期。组间旋转棒表现无显著差异(有Dunnett事后检验的AN0VA)。(图17B)在Morris水迷宫中小鼠找到隐藏平台的潜伏期在组间无差异。(图17C)在目标象中限消耗的时间。在目的象限或路径长度中消耗时间的百分比在组间无显著差异(t检验)。(图17D G)1. p.注射(20mg/kg)之后15分钟对进入腹角(ventral horn)神经元中的FITC-TAT-CBD3的摄取。TAT-CBD3 (图17D，绿色，FITC)在用NeuN(图17E,红色)共标记的运动神经元(箭头)中蓄积。细胞核用Hoechst染色(蓝色)。合并的图像显示在低倍(图17F)和高倍(图17G)放大下用NeuN和Hoescht共标记的含FITC-TAT-CBD3神经元。比例尺:100 y m(图17D F) ;40 y m(图17G)。现在参照图17H。评价焦虑相关行为的高架十字迷宫测试。TAT-CBD3既不改变在开放臂或闭合臂中消耗的时间，也不改变进入闭合臂的频率。(i)焦虑相关行为的明暗箱测试。TAT-CBD3不改变明 箱中消耗的时间或对首次进入暗箱的厌恶。用lmg/kg剂量的TAT-CBD3提高了进入明箱的转变次数(*，p < 0. 05，单因素AN0VA)。(j)抑郁或绝望相关行为的悬尾测试。TAT-CBD3不改变不动的持续时间和频率。所有数据表示为平均值土SEM。研究了 TAT-CBD3对动作协调性、运动功能、镇静(旋转棒测试)和海马依赖性记忆(Morris水迷宫测试)的可能的影响。由于TAT-CBD3 (10和50mg/kg ；1. p.)在加速旋转棒测试中无作用，所以降低的退缩和缩爪无法用运动功能受损来解释(图17A)。TAT-CBD3 (10mg/kg ；1. p)在施用后I小时至7天也不影响协调或空间记忆(图17B和17C)，表明TAT-CBD3不影响记忆提取(memory retrieval)。在小鼠注射更高剂量(10和50mg/kg)的TAT-CBD3后，立即观察到尾根处单次扭结和全身扭弯(图24D G)。由于N型通道的药理阻断与焦虑和抑郁相关行为有关，测试了 TAT-CBD3以确定是否可改变这些行为。高架十字迷宫(EPM)和明暗箱测试(LDBT)用于这些测试。这些范式评估了在封闭的黑暗区域(即，暗箱或闭合臂)中躲避与探查新环境(即，明箱或开放臂)的冲突。在EPM测试中，与TAT乱序肽相比，任何剂量的TAT-CBD3既不改变在开放臂或闭合臂中消耗的时间，也不改变进入开放臂和闭合臂的频率(表I)。在LDBT中，虽然在明箱和暗箱中消耗的时间在任何条件之间没有不同，但注射了 lmg/kg TAT-CBD3的小鼠在明箱和暗箱之间的转变次数与TAT乱序肽相比有所提高(数据未示出)。这些结果表明，TAT-CBD3除了提高LDBT中的转换之外似乎不影响焦虑相关行为，支持了轻度抗焦虑的特性。由于当啮齿动物被置于不可逃避的应激情境中时表现出不动的姿势，因此悬尾测试(TST)或强迫游泳测试(FST)中的不动行为被用作抑郁“抑郁”或“绝望相关”行为的量度，其被抗抑郁治疗所减弱。在TST中，与TAT乱序肽相比，任何剂量的TAT-CBD3既不改变不动的时间，也不改变不动的频率(表I)。总体而言，任何剂量的TAT-CBD3都不改变抑郁/绝望相关行为。表I焦虑样和絶望行为
TAT-TAT-CBD3 TAT-CBD3 TAT-CBD3
行为测试孔序肽0.1 mg/kgI mg/kg10 nig/kg
_ 10 mg/kg _ _ _
高架十字迷宫(n)(13)(13)(12)(14)
开放臂进入11.5 ± 1.613.6 ± 1,6 19.7 ± 3.1 20.0 土 6.1
进入开放臂潜伏期5.9 ± 2.310.3 土 2.7 10.1 ::k 2.9 4.6 士 1.9
(秒)
离开开放臂潜伏期14.5 ± 3.117.7 ± 2.5 16.4 ± 3J 11.1 ± 2.1 (#')
闭合臂进入16J 土 2.019.1 土 1.4 26.4 土 4.2 27.4 土 7.0
进入闭合臂潜伏期6,3 ± 2.54.5 土 2.2 2.4 土 2.1 5.3 土 2.2 (秒)
离开用合臂潜伏期14.7丄3.014.9丄2.9 11.1 I 2.6 10.6丄3.5 (秒)
明暗箱(n)(13)(13) (12) (13)
明箱进入8.2 土 0.810.0 土 1.2 13.5 土1.! I1.5 土 1.2
离开暗箱潜伏期(秒)53.0 i 11.566.0 I 36.9 f 5.8 49.5 I 9.6
17.3
悬尾测试(n)(13)(10) (I!) (12)
活跃(抄)22LO 士238.1 士 235.2 ± 239.7 士
11.313.613,0 10.9用1.p.注射TAT肽之后I小时的6周龄C57BL6小鼠进行行为测试，每次测试持续5分钟。对于每个治疗组,值表示为平均值土SEM。动物数示于括号中。这些发现表明施用TAT缀合的CBD3肽干扰CaV2. 2运输至突触前膜，以及TAT-CBD3肽治疗的生理结果包括抑制钙电流、刺激诱发感觉神经元的神经肽释放以及背角神经元中的兴奋性突触传递。破坏CaV2. 2功能之CRMP-2调节的TAT-CBD3实现了适于多种疼痛状态(炎性和神经性的)的治疗窗，而不损害运动功能或更高级的过程。TAT-CBD3影响疼痛信号的确切机制似乎为CaV2. 2的调节。为了阻断CRMP-2与N型钙通道之间的相互作用，设计了 CaV2. 2结合肽CBD3，其在啮齿动物与人之间高度保守，并极少或不含有与其他蛋白质的序列同源性。将所述肽与HIV-1TAT结构域缀合以克服肽之质膜通透性差的障碍。CaV2. 2的药理阻断不仅降低突触前神经递质释放，还可降低脊髓板层I中突触后神经元的兴奋性。用TAT-CB D3处理后降低脊髓板层II神经元突触后sEPSC频率的明确机制可以是感觉神经元神经递质释放(即谷氨酸)的抑制和降低的囊泡再循环这二者。CaV2. 2参与引发与慢性和神经性疼痛病症相关的提高的兴奋性和神经递质释放并在其中发挥至关重要的作用。啮齿动物受伤后，CaV2. 2的基因或药理阻断减弱防伤害行为。此外，在数种神经性疼痛动物模型中CaV2.2的表达上调。Cizkova，D.等Localization of N-type Ca2+channels in the rat spinal cord following chronicconstrictive nerve inj ury. Exp. Brain Res. 147,456-463 (2002)。CaV2. 2 的抑制还是作为吗啡诱导镇痛之基础的一种机制。通过鉴定小直径的伤害感受神经元(其有助于热和机械痛觉过敏)上表达CaV2. 2的选择性剪接变体，进一步突显了 CaV2. 2的促伤害感受作用(pro-nociceptive role)。为确定TAT-CBD3肽对伤害感受的作用，使用了涵盖急性和炎性/慢性伤害感受状态的多种疼痛动物模型。辣椒素眼部擦拭测试的行为结果表明所述肽抑制急性伤害感受。如本文中公开的那样，还观测到了 TAT-CBD3施用至爪背侧表面显著降低了福尔马林测试阶段I和阶段2的退缩次数。还观测到与阶段2相比，TAT-CBD3在福尔马林测试的阶段I中有更强的作用，此不同首先可表明，与炎性疼痛感受相比，CaV2. 2更明显地参与初级伤害感受。福尔马林测试的阶段I由直接刺激伤害感受器而引起，而阶段2涉及一段时间的中枢敏化，其间发生炎性现象。Le, B. D.，Gozariu, M.，&Cadden, S. ff. Animal models ofnociception. Pharmacol. Rev. 53, 597-652 (2001)。因此，由于所述妝在外周注射，阶段 I 中观察到的作用表明TAT-CBD3或是影响伤害感受信号的传递，或是抑制在伤害感受器外周末梢的CGRP或其他神经肽的释放。TAT-CBD3在急性研究中的作用是抗伤害感受的，这一观察结果与对CRMP-2-CaV2. 2相互作用中表现出的活性依赖性调节相一致，表明突触前神经元的兴奋性降低。由于另一些模型的结果清晰地表明对CGRP释放的抑制，因此这可解释福尔马林测试阶段I中TAT-CBD3肽的作用。如果TAT-CBD3的确抑制CGRP的外周释放，那可期望水肿缩小。但是，TAT-CBD3肽不抑制福尔马林诱导的水肿。虽然尚未完全清楚外周炎症过程的复杂性及其与伤害感受的关系，但水肿可响应于数种可从非神经元的细胞释放的炎症介质而发生。因此，仅CGRP释放的抑制可能不足以降低水肿。TAT-CBD3在伤害感受行为和水肿中的不同作用表明在这两种炎性组分之间缺乏共有的机制。发现5-羟色胺受体拮抗剂抑制2. 5%福尔马林诱导的防伤害行为，但不抑制水肿，这支持了上述观点。Doak，G. J. & Sawynok, J. Formalin-1nduced nociceptive behavior and edema involvementof multiple peripheral5-hydroxytryptamine receptor subtypes. Neuroscience. 80,939-949 (1997)。此外，当外周施用时，吗啡抑制角叉菜胶诱导的痛觉过敏而不抑制水肿；而当全身注射时，吗啡降低水肿、血浆外渗和炎性痛觉过敏。因此，尽管TAT-CBD3肽不抑制福尔马林诱导的水肿，但不能排除对神经递质释放的作用作为疼痛模型中观察到的外周抗伤害感受作用的机制。另外，这些发现说明，在HIV治疗诱导的外周神经病动物模型(慢性神经性疼痛模型)中，TAT-CBD3抑制了触觉过度敏感。该模型采用抗逆转录病毒治疗2’，3’ - 二脱氧胞苷(ddC)来诱导小纤维逆死性神经病(small fiber dying back neuropathy),其可见于治疗后的AIDS患者，归因于钙缓冲的降低。全身性施用TAT-CBD3逆转了 ddC诱导的伤害感受行为，表明CRMP-2与CaV2. 2的相互作用对神经递质释放的持续作用。与该假说一致的是，另一些研究者也表明CaV2. 2介导的脊髓中增强的神经递质释放对于炎性疼痛的维持十分重要。尽管N型通道的药理抑制剂在治疗难治性或慢性疼痛病症中有前途的潜力，其狭窄的治疗窗为其蒙上了阴影。动物和临床研究中齐考诺肽(Prialt)的鞘内递送导致众多的有害副作用，包括学习和记忆受损、 运动协调受损以及焦虑/抑郁提高。Snutch，T.P.Targeting chronic and neuropathic pain the N-type calcium channel comesof age. NeuroRx. 2，662-670 (2005)。在比体内降低过度敏感所需剂量高出50倍的剂量下，TAT-CBD3表现出温和的运动损害(瞬时的尾部扭结和身体扭弯)，但在这些动物中对运动协调、记忆提取或焦虑和抑郁相关行为没有影响。值得注意的是，TAT-CBD3具有与在缺乏CaV2. 2的动物所观察到的相一致的温和抗焦虑作用。通过全身性递送TAT-CBD3而观察到的毒性的相对缺乏为它的治疗潜力提供了有希望的证据。这些发现说明TAT-CBD3允许抑制疼痛过度敏感但不直接阻断阻断CaV2. 2，而是通过抑制CaV2. 2功能之调节子CRMP-2的结合。这些发现也代表了潜在地用于治疗临床疼痛的新方法。本文中公开的化合物的治疗剂量可通过常规调整多种制剂中活性化合物的期望水平来确定。准确的用量可随不同患者而改变，其部分取决于例如以下因素患者的体重、年龄、性别、健康状况、遗传因素以及当使用本发明化合物时可能还给予患者的其他治疗化合物。所述化合物(例如TAT-CBD3)的水平在每kg患者体重约Img至约IOOmg活性成分的范围内有效。但是其他剂量也在请求保护的发明的范围之内。实验材料和方法动物。涉及动物及其管理的流程根据Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals (美国国家卫生研究院(National institute of Health)出版物85-23，Bethesda, MD，USA)，并经印第安纳大学医学院机构动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the Indiana University Schoolof Medicine)批准。CDl小鼠(3 6月龄)和Sprague-Dawley大鼠(大小为100 150克)购自Harlan实验室(Indianapolis, IN)并在印第安纳大学实验动物研究中心(LaboratoryAnimal Research Cente r, LARC)饲养。动物饲养在22°C光控房间中的笼子中。可自由获取食物和水。分离和培养用于电生理学的原代海马神经元。完全按照先前已描述的方法，由切割自出生后I天(PNl)之大鼠的海马制备大鼠海马神经元培养物。在由以下组成的培养基中培养细胞含有2% NuSerum>5% NS21的神经培养基(Neurobasal medium)，补加有青霉素 / 链霉素(100U/mi ；50 u g/ml) >0.1mM L-谷氨酸和 0. 4mM L-glutamax (Invitrogen)。铺板之后24小时添加胞嘧啶P-D-呋喃阿拉伯糖苷(5iiM;Sigma)以降低非神经元细胞的数量。在培养4天后以及其后每周两次将生长培养基的一半用不含胞嘧啶P-D-呋喃阿拉伯糖苷的培养基替换。用于钙成像的原代海马神经元的分离和培养。根据IACUC批准的方案和先前发表流程由PNl大鼠的幼鼠制备海马神经元的原代培养物。对于荧光测量，将神经元平铺于玻璃底的培养皿(Petri dish)中，无需如前述地预铺神经胶质。铺板后24小时添加加有15 u g/ml5-氟_2’_脱氧尿苷的35 u g/ml尿苷溶液以抑制非神经元细胞的增殖。在37°C，5% CO2/空气气氛下,将培养物培养在补充有10% NuSerum(BD Bioscience, Bedford, MA)和27mM葡萄糖的MEM中。用于iCGRP释放的感觉神经元的分离和培养。使用我们先前开发的流程从成年啮齿动物中分离感觉神经元。将雄性Sprague-Dawley大鼠在填充CO2的室(chamber)内处死。将所分离的脊柱切成对半，移出脊髓，然后将DRG收集在灭菌的Puck溶液(无Ca2+、Mg2+的Hank平衡盐溶液)中。对于大鼠DRG，将神经节转移至含有lmg/ml胶原酶IA和2. 5mg/ml分散酶(dispase)的F-12培养基中并在37°C培养30分钟。细胞在室温用DNA消化I分钟，然后离心以除去含酶的上清液。将沉淀重悬于补充有NGF(30ng/ml ；Harlan)的F-12培养基中，并用火焰烧过的移液管机械离散。将所分离的大鼠细胞( 1. 5 X IO5个细胞/ml)铺到包被有聚_D_赖氨酸和层粘连蛋白的盖玻片。在37°C和3% CO2下将大鼠DRG培养物培养在补充有NGF(30ng/ml)的F-12培养基中。将所分离的小鼠神经元以3 5X IO4个细胞/孔的密度铺于24孔板的经包被孔中。在37°C下5% CO2气氛中将培养物培养在经补充的F-12培养基中。用于电生理学的感觉神经元的分离和培养。如上所述对来自年轻成年大鼠的DRG( 150g)进行分离和培养。简要地，通过用分散酶/胶原酶混合物(cocktail)组合处理以及通过用尖端内径降低的一系列火抛光的玻璃移液管机械破坏而使从年轻成年大鼠的脊髓腰段中分离的D RG离散。将所得的单细胞悬液铺于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，并在补充有10%胎牛血清(FBS) (Hyclone, Logan, UT, USA)和100单位/ml青霉素和100 u g/ml 链霉素的 Dulbecco，s 改良的 Eagle，s 培养基(DMEM ) (Gibco, Invitrogen,Grand Island, NY, USA)中在 37°C和 5% CO2 下培养 12 16 小时。儿茶酌■胺A 分化的(Catecholamine A Differentiated, CAD)细胞。在 37°C和5% CO2(Sarstedt, Newton, NC)下，将CAD细胞培养在补充有8 %胎牛血清(FBS ；Sigma,St. Louis, MO)和I %青霉素/链霉素(100%贮存液，10, 000U/ml青霉素G钠和10，000 u g/ml硫酸链霉素)的Ham' s F12/EMEM培养基(GIBC0，Grand Island, NY)中。细胞每6 7天以1: 25的稀释度传代。瞬时转染。如先前所描述的那样，使用Lipofectamine2000 (Invitrogen) WcDNA转染贴壁的培养物。用这种方法在海马神经元中通常可达到转染效率为约2 3%，在DRG中为35 40%，而在CAD细胞中为75 80%。通常情况下，以等量的不同cDNA构建体转染培养的细胞，且实验在2天后进行。脑裂解物和突触小体(synaptosome)的分离。突触小体(即，富集的神经末梢)如所述从 PNl 或成年 Sprague Dawley 大鼠(Harlan Labs. , Indianapolis, IN)中制备。样品在改良的 RIPA 缓冲液(50mM Tris-HCl (pH8), I % nonidet P-40 (NP-40/Ig印al)、150mMNaCl,0. 5%脱氧胆酸Na和ImM EDTA,并补充有新鲜添加的蛋白酶抑制剂1 U g/ml亮抑酶肽、2 ii g/ml 抑肽酶、ImM PMSF(Sigma),与蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science,Laval, Quebec) 一起)中裂解。从突触小体纯化/富集Ca2+通道。为了制备CaV2. 2的丰富来源用于far-Western分析(见下文)，将来自Pl新生大鼠脑的突触小体用洋地黄皂苷增溶，并如先前所描述的那样通过WGA-琼脂糖凝胶色谱进行富集。简要地，将30个PNl新生大鼠脑在180ml的320mM蔗糖中用玻璃-特氟龙匀浆器进行匀浆。短暂离心(5000rpm，2分钟)后，将上清液离心(42，OOOrpm, 60分钟)。膜用1. 2%洋地黄皂苷、80mM磷酸钠缓冲液(pH7. 4)增溶20分钟。如前所述通过离心除去未被增溶的物质的物质，将上清液(S3)倒入40ml WGA-琼脂糖凝胶柱(50ml/h)中。在4°C下孵育I小时后，将柱以50ml/小时的流速用10倍柱体积的0. 1%洋地黄皂苷、75mM NaCl、50mM磷酸钠、IOmM Tris-HCl (pH7. 4)洗涤。将结合于WGA-琼脂糖凝胶柱的糖蛋白以50ml/hr的流速用相同缓冲液中的IOOmM N-乙酰-D-葡糖胺(Sigma, St. Louis, MO)洗脱。收集3毫升级分,并通过BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific, Shelbyville, IN)测定每个级分的蛋白质浓度。为进一步富集Ca2+通道，将WGA-柱级分与200 肝素-琼脂糖在冰上孵育4小时。树脂用 0. 2% CHAPS、pH7. 4 的 IOmM Tris-HCl 洗涤 4 次，用 pH7. 4 的 IOmM Tris-HCl洗涤 I 次。用 IOOiU 的 5% SDS、20mM 二硫苏糖醇、pH6. 8 的 125mM Tris-HCl、10%蔗糖、20mM EDTA在50°C下温和地提取Ca2+通道30分钟。肽spots阵列和Far Westerns。使用SPOTS-合成法构建跨越大鼠CRMP-2全长的肽阵列(10 15mer)。使用标准的9-芴基甲氧羰酰基(Fmoc)化学在用聚乙二醇间隔物(Intavis AG, Cologne, Germany)预先衍生化的纤维素膜上合成所述肽。使用Intavis MultiPep仪器(robot),将Fmoc保护并活化的氨基酸(Intavis)点样于150mm乘IOOmm 膜上的 20 30 阵列中。膜用抗 CaV2. 2 的抗体(Calbiochem Inc, La Jolla, CA)以far-Western方式探查。简要地,将肽(10 15—mer)固定于硝酸纤维素膜上,然后在CAPS缓冲液(IOmM CAPS (pHl 1.0)和20%甲醇)中浸泡30分钟，用TBST洗一次，然后在轻微摇动下在含5%脱脂乳的TBST中封闭I小时，最后与经纯化的富集有Ca2+通道的突触小体级分在室温轻微摇动下孵育I小时。接着，将膜与针对CRMP-2的一抗在室温轻微摇动下孵育2小时，然后用TBST洗涤。最后，将膜在二抗(辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔抗体；I 10, 000)中孵育45分钟，在TBST中洗涤30分钟，并且使用增强化学发光进行显影。体外蛋白质结合测定。使用Vector NTI (v. 11 ;Invitrogen)软件设计引物以扩增与P3大鼠脑cDNA的大鼠CaV2. 2cDNA的第一胞质环(LI ;氨基酸356至483)和C端的远端(Ct-dis;氨基酸2133至2348)相对应的区域。所述引物包含限制位点(Bam HI或BglII(5’)以及EcoRI或MfeI (3’))以有助于克隆。除了 GST标签，该载体还包含Glu标签(6个氨基酸的序列(EYMPME))。用指定的限制酶酶切消化正确扩增的PCR产物和母体pGeX-3X-Glu载体，然后在琼脂糖凝胶上电泳提取。对所提取的DNA进行定量(Nanodrop 1000, Thermo Scientif ic),使用6 :1和3 :1的插入片段与载体的摩尔比进行连接。将连接物转化到XL-10E. Coli中，并使用菌落PCR对菌落进行筛选。通过双脱氧测序(Cogenics,Houston,PA)进一步验证具有正确大小的插入片段的那些菌落。如先前所描述的那样5纯化GST-Glu标记形式的CaV2. 2细胞内环，只是在结合实验前将蛋白质透析到含有 IOmM HEPES (pH7. 4)、IOOmM NaCl 和 IOmM CaCl2 的缓冲液中。在400 ill的总反应中，在TAT对照或TAT CBD3肽(10 U M)存在下，将带有多种CaV2. 2胞质环构建体的单克隆Glu抗体-饱和蛋白G珠(GE Healthcare)与大鼠脑突触小体蛋白质孵育。反应在4°C下翻滚(end over end)孵育过夜，然后在4°C与谷胱甘肽纤维素孵育2小时。之后样品用超过结合缓冲液1000倍的量洗涤3次，在40 ill的SDS凝胶缓冲液中洗脱蛋白质并将其煮沸5分钟，其后每次测定取20 u I进行SDS-PAGE，并对CRMP-2进行免疫印迹分析。免疫印迹。如先前所述的那样进行。通过与20iU50%的蛋白A/G珠(Pierce)孵育I小时将大鼠脑突触小体预净化。然后将经净化的裂解物与多种一抗或者作为对照的兔或小鼠同种型特异性IgG(Sigma)孵育过夜。通过与裂解物/抗体混合物在4°C下孵育2小时，用新鲜的蛋白A-琼脂糖(对于兔多克隆抗体)或蛋白A/G-琼脂糖(对于小鼠多克隆抗体)珠(20 Ul的原珠浆体/样品)回收抗体捕获的复合物。然后珠用裂解缓冲液洗涤3次。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳前，将蛋白质样品在Laemmli样品缓冲液中煮沸5分钟。将蛋白在使用4%浓缩胶的5、7. 5、10或4 15%分离胶上分级。通过SDS-PAGE (4 12%聚丙烯酰胺梯度凝胶)分离10 y g蛋白质并将其电泳转移到 PVDF 膜(Invitrogen)上，用特异性抗体测定 CRMP-2 (Chemicon Int. ,Billerica,MA)和 CaV2. 2 蛋白的存在。将膜在室温下在 TBST(pH8. 0 的 25mM Tris-Cl、125mM NaCl、0. 1%至2%聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20))中的5%脱脂奶粉中封闭I小时。用一抗在室温下孵育2小时或者在4°C下孵育过夜。与一抗和二抗(山羊抗兔或抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(1: 10000 ;Stressgen, Ann Arbor,MI))孵育之后,将印迹在TBST中全面地洗漆并用增强化学发光Western印迹底物物(Thermo Scientific)进行探查,然后暴露于胶片。当胶片不饱和时，印迹曝光持续一段时间以确保产生印记。然后使用Un-Scan-1tgelV6.1扫描软件(Silk Scientific Inc. ,Orem)对胶片进行扫描、数字化以及量化，将分析限定于线性范围内。细胞表面的生物素化。如先前所描述的那样进行生物素化。在4°C下，将用对照载体或质粒(其包含编码CRMP-2 (CBDl)之N端80个氨基酸或15个氨基酸之肽CBD3的区域)转染的CAD细胞与2-(生物素酰胺基)乙基_1，3' -二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(lmg/mg蛋白质；Pierce)在冷PBS(pH8.0)中孵育30分钟。过量的生物素用含IOOmm甘氨酸的PBS淬灭，并用冰冷的PBS洗涤3次，将所得沉淀重悬于RIPA裂解缓冲液中。将重悬的沉淀研磨10次(25号针)并于100，OOOXg离心20分钟。通过在4°C下吸附在链霉亲和素-琼脂糖珠(Novagen)上2 4小时使生物素化蛋白质与净化的增溶物(solubilizate)分离。将珠用RIPA缓冲液洗涤3 5次，并通过与含有2% Triton X-100和650mm NaCl的RIPA缓冲液在30°C下翻滚孵育I小时将所结合的生物素化蛋白质从珠上温和地洗脱下来。用CaV2. 2抗体对生物素化的级分进行免疫印迹。

表面等离子体共振(surfaceplasmon resonance, SPR)。在 TAT CBD3 或 TAT 对照肽与CaV2. 2L1-或Ct-dis-GST融合蛋白之间的结合分析用BIAcore3000仪器(BiacoreAB, Uppsala, Sweden)通过表面等离子体共振进行测定。简要地，结合测定使用HBS-EP缓冲液(pH7. 4 的 0. 01MHEPES、0. 15M NaCl、3mM EDTA和 0. 005%表面活性剂 P20)作为运行缓冲液。将如先前所描述的那样纯化的CaV2. 2L1-和Ct-dis-GST融合蛋白在HBS-EP缓冲液中稀释，并在使用K1NJECT命令的同时以10 u I/分钟的流速注射于4个流动细胞表面。通过以20 u I/分钟的流速注射10 ill的HBS-EP缓冲液中的0. 05% SDS进行表面再生。用BIAevaluation软件版本3. 0 (BIAcore Inc.)将与阴性对照肽表面的背景结合(对照)从所有的结合曲线中减除，并使用GraphPad Prism版本4. 0 (Graph-Pad Software Inc. , SanDiego, CA)进行作图。异硫氰酸荧光素标签的TAT-CBD3的荧光探测。雄性Sprague-Dawley大鼠接受FITC-TAT-CBD3 (10mg/kg)的腹膜内(1.p.)注射。注射后15分钟和60分钟使大鼠在CO2中安乐死并收集组织样品。安乐死之后立即采集脑、肝、肾、腰部背根神经节、三叉神经节和腰部脊髓的样本，并在补充有蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲盐水中进行匀浆。分析之前净化组织样本。通过经由心脏穿刺采集氧化血液而获取血浆样本。将全血样本在2000Xg下离心10分钟以允许血浆层与白细胞及红细胞层分离。如先前所描述的那样，脑脊液(CSF)通过22号针插于腰椎L4与L5水平之间从蛛网膜下隙采集。用具有允许检测荧光素之滤波器参数(激发/发射=490/535nm)的Victor X3多标记板读取仪(Perkin Elmer)对50 ii I每个样本中的FITC荧光水平进行测定，并与FITC-TAT-CBD3的标准曲线进行比照。MTT细胞活力测定。在37°C、5% 0)2下，将DRG神经元与TATCBD3(10iiM)或TAT对照(IOiiM)孵育过夜(12小时)。然后，向每个孔添加100iilMTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5- 二苯基溴化四唑；(5g/L, Promega)]。孵育2小时后,根据制造商说明，使用Victor3V多标记板读取仪,通过测量490nm的吸光度对细胞活力进行评价。确定了相当于对照的百分吸光度。海马神经元的全细胞膜片钳记录。在室温下，使用EPClO放大器(Amplifier)(HEKA Electronics, Germany)对原代培养的海马神经元进行全细胞电压记录。电极用P-97 电极拉制仪(electrode puller) (Sutter Instrument, Novato, CA)由薄壁硼娃酸盐玻璃毛细血管(Warner Instruments,Hamden, CT)拉制,使当填充内部溶液后最终电极电阻为2 3MQ。记录Ca2+电流的内部溶液包含(单位为mM) :1 IOCsCl、5MgS04、10EGTA、4ATPNa2-ATP 和 25HEPES (pH7. 2，290 310m0sm/l)。外部溶液包含(单位为 mM) :128NaCl、5KCl、IOTEA-Cl、10BaCl2、lMgCl2、IOD-葡萄糖和 10HEPES(pH7. 3，310 315m0sm/l);临用于阻断电压门控Na+通道和L-型Ca2+通道之前分别添加I y M TTX和I y M硝苯地平。用放大器补偿全细胞电容和串联电阻。常规地应用串联电阻补偿(70-80%)。只有当密封电阻高于IGQ且串联电阻低于10MQ时才将细胞考虑在内。线性泄露电流数值上减去P/4。信号在IOkHz滤波并在10 20kHz数字化。使用Fitmaster和origin8.1 (OriginLab Corporation, MA, USA)进行分析。对于活化曲线，使用公式 G = I/(Vffl-Vrev)计算通过离子(Ca2+)通道的电导(G)，其中Vmv是逆转电位，Vm是对电流进行记录的膜电位，I是峰值电流。将活化和失活曲线拟合至玻耳兹曼函数(Boltzmann function)G/Gmax = I/ {1+exp [ (V-V50) /k]}，其中G是峰值电导，Gmax是拟合的最大G，V50是半活化电压，k是斜率因子。特定脉冲方案的其他细节在结果内容或


中描述。辣椒素诱发的来自DRG的TRPVl电流的电生理学记录。如先前所描述的那样，使用标准技术在成年大鼠DRG中进行全细胞膜片钳记录。外部溶液由以下组成(单位为mM)145NaCl、5KCl、lEGTA、4MgCl2、10HEPES、10葡萄糖，pH7. 4 ;而内部溶液包含以下(单位为mM) : 130K-天冬氨酸盐、20KC1、1EGTA、IMgCl2UOHEPES, 10 葡萄糖，pH7. 4。在响应于一系列辣椒素(30至3000nM)应用而记录的峰值振幅处测量电流振幅，并通除以细胞电容而相对于细胞大小(pA/pF)进行归一化。对于急性暴露(10分钟)，将DMS0、TAT对照(IOyM)或TAT CBD3 (IOiiM)回填于刻度移液管中。对于过夜处理，将DMSO、TAT对照(IOyM)或TATCBD3 (IOiiM)添加至培养基，并且将神经元孵育12 16小时。将数据表示为平均值土SE。使用单因素ANOVA用于统计学分析，当p < 0. 05时认为是统计学上显著的。来自感觉神经元的全细胞膜片钳记录。在室温下，使用EPC10放大器(HEKAElectronics,Germany)对初级感觉神经元进行全细胞电压记录。电极用P-97电极拉制仪(Sutter Instrument, Novato, CA)由薄壁硼娃酸盐玻璃毛细血管(Warner Instruments,Hamden, CT)拉制，使填充内部溶液后最终电极电阻为2 3MQ。记录Ca2+电流的内部溶液包含(单位为 mM) :150CsCl2、10HEPES、5Mg-ATP 和 5BAPTA (用 KOH 调至 pH7. 2)。外部溶液包含(单位为mM) IION-甲基葡糖胺(NMG)、2CaCl2、30TEA-Cl U0HEPES和10葡萄糖；临用于阻断电压门控Na+通道和L-型Ca2+通道之前分别添加I y M TTX和I y M硝苯地平。用于记录Na+电流的细胞内溶液包含(单位为mM) :1IOCsCl、5MgS04、10EGTA、4ATPNa2-ATP 和 25HEPES(pH7.2，290 310m0sm/L)。外部溶液包含(单位为 mM) :1OONaClUO 氯化四乙铵(TEA-Cl)、lCaCl2、lCdC12、lMgCl2、IOD-葡萄糖、44-AP、0.1NiCl2UOHEPES (pH7. 3，310 315m0sm/L)。用放大器补偿全细胞电容和串联电阻。常规地应用串联电阻补偿(70-80%)。只有当密封电阻高于IGQ且串联电阻低于IOMQ时才将细胞考虑在内。线性泄露电流数值上减去P/4。信号在IOkHz滤波并在10 20kHz数字化。使用Fitmaster和origin8.1 (OriginLab Corporation, MA, USA)进行分析。对于活化曲线，使用公式 G = I/(Vffl-Vrev)计算通过离子(Ca2+)通道的电导(G)，其中Vmv是逆转电位，Vm是记录电流的膜电位，I是峰值电流。将活化和失活曲线拟合至玻耳兹曼函数G/G_ = I/{1+exp [ (V-V50)/k]},其中G是峰值电导，Gfflax是拟合的最大G，V50是半活化电压，k是斜率因子。对于急性暴露(10分钟)，将DMSO, TAT乱序肽(10 ii M)或TATCBD3 (10 U M)回填于刻度移液管中。对于过夜处理，将DMS0、TAT乱序肽(IOiiM)或TAT CBD3 (IOuM)添加至培养基，并且将神经兀孵育12 16小时。数据表不为平均值土SE。TRPVl介导的电流的活化率的差异是许多实验室的常见观察结果(参见例如Gunthorpe,M. J. ,Harries,M. H. ,Prinjha,R. K. ,Davis, J. B.，& Randall,A. )。Voltage-andtime-dependent properties of the recombinant rat vanilloid receptor(rVRl).J. Physiol. 525Pt3 :747-59.，747-759 (2000)。通常认为，不同的开放率反映辣椒素((8-甲基-N-香草基-6-壬酰胺))的疏水性，因为其必须到达TRPVl通道的细胞内结构域以引发电流。结果，辣椒素(一般在乙醇内重建(reconstitute)，然后稀释成水溶液)穿过脂质双层进入细胞可因细胞而异。选择图24A中所示描记线以反映代表三种条件下平均电流密度的电流。虽然可获得有更相似开启时间的另一些描记线，但它们不一定是平均密度的最佳代表。

脊髓切片中的全细胞膜片钳记录。如先前所报道的那样，(Baba，H.等.Removalof GABAergic inhibition facilitates polysynaptic Afiber-mediated excitatorytransmission to the superficial spinal dorsal horn. Mo1. Cell Neurosc1. 24,818-830 (2003))，在乌拉坦(urethane)麻醉下(1. 5 2. Og/kg,1.p.),从小鼠(3 5 周龄)中取出一部分腰部脊髓(L4 L5)，保存于预氧化的冰冷Krebs溶液中。将脊髓节段放置在琼脂块形成的浅槽中并粘于微切片机(microslicer)刀架的底部。横向切片(600 y m)在振动微切片机上切制。实验前，在36土1°C下用经95% O2和5% CO2饱和的Kreb’ s溶液灌注(8 IOml/分钟)所述切片I 2小时。Krebs溶液包含(单位为mM) :NaC1117、KC13. 6、CaCl22. 5,MgCl2L 2,NaH2PO41. 2、NaHC0325 和葡萄糖 11。以电压钳模式由板层 II 神经元获得全细胞膜片钳记录。在有透射照明的解剖显微镜下，清晰可见胶状质(substantiagelatinosa, SG,板层II)是穿过背角的相对透明的带。膜片电极(patch pipette)由薄壁硼娃酸盐玻璃毛细管(1. 5mm o. d. , World Precision Instruments)制备。在确立全细胞模式(whole-cell configuration)后,将神经元保持在_70mV的保持电位用于sEPSC的记录。典型的膜片电极的电阻为5 10MQ。内部溶液包含(单位为mM):葡糖酸钾135、KCl5、CaCl2O. 5、MgCl22、EGTA5、HEPES5、ATP_Mg5。在电压钳模式中，用 Axopatch200B 放大器(Axon Instruments)放大膜电流。信号在2kHz滤波并在5kHz数字化。以使用pCLAMPIO软件的个人电脑存储数据，并用Mini Analysis (Synaptosoft Inc.)进行分析。突触传导皮质切片的记录。麻醉⑶I小鼠(P20-35)并将其断头。迅速取出脑，并用切片机(Leica VT1200)在经氧化的人工脑脊液(ACSF)中切制出冠状皮质切片(300 y m厚)。在32 C下，切片在ACSF中鮮育I小时，然后在室温下保存。用玻璃微移液管(3 5M)从皮质层V锥体神经元中得到全细胞膜片钳记录，所述管中填充了基于葡糖酸钾的溶液(对于EPSC，包含(单位为mM) :K-葡糖酸盐130、HEPES10、MgCl22、CaC121、EGTAll)或基于葡糖酸铯的溶液(对于IPSC，包含(单位为mM) :Cs_葡糖酸盐 120、CsC15、HEPES10, MgCl2U CaC120.1、EGTA4)。用 MultiClamp700B 放大器(AxonInstruments, Foster City, CA)将细胞电压钳制在 _70mV (对于 EPSC)或 OmV (对于 IPSC)。为记录诱发的突触响应，双相电刺激(持续100 u秒；120 300 u A)通过位于被记录神经元正下方白质的双极电极递送。通过局部灌输系统施用肽以充分地覆盖被记录神经元的区域。信号在2kHz滤波、数字化并保存用于用pClamp程序离线分析。数据表示为电流平均值土SEM。对原始数据用p < 0. 05显著水平的配对t检验进行统计比较。免疫细胞化学。在经固定、经通透化的CAD细胞上进行间接免疫荧光显微术。转染48小时后，CAD细胞培养物在室温下用4%多聚甲醛(在0.1mm PBS中稀释)固定10分钟，用0.2% Triton X-100通透化10分钟，然后用0. Olmm PBS洗涤3次。然后用10%牛血清白蛋白(在0.1mm PBS中稀释)室温预孵育细胞I小时以阻断与一抗的非特异结合。将针对兔多克隆N型/CaV2. 2 (Calbiochem)的一抗稀释(在0.1mm PBS中)至1: 150，并将其用于细胞。在4°C下孵育过夜后，再次用PBS洗涤CAD细胞，并且在室温下在封闭液中二抗(山羊抗小鼠 Alexa488 或抗兔 Alexa594,1 : 1000 Molecular Probes, Inc. ,Eugene, OR)鮮育 45 分钟。将盖玻片在 Prolong Gold Antifade 封片介质(Molecular Probes, Inc.)中封片。在带有冷却级联512B数码相机(Photometries, Tucson, AZ)的Nikon Ti扫场共焦显微镜上用60X、1.4NA镜头及标准FITC/Texas红色荧光镜(red fluorescence cube)获得图像。在平面间距离200nm处通过样品捕获Z叠加图像对(Z stack image pair)。通过使用理论点扩散函数的迭代去卷积方案(iterative deconvolution protocol) (NikonElements v3. 0)使图像离线去模糊，并对其进行用于呈现的拟色处理。钙成像。如先前所描述的那样进行钙成像。简要地，在37°C下向生长培养基中孵育的神经兀加载 3. 3 U M Fura_2AM(Molecular Probes Eugene, OR)以追踪胞质 Ca2+([Ca2+]e)的变化。钙成像期间，神经元在浴溶液中孵育，所述溶液含有139mM NaCl、3mM KC1、0. 8mMMgCl2U. 8mM CaCl2UOmM NaHEPES (pH7. 4)、5mM 葡萄糖和 65mM 蔗糖。蔗糖用于保持与生长培养基相似的渗透压(340mosm)。溶液的渗透压用渗透计Osmette II (PrecisionSystems Inc. , Natick, MA)测量。用通过 Simple PCI 软件 6. 2 (Compix Inc. , Sewickley,PA)控制的使用Nikon objective Plan Fluor20 X 0. 45NA和薄型背照式EM-CCD照相机Hamamatsu C9100-12 (Hamamatsu Photonic Systems, Bridgewater, NJ)的倒置显微镜Nikon Eclipse TE2000-S 来追踪 Fura-2 荧光信号。激发光用 Lambda-LS 系统(SutterInstruments,Novato,CA)递送。激发滤波器(340±5 和 380±7)由 LambdalO-2 滤光器切换器(optical filter changer) (Sutter Instruments, Novato, CA)控制。通过 505nm 分色镜(dichroic mirror)在535±25nm处记录突光。在实验的时间过程中，使用提供可接受图像质量的最小曝光时间每5秒拍摄一次荧光图像。根据从这两个通道减去背景后计算的F34Q/F38Q监测[Ca2+]。的改变。如先前所描述的那样，由F34Q/F38Q比值评估游离Ca2+的浓度。表达EGFP-标记的CBD3或EGFP-标记的对照肽的神经元通过检测在480±20nm激发并且通过505nm分色镜在535±25nm采集的GFP荧光进行显示。感觉神经元的钙成像。按比例计的Ca2+成像在分离后12 24小时在背根神经节神经元(不向培养基中添加额外的NGF)上进行。在暗处，室温下向神经元加载3yMFura-2AM(Tyrode’ s 缓冲液中;119NaCl、2. 5KCl、2CaCl2、2MgCl2、25HEPES(pH7. 5)、30 葡萄糖，浓度单位为mM) 25分钟。然后将神经元用Tyrode缓冲液洗涤3次，然后与载剂(0. 05%DMSO) UOuM TAT乱序肽或10 y M TAT-CBD3孵育10分钟。在将细胞转移至成像阶段之前，将浴更换为含有10 y M硝苯地平或10 ii M硝苯地平+2 UMco-CTX的Tyrode缓冲液。用与显微镜和Nikon Elements Software (Nikon Instruments Inc. ,Melville, NY)偶联的加强C⑶相机通过数字视频显微荧光测定法测量细胞荧光。细胞用Lamda DG-4175W氙灯照明，通过滤光器切换器选择fura-2的激发波长(340/380nm)。每10秒测量Fura-2荧光(F34tl/F38tl)以使光致漂白尽可能小。获得至少6幅图像的基线之后，通过将兴奋性Tyrode缓冲液(32NaCl、90KCl、2CaCl2，、2MgCl2、25HEPES (pH7. 5)、30 葡萄糖，浓度单位为为 mM)添加至45mM KCl的终浓度而刺激神经元。从大鼠DRG中刺激释放iCGRP。如所公布的那样进行对刺激诱发释放和来自分离的感觉神经元的免疫反应性CGRP (iCGRP)含量。培养5 7天后，测量来自在HEPES缓冲液中孵育10分钟的细胞的iCGRP的基础或静息释放，所述缓冲液由以下组成(单位为mM)25HEPES、135NaCl、3. 5KC1、2. 5CaCl2、lMgCl2、3. 3 葡萄糖和 0. 1% (w/v)牛血清白蛋白，PH7.4，并且保持37°C。在含有刺激物(50mM KCl)的HEPES缓冲液中孵育细胞10分钟，然后再次用含有3. 5mM KCl的HEPES缓冲液孵育以重建静息释放水平。选择位于KCl-刺激iCGRP释放的浓度响应曲线倾斜部分的中部的K+浓度。通过放射免疫测定(RIA)测量每次孵育中释放的iCGRP量。用RIA检出的iCGRP最小量为5fmol，其置信区间为95%。通过将细胞暴露于2N乙酸中10分钟对每孔中剩余肽含量进行测定。10分钟的孵育期间，iCGRP的释放表示为总含量的百分比。将三种不同制备的最小值用于每种条件。DRG和脊髓切片的免疫组织化学。对成年Sprague-Dawley大鼠注射(1. p. ) 20mg/kg FITC-TAT-CBD3肽。15分钟后用C02使大鼠安乐死，并经心脏灌注盐水并且随后灌注4%多聚甲醛。立即取出腰部背根神经节和相关脊髓并且后固定24小时。在4°C下将组织在4%多聚甲醛中浸溃24小时，然后在4°C下在15%蔗糖缓冲液中浸溃24小时。连续地切出(14 u m) DRG 的矢状切片至 SuperFrost Plus 载玻片(Fisher Scientific, PittsburghPA)上。为每份DRG和脊髓获取至少6个切片用于免疫组织化学分析。在室温下用封闭缓冲液(3%血清/0.4% Triton, Fisher Scientific, Pittsburgh PA)孵育切片 3 小时，之后与抗NeuN抗体(小鼠单克隆抗体，1: 200 ；Chemicon, Temecula, CA)孵育过夜。初次孵育后，用二抗(缀合于CY3的抗小鼠抗体，在驴中以1: 800、1. 5小时制得；JacksonImmunoResearch, West Grove , PA)使细胞可视化。在PBS中洗漆每个切片10分钟(两次)并用PBS/甘油溶液覆盖盖玻片。还用H0echst33258核标记物核标签(I 1000，5分钟；Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)对所有组织切片进行染色。用装有 CoolSNAP HQ2电荷偶联设备相机的荧光显微镜(Photometries，Tucson, AZ)捕获来自标签细胞的信号。用Nikon Eclipse90i正立显微镜(Melville, NY)在IOX放大下以及用含01ympuslX71显微镜(Olympus America Inc. , Center Valley, PA)的 Delta Vision Core (AppliedPrecision, Issaquah, WA)在20X放大下使细胞可视化。大鼠脊髓切片的iCGRP释放。雄性Sprague-Dawley大鼠(175_200g)购自HarlanInc. (Indianapolis, IN)。使用先前所描述技术的改进形式进行脊髓切片的iCGRP释放。Chen, J. J. , Barber, L. A. , Dymshitz, J. , &Vasko, M. R. , Peptidase inhibitors improverecovery of substance P and calcitonin gene-related peptide release from ratspinal cord slices。Peptides. 17,31-37(1996)。简要地，使用 CO2 窒息并断头处死大鼠，取出每只动物的脊髓，将2cm腰膨大部分(lumbar enlargement)称重,并使用McIllwain组织切割机将其纵向和横向切成300 的横切片。将每个脊髓的切片置于单独的室中并以0. 5ml/分钟的流速流灌注Hepes缓冲液,所述缓冲液由以下组成Hepes25mM、NaC1135mM>KC13. 5mM、MgS041mM、CaCl22. 5mM、葡萄糖 3. 3mM、牛血清白蛋白 I %、抗坏血酸 200 y M、phe-alalOO u M、甲苯磺酰氟(PMSF) IOuM 和杆菌肽 20 u M,充有 95% 02-5% CO2, pH7. 4 7. 5，并保持36 37°C。30分钟后，每3分钟采集1. 5ml样本放入含有75 yllM的2_(N_吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(pH6. 7-6. 9)的试管中。通过首先用Ifepes缓冲液灌注组织9分钟，然后用含有20 ii M对照肽或CBD3的Hepes缓冲液灌输9分钟而建立基础释放。为诱发iCGRP释放，随后用具有20 ii M乱序肽对照肽或CBD3的含有500nM辣椒素的Hepes缓冲液、额外灌输9分钟。为在刺激之后显示回到基础释放，用Hepes缓冲液单独另外灌输组织15分钟。释放方案完成后，回收脊髓组织并将其在4ml0.1N HCl中匀浆。如先前所描述的那样，将匀浆在4°C下以3000xg离心20分钟，将上清液用Ifepes缓冲液连续稀释并通过RIA测定iCGRP。总肽含量为在灌注期间释放的iCGRP量和组织中的剩余量。该值用于确定作为总含量％的释放量。来自培养的小鼠DRG的刺激iCGRP释放。如公布的那样进行对来自分离的感觉神经元中的刺激诱发释放和 免疫反应性CGRP(iCGRP)含量进行测量。培养5 7天后，从在非去极化Jfepes缓冲液中孵育10分钟的细胞的培养基中移出的等分量测量iCGRP的基础或静息释放，所述缓冲液由以下组成(单位为mM) :25HEPES、135NaCl、3. 5KC1、2. 5CaCl2、lMgCl2、3. 3葡萄糖和0. 1% (w/v)牛血清白蛋白，pH7.4，并保持37°C。移除缓冲液，将细胞在去极化H印es缓冲液(50mM KCl)中孵育10分钟，将培养基移出并将其分成等量份(aliquot)。然后细胞再次与含有3. 5mM KCl的非去极化Ifepes缓冲液共孵育以重建静息释放水平，缓冲液移出并将其分成等量份。选择位于KCl-刺激iCGRP释放的浓度响应曲线倾斜部分的中部的K+浓度。通过放射免疫检定法(RIA)测量孵育样本的等量分中iCGRP的释放量。用RIA检测的iCGRP最小量为5fmol，其置信区间为95%。通过将细胞暴露于2N乙酸10分钟对每孔剩余肽含量进行测定。将酸溶液的等分量用Hepes缓冲液稀释并且类似地测定iCGRP。将该值添加至之前孵育中iCGRP的释放量以获得每孔总iCGRP含量。10分钟孵育过程中iCGRP的释放表示为总含量的百分比。将DRG暴露于TAT乱序肽或TAT-CBD3肽(10 u M)过夜，和/或整个初次基础洗涤和整个高K+暴露中均包含所述肽。三种不同制备的最小值用于每种条件。激光多普勒流量测定法。将雄性大鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，并且用恒温毯将动物体温保持在37°C。为测量脑膜血流，将动物头部固定在立体定位架(stereotaxicframe)中并制备出颉窗(cranial window),但不损伤硬脑膜。硬脑膜血流用激光多普勒流量仪(TSI，MN)测量。针型探针置于脑膜中动脉(MMA)的较大分支上，远离可见的皮质血管，颅窗用合成的间质溶液(SIF)保持湿润，所述溶液由以下组成135mMNaCl、5mM KC1、5mM CaCl2>ImM MgCl2>IOmM HEPES、IOmMD-葡萄糖(pH7. 3)。使用 Axoscope 软件(AxonInstruments, CA)于IHz的频率在线记录血流。药物施用。在SIF中每天新鲜稀释药物或肽。向硬脑膜表面(50iil，30iiM)施用TAT-CBD3或TAT乱序肽。将辣椒素溶于SIF中至IOOnM,用于经鼻施用。为刺激鼻黏膜，使用Pipetman移液管在30秒时间内将50 U I辣椒素溶液施用到鼻孔中2mm的位置处。药物施用前15分钟，所有实验中向硬脑膜或鼻黏膜施用SIF或含0.1 %乙醇的SIF作为对照，并且其对脑膜血流无作用。

数据采集和统计。数据在IHz采集，通过对每60个样本取平均值(I分钟间隔)而进行分箱用于统计学分析或者对每10个样本取平均值而进行分箱用于图示。作为施用药物前3分钟期间测量的平均流速而确定基础血流，通过将施用的3分钟内峰值响应与施用前3分钟的平均血流相比较而计算受试化合物的作用。为每只动物计算血流的变化，在治疗组内平均，并且表示为相对于基础血流的变化百分比。使用非配对t检验进行血流变化的比较。数据值表示为平均值土SEM。所有测试的显著性水平设定为p <0.05。福尔马林测试。将大鼠置于开放的Plexiglas观察室中30分钟以适应环境。轻柔限制动物，同时使用31号针向后爪背侧表面皮下施用50iU2. 5%的福尔马林。观测防伤害行为60分钟，分为5分钟的时段，并且测定每个时段中的退缩次数。将镜子置于观察后方以便于无阻碍地观察经福尔马林注射的爪。在注射福尔马林30分钟之前皮下注射TAT-CBD3或TAT对照肽(30 ii M于20 ill中)。眼部擦拭实验。雄性大鼠( 150g)放入安静、控温(22_25°C )的行为实验室，置于至少在测试之前适应0. 5小时的单独的笼子中。用移液管将40 u I体积的TAT CBD3肽、TAT对照肽或载剂直接滴入右眼，并测量所导致的防伤害行为。防伤害行为限定为保持闭眼或积极梳理(groom)或擦拭经处理眼所消耗的时间。记录该防伤害行为5分钟，随后将辣椒素(3 于40 Ul盐水中)施用到经预处理的眼中。如先前所描述的那样，施用辣椒素后再次对防伤害行为定量5分钟。观察者对处理不知情。所有数据表示为平均值土SEM。通过用Bonferroni事后检验双因素分析方差对组间显著性差异进行。用GraphPadPrism4. 0 (GraphPad, San Diego, CA, USA)对数据进行分析。外周神经病的ddC模型。通过单次1.p.注射(25mg/kg)抗逆转录病毒药物2'，3'-双脱氧胞苷(ddC，Sigma)建立痛觉过度敏感和异常性疼痛。ddC的单次施用产生了从注射后天数(post-1njection day, PID)第3天一直到测试最后一天(PID42)显著双侧降低von Frey触丝刺激的缩足阈值。如先前所描述的那样，von Frey测试在后爪部位进行。简要地，将大鼠放置于金属网层，并覆盖有透明塑料圆顶，其中动物已于初始的几分钟探究后安静休息。在预注射行为测试之前的两天，动物每天适应此测试装置15分钟。适应环境后，将每根触丝应用于位于后爪无毛侧的6个点；每根神经分支(隐神经、胫神经和腓肠神经)分布的两个不同的点。用7根触丝进行机械刺激，每根传输的弯曲力不同(10、20、40、60、80、100和120mN)，但每根均装配平头尖端并有0.2mm的固定直径。mN力等价成克为100mN= 10. 197克。以力上升的顺序测试触丝，每种触丝按从第I至第6个点、从一只爪到另一只爪交替的顺序递送I秒。刺激间隔为10 15秒。使用120mN的截断值；在120mN无响应的动物被设定为该值。在给予大鼠TAT对照或TAT CBD3之前连续3天进行测量。刺激随机施用于左后爪和右后爪以确定引起缩爪响应所需刺激强度阈值的刚度(stiffness)。缩足发生率表示为每根触丝六次应用作为力之函数的百分比。将Hill等式拟合至该函数(Originversion6. 0, Microcal Software),其涉及引起退缩(withdrawal)的缩进(indentation)相对于缩进力的百分比。从该等式中获得阈值力，其被定义为与50%退缩率相对应的力。至少表现出与指定动物测试基线阈值有_20mN差异的阈值作为神经性疼痛的代表。分别对于每只足和至少两次注射前测试平均值与每次注射后测试所得平均值之间的差异显著性进行了统计分析。在所有测试中，在施用药物或载剂之前获得ddC处理组和假处理组的基线数据。在每个处理组中，通过重复测量方差分析(RMAN0VA)以及随后通过事后成对比较(Student-Newman-Keuls法)对施用后平均值与基线值进行比较。.05的概率水平表明显著性。涉及动物及其管理的流程根据Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals (美国国家卫生研究院出版物85-23, Bethesda, MD, USA),并经印第安纳大学医学院机构动物管理与使用委员会批准。用于行为研究的Sprague-Dawley大鼠购自Harlan Inc. (Indianapolis, IN),用于切片电生理学实验的⑶I小鼠来自CharlesRiver(Chicago,IL)。肽。CBD3(SEQID NO. :1)、TAT 对照(SEQ ID NO. :2)和 TAT CBD3 (SEQ ID NO.11)由Antagene Inc. (Sunny, vale, CA)合成,并在使用前通过质谱(印第安纳大学医学院化学系)核实。肽。TAT乱序肽(SEQ ID NO. :2)(与任何已知序列无同源性的随机序列)和TAT-CBD3 (SEQ ID NO. 11)由 Antagene Inc.合成并经质谱核实(IUSM 化学系)。表2中包含了通 过计算机模拟产生了预计与CRMP-2相互作用的另一些序列(SEQID N03 10、12和13)，这些包含在表2中，它们是可用于实施和/或研究本发明的另一些多肽。表权利要求
1.使CRMP-2与CaV2.2解偶联的化合物，其包括式x-z的化合物，其中X是与选自SEQ ID NO. :12和SEQ ID NO. :13的至少一种多肽具有至少80%同一性的多肽,并且Z 是与选自 SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D N0.4、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO.6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9 和 SEQ.1D NO. :10 的至少一种多肽具有至少80%同一性的至少一种多肽，其中X与Z彼此融合。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述X与Z通过肽键彼此融合。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中X是与选自SEQID NO. :11和SEQ ID NO. 12的至少一种多肽具有至少90%同一性的多肽。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中Z是与选自SEQ.1D NO. USEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. -J、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9 和SEQ.1D NO. :10的至少一种多肽具有至少90%同一性的多肽。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中X是与选自SEQID NO. :11和SEQ ID NO. 12的至少一种多肽具有至少95%同一性的至少一种多肽。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中X是与选自SEQ ID NO. :12和SEQ ID NO. :13的至少一种多肽具有至少90%同源性的多肽，并且Z 是与选自 SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4, SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO.6,SEQ.1D NO. 7,SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9 和 SEQ.1D NO. :10 的至少一种多肽具有至少90%同源性的多肽，其中X与Z彼此融合。
7.根据权利要求1所述的化合物,其中X是与选自SEQ ID NO. :12和SEQ ID NO. :13的至少一种多肽具有至少95%同源性的多肽，并且Z 是与选自 SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4, SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO.6,SEQ.1D NO. 7,SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. :9 和 SEQ.1D NO. :10 的至少一种多肽具有至少95%同源性的多肽，其中X与Z彼此融合。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中X是选自SEQID NO. :12和SEQ ID NO. :13的至少一种多肽。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中Z是选自SEQ.1D NO. :1、SEQ.1D NO. :3、SEQ.1D NO. 4、SEQ.1D NO. :5、SEQ.1D NO. :6、SEQ.1D NO. :7、SEQ.1D NO. :8、SEQ.1D NO. 9 和SEQ.1D NO. : 10 的多肽。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是SEQID NO. :11。
11.治疗患者的方法，其包括以下步骤提供至少一种根据权利要求1的化合物或其可药用盐。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述化合物配制成用于向患者施用。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤向患者施用至少一个治疗有效剂量的所述化合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述剂量为约Img至约IOOmg所述化合物/约1千克患者体重。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述剂量为约Img至约20mg所述化合物/约I千克患者体重。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述患者是哺乳动物。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述患者是人。
18.用于治疗患者的药盒，其包含至少一个治疗有效剂量的根据权利要求1的化合物或其可药用盐。
19.根据权利要求18所述的药盒，其中所述药盒中的所述化合物配制成用于注射。
20.根据权利要求18所述的药盒，其中所述药盒中的所述化合物与有助于保持所述化合物之活性的至少一种其他材料配制在一起。
全文摘要
N型电压门控钙通道(N-type voltage-gated calcium channel，CaV2.2)是神经递质释放的关键介体，并且被认为与伤害感受的传递有关。常规的CaV2.2阻断剂在疼痛治疗中的应用受到副作用的限制。本文中报道的是这样的方式，其不是直接阻断CaV2.2，而是通过抑制轴突脑衰蛋白响应调节蛋白2(collapsin response mediator protein2，CRMP-2)(一种已知增强CaV2.2功能的蛋白质)的结合而抑制炎性和神经性疼痛。与HIV tat蛋白转导结构域相融合的CRMP-2的15个氨基酸的肽(TAT CBD3)降低了由三叉神经血管系统活化所诱导的脑膜血流，阻止了通过足底内注射福尔马林(intraplantar formalin)诱发的炎症诱导的触觉高伤害感受(tactile hypernociception)和角膜施用辣椒素后的防伤害行为(nocifensive behavior)，并且逆转了由抗逆转录病毒药物2’，3’-双脱氧胞苷产生的神经性高伤害感受(neuropathic hypernociception)。对CRMP-2介导的CaV2.2功能增强的阻断抑制了炎性和神经性伤害感受，提供了用于治疗疼痛和炎症的方法。
文档编号A61K38/00GK103052648SQ201180038945
公开日2013年4月17日 申请日期2011年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者拉杰什·康纳 申请人:印第安纳大学研究与技术公司