时钟基因和透明质酸合成酶基因表达促进剂的制作方法
【专利摘要】本发明的课题是更有效地促进皮肤的时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达。本发明的解决问题的方法是，将含有选自薰衣草油和桉树油中的1种或2种，和下述通式(I)所示的氧化烯衍生物的组合物应用于皮肤。R1O-[(AO)m(EO)n]-R2--?(I)(式中，AO为碳数3～4的氧亚烷基，EO为氧化乙烯基，m和n分别为碳数3～4的氧亚烷基、氧化乙烯基的平均加成摩尔数，且1≤m≤70、1≤n≤70，氧化乙烯基相对于氧亚烷基和氧化乙烯基的合计的比例为20～80质量％。氧亚烷基和氧化乙烯基既可以加成成嵌段状，也可以加成成无规状。R1和R2是可以相同或不同的碳数1～4的烃基或氢原子，且R1和R2的氢原子数相对于烃基数的比例为0.15以下)。
【专利说明】时钟基因和透明质酸合成酶基因表达促进剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及促进时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达的试剂以及方法。
【背景技术】
[0002]地球上的几乎全部生物在体内具有以约24小时周期自主振动的“生物钟”。认为生物钟引起称为昼夜节律(circadian rhythm)这样的生物学日周期变动,支配生物的睡眠？觉醒循环、和体温、血压、激素分泌、代谢、以及身心的活动、摄食等各种生物体现象(活动)的日周期变动。近年来，昼夜节律的紊乱被指出是睡眠障害、皮肤疾患、生活习惯病、以及抑郁症等精神神经疾患等各种身心症状或疾患的发病原因。
[0003]生物钟被包含称为“时钟基因(clock gene)”基因群的节律产生系统控制。在哺乳类的情况下，认为由编码CLOCK，BMAL, PERIOD, CRYPT0CHR0ME4个成为核心的蛋白质的基因的转录的促进/抑制而形成的反馈回路，构成时钟分子机构的核心(core)，如果与这些核心回路相关的基因不顺利表达，则引起以抑郁、生活习惯病为代表的各种疾病(非专利文献I)。
[0004]已经明确，昼夜节律的控制中枢(中枢时钟)存在于丘脑下部的视交叉上核，但在末梢组织中时钟基因也表达，通过同样的系统形成昼夜节律。皮肤中时钟基因也表达，与其他脏器同样，通过与脑内的昼夜节律中枢同步地由时钟基因刻画节律，从而维持生物体恒定性(非专利文献2)。
[0005]例如，在BMALl敲除 动物中，发现了皮肤的萎缩和/或体毛再生的抑制，如果时钟基因不顺利作用，则皮肤的健康受损(非专利文献3)。
[0006]透明质酸是糖胺聚糖的一种，广泛存在于以关节为代表的生物体内。在皮肤中也存在，与皮肤的保湿和/或柔软性相关。进而，报告了皮肤的透明质酸以约I天为单位被代谢，通过这样迅速的代谢而有助于有害物质的除去等肌肤的健康保持(非专利文献4)。
[0007]例如，专利文献I中记载了草莓种子提取物促进透明质酸合成酶基因等的表达，具有保湿作用和美肌作用。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:日本特开2009-298765号公报
[0011]非专利文献
[0012]非专利文献1:Akhilesh B.Reddy, John S.0’ Neill, Healthy clocks, healthybody, healthy mind.Trends Cell Biol.2010January;20(I):36-44
[0013]非专利文献2:Miki Tanioka, Molecular Clocks in Mouse Skin.Journal ofInvestigative Dermatology(2009), 129, 1225-1231
[0014]非专利文献 3:Roman V.Kondratov, Early aging and age~relatedpathologiesin mice deficient in BMALI, the core component of thecircadian clock.GENES&DEVEL0PMENT(2006)20:1868-1873[0015]非专利文献4:Raija Tammi, Degradation of Newly Synthesized HighMolecularMass Hyaluronan in the Epidermal and Dermal Compartmentsof Human Skin in OrganCulture.1nvest Dermatol.97:126-130，1991
【发明内容】
[0016]发明要解决的课题
[0017]本
【发明者】发现，特定的植物提取物能够促进时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达。本申请发明的目的是提供能够更有效地提高由这样的植物提取物产生的时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达的促进的试剂以及方法。
[0018]用于解决课题的方法
[0019]本
【发明者】发现，薰衣草油和桉树油促进昼夜节律控制的核心回路的Bmal、Period等时钟基因、以及透明质酸合成酶基因的表达，进而这些植物提取物通过与氧化烯衍生物配合，能够更有效地促进上述基因的表达，从而完成了本发明。
[0020]本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂的特征在于，含有:选自薰衣草油和桉树油中的I种或2种、和下述通式(I)所示的氧化烯衍生物，
[0021]R1O-[(AO)ni (EO)n]-R2 ⑴
[0022]式中，AO为碳数3~4的氧亚烷基，EO为氧亚乙基，m和η分别为碳数3~4的氧亚烷基、氧亚乙基的平均加成摩尔数，且I < m < 70、1 < η < 70，氧亚乙基相对于氧亚烷基和氧亚乙基的合计的比例为20~80质量％，氧亚烷基和氧亚乙基既可以加成成嵌段状，也可以加成成无规状，R1和R2是可以相同或不同的碳数I~4的烃基或氢原子，且R1和R2的氢原子数相对于烃基数的比例为0.15以下。
[0023]另外，本发明的 促进皮肤中的时钟基因和/或透明质酸合成酶基因的表达的方法的特征在于，包括将组合物应用于皮肤的步骤，所述组合物含有:选自薰衣草油和桉树油中的I种或2种、和上述通式(I)所示的氧化烯衍生物。
[0024]薰衣草油和桉树油能够同时促进Bmal、Period等时钟基因、以及透明质酸合成酶基因的表达，进而通过与上述特定的氧化烯衍生物组合配合，可以有意义地提高其基因表达促进效果。
[0025]发明的效果
[0026]本发明通过配合同时促进时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达的薰衣草油和/或桉树油、和上述特定的氧化烯衍生物，从而可以显著提高皮肤的时钟基因和透明质酸合成酶的表达，调节皮肤的昼夜节律并促进恒定性维持，同时提高对皮肤的保湿和屏障功能发挥重要作用的透明质酸的产生，改善肌肤状态，并维持健康的肌肤状态。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是显示培养人皮肤成纤维细胞中的、由薰衣草油产生的Bmall时钟基因(A)、Periodl时钟基因(B)、和HAS2透明质酸合成酶基因(C)的表达促进的图。
[0028]图2是显示培养人皮肤成纤维细胞中的、由桉树油产生的Bmall时钟基因㈧、和HAS2透明质酸合成酶基因(B)的表达促进的图。
[0029]图3是显示氧化烯衍生物对培养人皮肤成纤维细胞中的、由薰衣草油产生的Bmall时钟基因(A)、Periodl时钟基因(B)、和HAS2透明质酸合成酶基因(C)的表达促进的效果的图。
[0030]图4是显示氧化烯衍生物对培养人皮肤成纤维细胞中的、由桉树油产生的Bmall时钟基因(A)和HAS2透明质酸合成酶基因(B)的表达促进的效果的图。
【具体实施方式】
[0031]本发明的时钟基因表达促进剂和透明质酸合成酶基因表达促进剂含有薰衣草油和/或桉树油作为有效成分。这些精油均有市售，以下简单说明。
[0032]薰衣草油，是将属于唇形花科的小灌木薰衣草(Lavandula officinalis)的收割花进行水蒸气蒸馏而得的精油。
[0033]桉树油，是将属于桃金娘科的常绿乔木桉树(例如,Eucalypus globulus)的叶和/或小枝等进行水蒸气蒸馏而得的精油。[0034]在本发明中，薰衣草油和桉树油可以分别单独使用I种，或2种组合使用。
[0035]进而，本发明的时钟基因表达促进剂等含有上述通式⑴所示的特定的氧化烯衍生物作为必须成分。
[0036]在本发明中使用的上述氧化烯衍生物中，AO为碳数3~4的氧亚烷基，具体地，可列举例如，氧亚丙基、氧亚丁基、氧亚异丁基、氧三亚甲基、氧四亚甲基等。优选AO为氧亚丙基、氧亚丁基。
[0037]m是碳数3~4的氧亚烷基的平均加成摩尔数，I ^ m ^ 70,优选为2≤m≤20。η是氧亚乙基的平均加成摩尔数，I ^ n ^ 70，优选为2 < η < 20。如果碳数3~4的氧亚烷基或氧亚乙基超过70，则有出现发粘感的倾向。
[0038]另外，氧亚乙基相对于碳数3~4的氧亚烷基和氧亚乙基的合计的比例为20~80质量％。如果氧亚乙基的比例低于20质量％，则作为皮肤外用剂使用时，则倾向于润湿感差，如果超过80质量％，则倾向于光滑感差。
[0039]对氧化乙烯和碳数3~4的氧化烯的加成顺序不特别指定。另外氧亚乙基和碳数3~4的氧亚烷基既可以加成成嵌段状，也可以加成成无规状，嵌段状不仅包含2段嵌段，还包含3段以上的嵌段。此外，与加成成嵌段状的相比，使用加成成无规状的时，特别在作为皮肤外用剂使用的情况下，使用感触优异，因此优选加成成无规状的。
[0040]R1和R2是碳数I~4的烃基或氢原子，作为烃基，可列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。优选为甲基、乙基。碳数5以上的烃基亲水性低下，作为皮肤外用剂使用时润湿感低下。R1和R2既可以相同也可以不同。
[0041]R1和R2分别可以使用同种的，也可以碳数I~4的烃基和氢原子混在，还可以不同种的碳数I~4的烃基混在。其中，R1和R2的烃基中，烃基和氢原子的存在比例优选是氢原子的数⑴相对于烃基的数⑴的比例Υ/Χ为0.15以下，更优选为0.06以下。如果Υ/Χ的比例超过0.15，则有出现发粘感的倾向。
[0042]作为本发明中使用的上述氧化烯衍生物，不特别限定，可列举例如，POE(14)POP (7) 二甲基醚、POE (10) POP (10) 二甲基醚、POE (7) POP (12) 二甲基醚、POE (25) POP (25) 二甲基醚、POE (27) POP (13) 二甲基醚、POE (55) POP (28) 二甲基醚、POE (36) POP (41) 二甲基醚、POE (14)POB (7) 二甲基醚、POE (10)POP (10) 二乙基醚、POE (10)POP (10) 二丙基醚、POE (10)POP(IO) 二丁基醚等(此外，上述POE、POP、POB分别是聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚氧丁烯的省略)。
[0043]本发明中使用的上述氧化烯衍生物可以通过公知的方法制造。例如，对具有羟基的化合物加聚氧化乙烯和碳数3~4的氧化烯后，使其与卤代烷在碱催化剂的存在下进行醚反应,从而获得。或者，也可以使用市售品。
[0044]本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂，在不损害本发明的效果的限度内，除了上述的必须成分之外，还可以含有任意的其他成分。另外，可以单独使用，但也可以与其他具有时钟基因的表达调节作用的药剂、或者促进透明质酸的产生的药剂等组合使用。
[0045]在本申请发明中，薰衣草油或桉树油(精油)与氧化烯衍生物的配合比率，只要能够实现本申请发明的效果就不限定，优选精油:氧化烯衍生物的质量比为0.001:1~10:1，更优选为0.01:1~1:1。上述配合比率可以获得更高的基因表达促进效果。
[0046]对本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂不限定，但优选配合到皮肤外用剂中使用。通过将配合了同时促进时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达的薰衣草油和/或桉树油、和上述特定的氧化烯衍生物的组合物应用于皮肤，从而可以调节皮肤的昼夜节律并促进恒定性维持，同时提高对皮肤的保湿和屏障功能发挥重要作用的透明质酸的产生，维持健康的肌肤状态。
[0047]配合到皮肤外用剂中的情况下，有效成分薰衣草油或桉树油的配合量，只要能够发挥本申请发明的效果就不限定，通常相对于皮肤外用剂总质量为0.1~lOOOppm，更优选为 10 ~500ppm。
[0048]另外，配合到皮肤外用剂中的情况下，氧化烯衍生物的配合量，只要能够发挥本申请发明的效果就限定，相对于总质量优选为0.001~60质量％，更优选为0.01~10质量％。如果少于0.001质量％，则有时不`能发挥效果，另外如果超过60质量％配合，则有时产生发粘感。
[0049]配合到皮肤外用剂中的情况下，可以根据其剂型(例如，液剂、粉末剂、颗粒剂、气雾剂、固体剂、凝胶剂、贴膏剂、栓剂等)、制品形态(例如化妆料、药品、准药品等)，与本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂一起含有通常这样的皮肤外用剂中所含的任意成分。皮肤外用剂是包括全部对皮肤(也包含头皮、头发、指甲)应用的组合物的概念，包含例如，基础化妆料、彩妆化妆料、毛发化妆料、皮肤或毛发洗涤料等化妆料，软膏剂、贴膏剂、栓剂、刷牙剂等各种药品或准药品等。对其剂型也不限定，包含例如，水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、凝胶系、糊系、软膏系、气雾系、水-油2层系、水-油-粉末3层等任意剂型。在皮肤外用剂是化妆料的情况下，可列举例如，香水、淡香水、花露水、霜、乳液类、化妆水、粉底类、扑面粉、口红、肥皂、香波？润丝类、身体香波、身体润丝、身体粉类、浴剂类等。
[0050]此外，虽然例示了本发明的使用方式，但不限于这些，只要能够实现本发明的效果，可以以任意方式使用。另外，除了本发明的基因表达促进剂之外，根据具体的方式，可以在不损害本发明的效果的限度内，配合其他任意药剂等。
[0051]本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂和/或配合了该剂的对象物的具体的应用，只要与昼夜节律的调整和/或透明质酸的产生相关，就不特别限定。特别是对皮肤中的昼夜节律的调整和/或透明质酸的产生促进有用，可以应用于例如，肌肤的保湿和/或柔软性提高、皱纹的预防或改善、肌肤粗糙等皮肤诸症状的预防、改善或治疗等。
[0052]本发明中，对时钟基因不限定，包含例如，Bmal (BmalI, Bmal2),Period (Periodl, Period2, Period3)、Clock、Cryptochrome> albumin siteD-bindingprotein (Dbp)、E4BP4、Npas2、Rev_erb 等，尤其包含生物钟的核心基因 Bmal、Period、Clock和 / 或 Cryptochrome,特别是 Bmal 和 / 或 Period。
[0053]实施例
[0054]以下，列举实施例具体地说明本发明，但本发明不限于下述实施例。此外，作为评价中使用的培养细胞，可以使用皮肤成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、色素细胞、脂肪细胞、神经细胞等各种细胞，但本实施例中，使用人皮肤成纤维细胞进行评价。在任何生物种和细胞种中，时钟基因的核心系统都是共同的，所以认为人皮肤成纤维细胞中的评价结果也可以在其他生物种和细胞种中反映。
[0055]另外，作为时钟基因，测定参与核心系统的Bmal基因(以Bmall为代表)或者Period基因(以Periodl为代表)的表达量。作为透明质酸合成酶基因，测定透明质酸合成酶基因2 (HAS2)。数据未显示，但我们确认了，在培养人皮肤成纤维细胞的体系中，使用皮质醇或毛喉素(Forskolin)作为刺激药剂，Bmall和HAS2刻画了在药剂刺激的约16小时后表达量变为峰值的昼夜节律，另外Periodl刻画了在2小时后表达量变为峰值的昼夜节律，在以下的实验中，分别以刺激16小时后或2小时后的基因表达量为指标，对于试验物质的Bmal基因、Period基因、和HAS2基因的表达促进效果进行评价。
[0056]由薰衣草油和桉树油产生的、时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达促进效果的
Ml·
[0057]培养人皮肤成纤维细胞，购入市售的来源于正常成人皮肤的成纤维细胞(CellApplication, Inc),在实验中使用。接种于添加了 10%FBS、20mMHEPES、Glutamax、抗菌剂的DMEM培养基中，以37°C、5%C02培养。培养第6天，交换成包含各浓度的薰衣草油(0、10、25、50ppm)或桉树油(O、25、50、100ppm)的试验用培养基，将刚刚交换后作为O小时，在2小时后和16小时后取样细胞。从采集的细胞，使用市售的RNA提取试剂盒来提取RNA，使用市售的PCR引物(Perfect Real Time Primer、夕力? 人才社)，通过RT-PCR法，来测定时钟基因(PeriodUBmall)和透明质酸合成酶基因(HAS2)的表达量。同样地，定量持家基因RPLPO的表达量作为内标使用，计算出相对于RPLPO的表达量的目的基因的相对表达量。对于所得的值，进行Dunnett的多重比较检验，将与对照(不添加精油)相比以单侧5%的显著性水平有显著性差异的判定为有效果。
[0058]薰衣草油的结果示于图1 (Α~C)，另外桉树油的结果示于图2(Α，B)。Bmall和HAS2显示刺激16小时后的结果，Periodl显示刺激2小时后的结果。图中，显著性差异以*(Ρ〈0.05)和 **(Ρ〈0.01)表示。
[0059]如图1所示，薰衣草油将Bmall, Periodl和HAS2的表达均有意义地提高，另外，如图2所示，桉树油也提高Bmall和HAS2的表达，显示这些精油能够同时促进时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达。
[0060]氧化烯衍生物对由薰衣草油和桉树油产生的时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达促进的效果的评价
[0061]对于将氧化烯衍生物与薰衣草油或桉树油一起配合而产生的、对时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达促进的效果进行评价。此外，作为氧化烯衍生物，使用聚氧乙烯(14摩尔)聚氧丙烯(7摩尔)二甲基醚(无规聚合物)。
[0062]通过与上述同样的方法，接种来源于正常成人皮肤的成纤维细胞(CellApplication, Inc),在培养第6天,交换成包含规定浓度的氧化烯衍生物(O~0.1%)、和各浓度的薰衣草油(0、10、25、50ppm)或桉树油(O、25、50、IOOppm)的试验用培养基，将刚刚交换后作为O小时,在2小时后和16小时后取样细胞。与上述同样地,从采集的细胞,使用市售的RNA提取试剂盒提取RNA，使用市售的PCR引物(Perfect Real Time Primer、夕力9 才社)，通过RT-PCR法测定Bmall、Periodl、HAS2、以及作为持家基因的RPLPO的基因表达量。计算出相对于RPLPO的表达量的目的基因的相对表达量。对于所得的值，进行Dunnett的多重比较检验，将与对照(对于各浓度的精油，不添加氧化烯衍生物)相比，以单侧5%的显著性水平有显著性差异的判定为有效果。
[0063]薰衣草油的结果示于图3(A~C)，另外桉树油的结果示于图4(A、B)。Bmall和HAS2显示刺激16小时后的结果，Periodl显示刺激2小时后的结果。图中，显著性差异用*(Ρ〈0.05)和 **(Ρ〈0.01)表示。
[0064]如图3(Α~C)所示，通过与薰衣草油一起配合氧化烯衍生物，与单独的薰衣草油的情况(氧化烯衍生物0% )相比，8111&11、？61^0(11和撤52的表达有意义地提高。另外，如图4(A)所示，通过与桉树油一起配合氧化烯衍生物，与单独的桉树油的情况(氧化烯衍生物0% )相比，Bmall的表达有意义地提高。
[0065]由上述的结果显示，通过与薰衣草油或桉树油一起配合氧化烯衍生物，可以更有效地促进时钟基因和透明质酸合成酶基因的表达，可以在调整皮肤的昼夜节律的同时，提高皮肤的透明质酸产生，改善或提高皮肤功能。
`[0066](处方例)
[0067]以下显示本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂的处方例。
[0068]处方例I质量(% )
[0069]桉树油0.1
[0070]CH3O (EO) 10 (PO) 10 (EO) 10CH31.0
[0071]处方例2质量(％ )
[0072]薰衣草油0.4
[0073]CH3O (EO) 14 (PO) 7CH31.0
[0074]处方例3质量(% )
[0075]薰衣草油1.0
[0076]CH3O [ (EO) J (PO) 10] CH320.0
[0077]处方例4质量(％ )
[0078]桉树油0.2
[0079]薰衣草油0.5
[0080]CH3O (EO) 14 (PO) 7CH310.0[0081](配合例)
[0082]以下，将本发明的时钟基因表达促进剂或透明质酸合成酶基因表达促进剂的配合例作为应用例显示。配合量全部用相对于制品总量的质量％表示。
[0083]
【权利要求】
1.一种时钟基因表达促进剂，含有:选自薰衣草油和桉树油中的I种或2种、和下述通式(I)所示的氧化烯衍生物，
R1O-[(AO)m (EO) n]-R2 (I) 式中，AO为碳数3~4的氧亚烷基，EO为氧亚乙基，m和η分别为碳数3~4的氧亚烷基、氧亚乙基的平均加成摩尔数，且I < m < 70、I < η < 70，氧亚乙基相对于氧亚烷基和氧亚乙基的合计的比例为20~80质量％，氧亚烷基和氧亚乙基既可以加成成嵌段状，也可以加成成无规状，R1和R2是可以相同或不同的碳数I~4的烃基或氢原子，且R1和R2的氢原子数相对于烃基数的比例为0.15以下。
2.根据权利要求1所述的基因表达促进剂，其特征在于，所述时钟基因是Bmal和/或Period。
3.—种透明质酸合成酶基因表达促进剂，含有:选自薰衣草油和桉树油中的I种或2种、和下述通式(I)所示的氧化烯衍生物，
R1O-[(AO)m (EO) n]-R2 (I) 式中，AO为碳数3~4的氧亚烷基，EO为氧亚乙基，m和η分别为碳数3~4的氧亚烷基、氧亚乙基的平均加成摩尔数，且I < m < 70、I < η < 70，氧亚乙基相对于氧亚烷基和氧亚乙基的合计的比例为20~80质量％，氧亚烷基和氧亚乙基既可以加成成嵌段状，也可以加成成无规状，R1和R2是可以相同或不同的碳数I~4的烃基或氢原子，且R1和R2的氢原子数相对于烃基数的比例为0.15以下。
4.一种促进皮肤中的时钟基因和/或透明质酸合成酶基因的表达的方法，该方法包括将组合物应用于皮肤的步骤，所述组合物含有:选自薰衣草油和桉树油中的I种或2种、和下述通式(I)所示的氧化烯·衍生物，
R1O-[(AO)m (EO) n]-R2 (I) 式中，AO为碳数3~4的氧亚烷基，EO为氧亚乙基，m和η分别为碳数3~4的氧亚烷基、氧亚乙基的平均加成摩尔数，且I < m < 70、I < η < 70，氧亚乙基相对于氧亚烷基和氧亚乙基的合计的比例为20~80质量％，氧亚烷基和氧亚乙基既可以加成成嵌段状，也可以加成成无规状，R1和R2是可以相同或不同的碳数I~4的烃基或氢原子，且R1和R2的氢原子数相对于烃基数的比例为0.15以下。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述时钟基因是Bmal和/或Period。
【文档编号】A61K8/97GK103857381SQ201180073869
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2011年9月29日 优先权日:2011年9月29日
【发明者】合津阳子, 土师信一郎 申请人:株式会社资生堂