预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和dna疫苗的制作方法

预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和dna疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供含有包括Na/K泵抑制剂的疫苗促进剂、抗原和编码所述抗原的DNA的联合疫苗，其可用于治疗和预防变态反应、哮喘、自身免疫性疾病和移植排斥的症状。
【专利说明】预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和DNA疫
苗
[0001]序列表
[0002]本申请包含已按ASCII格式提交并通过引用方式据此整体并入的序列表。2011年9月21日创建的所述ASCII拷贝命名为VGX-0128.txt。
【技术领域】
[0003]本发明涉及使用疫苗治疗和预防变态反应、哮喘、自身免疫性疾病和移植排斥的症状，所述疫苗含有包括Na/K泵抑制剂的疫苗促进剂、抗原和编码所述抗原的DNA。
[0004]发明背景
[0005]调节性T (Treg)细胞是耐受性的重要调节因子，其在自身免疫性疾病治疗中起着重要作用。具体地讲，诱导靶向变态反应、哮喘和自身免疫性疾病抗原的抗原特异性T细胞或诱导型调节性T(iTreg)细胞为相关病症提供了有前景的免疫调节治疗策略。用于提供Treg细胞的已知方法是过继转移天然存在的胸腺源⑶4+CD25+Treg(nTreg)细胞。然而，这种方法在nTreg细胞之中产生低水平的胰岛特异性Treg细胞，因此抑制效率低下。
[0006]通过外周中 的致耐受性抗原呈递由常规⑶4+T细胞产生iTreg细胞。与天然存在的调节性T(nTreg)细胞相反，可使用蛋白抗原和编码相同抗原的DNA疫苗进行联合免疫来诱导致耐受性抗原呈递。同时暴露于基于蛋白和基于DNA的抗原的组合产生CD401?IL-1Ohigh树突细胞，这些树突细胞以抗原特异性方式介导⑶4+CD25_FOXp3+iTreg细胞的诱导。这些iTreg会对抑制Th1-和Th2-诱导的免疫途径(诸如变态反应、自身免疫性疾病、哮喘和移植排斥)有用。然而，DNA疫苗通过基于注射器的递送长期存在对宿主细胞的转导效率低下的问题。提高的转导效率可通过使用电穿孔装置(或)基因枪技术实现；然而，此类技术通常会使接种者不适。
[0007]由于DNA疫苗转导方法的现有局限以及疫苗(无论是预防性的还是治疗性的)的缺乏，对于对抗自身免疫性疾病的疫苗和有效接种的递送方法存在强烈的需要。另外，尚不清楚如何设计用于抗原呈递的抗原表位或疫苗，以便使iTreg的诱导最大化。因此，在本领域中对用于抗原类疫苗(antigen-based vaccine)的抗原选择和设计的更好方法存在需要，这些疫苗可有效转导宿主靶细胞并有效对抗自身免疫性疾病。
发明概要
[0008]本文提供了包含疫苗促进剂化合物、抗原肽和编码该肽的DNA的疫苗。疫苗促进剂可以是Na/K泵抑制剂，其为5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利(benzamil)或阿米洛利。抗原肽/DNA刺激iTreg细胞。本文提供了包含抗原肽和编码该肽的DNA的疫苗。抗原肽和DNA刺激iTreg细胞。抗原可与诸如变态反应、哮喘或自身免疫性疾病的病症相关。抗原可以为屋尘螨(dermatophagoides pteronyssinus) I肽、其片段或其变体，并且可与变态反应或哮喘相关。抗原可以为胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨I肽、α -肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌M5蛋白肽、(Q/R) (K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽、人S抗原、其片段或其变体，并且可与自身免疫性疾病相关。载体可包含编码肽的DNA。载体可以为pVAX、pcDNA3.0或provax载体。载体和抗原肽的质量比可以为5: I和1: 5或1:1和2: I。
[0009]本文还提供了一种疫苗接种试剂盒。疫苗接种试剂盒可含有疫苗施用装置和本文所述的疫苗。疫苗接种装置可以为疫苗枪、针或电穿孔装置。
[0010]本文还提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。该方法可包括向对其有需要的患者施用本文所述的疫苗。自身免疫性疾病可以为I型糖尿病、多发性硬化、自身免疫性卵巢疾病、尘螨变态反应、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性葡萄膜炎或哮喘。如果要将疫苗用于治疗I型糖尿病，则疫苗的抗原可以为胰岛素肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗多发性硬化，则疫苗的抗原可以为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗自身免疫性卵巢疾病，则疫苗的抗原可以为透明带蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗心肌炎，则疫苗的抗原可以为屋尘螨I肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于心肌炎，则疫苗的抗原可以为α -肌球蛋白肽、柯萨奇病毒B4结构蛋白肽、A群链球菌Μ5蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗类风湿性关节炎，则疫苗的抗原可以为肽(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗甲状腺炎，则疫苗的抗原可以为甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗重症肌无力，则疫苗的抗原可以为乙酰胆碱受体肽、其片段或其变体。如果要将疫苗用于治疗自身免疫性葡萄膜炎，则疫苗的抗原可以为人S抗原、其片段或其变体。
[0011]附图简述
[0012]图1显示了 MHC-1I阻断降低了⑶25_iTreg诱导。在存在或不存在抗MHC-1I阻断性mAb的情况下，与从得自联合免疫Balb/c小鼠的纯化致耐受性树突细胞(DC) —起培养得自Balb/c D011.10小鼠或0VA323_339_致敏Balb/c小鼠的纯化CD4+T细胞。在第7天计数 CD25_iTreg 细胞(CD4+CD25_Foxp3+)占 CD4+CD25T 细胞的百分比，*, p < 0.05。示出了
有相似结果的三次独立实验之一。每个点表示一只小鼠。
[0013]图2显示了 0VA323_339突变降低了 T细胞的抗原性。图2A.0VA323_339突变、其预测的MHC-1I结合亲和力以及得自四聚物竞争测定的实验结果的汇总。如下计算了四聚物结合的百分比:在存在竞争肽表位的情况下四聚物阳性T细胞的数量/在不存在竞争肽表位的情况下四聚物阳性T细胞的数量X100%。图2B.与呈递指定表位的致耐受性树突细胞(DC)一起共同培养了 4天的CFSE标记的D011.10⑶4+T细胞的增殖。线性图汇总了得自三次独立实验的结果。**，P < 0.01。
[0014]图3显示了经联合免疫诱导⑶25_iTreg细胞取决于表位亲和力。图A.通过流式细胞术计数联合免疫后在Balb/c小鼠中诱导的CD25-1Treg(CD4+CD25_FOXp3+(叉头框P3)和 nTreg (CD4+CD25+Foxp3+)并分别计算在 CD4+CD25.和 CD4+CD25+T 细胞中 Foxp3+ 细胞的百分比。首次接受试验的(naive)，非免疫小鼠。**, p<0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结果的三次独立实验之一。图3Β.经联合免疫诱导高度抑制性CD25_iTreg细胞取决于表位抗原性。在存在0VA323_339的情况下,与联合免疫诱导的CD25_iTreg —起共同培养CFSE标记的D011.10CD4+T细胞。通过流式细胞术，根据分裂的KJ1-26+细胞与总KJ1-26+细胞之比测定增殖。林，P <0.01。每个点表示一只小鼠。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
[0015]图4显示了过继转移⑶25_iTreg细胞抑制受体小鼠中的T细胞应答。将得自经0VA323_339、MTl或MT2联合免疫的Balb/c或首次接受试验的Balb/c的CD4+CD25—T细胞过继转移至首次接受试验的Balb/c。通过用IFA中的0VA323_339使受体致敏而评估供体CD25_iTreg的活性。图4A.致敏后从受体中分离出CD4+T细胞。将细胞用羟基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记，并在培养物中用仍^323_339再刺激。通过CFSE稀释鉴定了分裂的细胞，并通过流式细胞术计数。将结果表示为占总CFSE+T细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独立实验之一。图4B.致敏后从受体中分离出CD4+T细胞，并在细胞内针对IFN- Y进行免疫染色。通过流式细胞术计数IFN- Y+CD4+T细胞并计算占总CD4+T细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独立实验之一。图4C和D.再刺激T细胞的上清液中的IFN-Y和IL-10分泌。在阳性对照中使用抗CD3mAb(KT3)或KT3+IL-2+IL-4诱导指定的细胞因子。示出了有相似结果的三次独立实验之一。*，P < 0.05，#，p < 0.01。
[0016]图5显示了 PlOO对T细胞的刺激比P66更强。在培养物中用PlOO或P66 (5ug/ml)再刺激得自经蚤抗原免疫的C57BL/6小鼠的脾⑶4+T细胞。通过基于3-(4，5—二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴化物(ΜΤΤ，黄色四唑)的测定法测定T细胞增殖。分别使用伴刀豆球蛋白A(lug/ml)和BSA(lug/ml)作为阳性和阴性对照。*，ρ<0.05。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
[0017]图6显示了经联合免疫诱导的⑶25_iTreg对皮肤反应的减弱。图6A.经蚤抗原刺激的T细胞增殖。图6B.蚤特异性皮内试验诱导的体内T细胞应答。图6C.皮肤切片的H&E染色。黑色箭头 指示浸润T细胞。图6D.肥大细胞数和通过甲苯胺蓝染色的脱粒(黑色箭头)。图6E.联合免疫后七天，计数⑶25-1Treg细胞占⑶4+⑶25_1~细胞的百分比。示出了有相似结果的三次独立实验之一。*，P < 0.05 ;#，P < 0.01。
[0018]图7显示了过继转移⑶25-1Treg体内抑制皮肤反应。将得自经ColOO或Co66免疫的小鼠的CD25_iTreg过继转移进FSAl致敏小鼠。然后用蚤抗原激发受体(皮肤试验)。分别使用组胺和PBS作为皮肤试验的阳性和阴性对照。*，p<0.05。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
[0019]图8.联合免疫抑制屋尘螨(HDM)介导的哮喘的发展。(A)在用尘螨提取物最后一次激发后24h通过H&E染色对肺组织进行组织学检查。箭头示出了不同的细胞浸润(白色箭头)。(B)在最后一次激发后24h通过ELlSA测试对Der-pl特异的IgE的水平。(C)用Flex set检查最后一次激发后24h小鼠血清中的不同细胞因子水平。与模型组相比，*，P
<0.05 ;**，P < 0.01，η = 6 只小鼠 / 组。
[0020]图9.联合免疫诱导CD4+CD25_FOXp3+iTreg。(A)通过FACS分析第二次联合免疫后第7天⑶4+⑶25_T细胞中的Foxp3表达。(B-C)通过在存在APC和刺激物的情况下与应答T细胞(从经Der-pl刺激预处理的WT小鼠纯化的⑶4+T细胞)一起按1: 5或1: 10的比率共同培养72h检查对iTreg(从经联合免疫预处理的Foxp3gfp小鼠中纯化)的抑制。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，P < 0.05，**，P < 0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，η = 6只小鼠/组。
[0021]图10.1Treg的抑制能力由IL-10而非细胞与细胞的接触介导。(A)在第二次联合免疫后第7天通过荧光活化细胞分选(FACS)分析iTreg和nTreg的抑制性受体的表达。(B)在transwell板中，在上部腔室中用Derpl抗原(IOj g/ml)刺激2X IO5个新分离的⑶4+⑶25_GFP+(绿色荧光蛋白)T细胞以分泌细胞因子。用Derpl抗原(10ug/ml)刺激I X IO6个应答⑶4+T细胞以在下部腔室中扩增。如所示在下部腔室中添加10jg/mL的对照IgG、抗IL-10或抗TGF-β。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*, P < 0.05, P < 0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，η = 6只小鼠/组。
[0022]图11.TGF-β I对于诱导iTreg中的Foxp3表达是必需的。(A)通过RT-PCR检查在首次联合免疫后第3天得自小鼠脾脏的CDllC+树突细胞中的细胞因子生成。甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达作为样品的内部对照。⑶体内阻断TGF-β I时⑶4+⑶25_T细胞中的Foxp3表达。连续三天在每次联合免疫后在病灶内为小鼠注射单独的抗TGF-β Ab (400 μ g/注射)或单独的同种型对照抗体小鼠免疫球蛋白Gl (IgGl) 3次。在第二次联合免疫后7天通过FACS分析GFP表达。结果代表至少三次独立实验。如所示，*，P <0.05，**，P <0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，η = 6只小鼠/组。
[0023]图12.1L-10对于iTreg的抑制能力具有重要意义。(A)当体内阻断IL-1O时也可诱导 CD4+CD25Toxp3+iTreg。通过 FACS 分析了 CD4+CD25T1 细胞中的 Foxp3 表达。(B)在IL-10不足时诱导的iTreg抑制能力受损。与应答T细胞一起共同培养从经抗IL-1OmAb预处理的小鼠中分 离的iTreg。通过MTT法分析增殖水平。(C)通过FACS评估了在用抗TGF_b或抗IL-1OmAb处理后iTreg分泌的IL-10的水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*, P < 0.05, **, P < 0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，η = 6只小鼠/组。
[0024]图13.TGF-β I在体外诱导CD4+CD25_初始T细胞中的Foxp3表达。(A)Dcreg中的TGF-β和IL-10模型诱导iTreg。(B)与用DNA和Der-pl蛋白共同处理的DCreg —起共同培养初始T细胞7天，通过FACS评估了 Foxp3-GFP。(C)从Foxp3gfp小鼠中纯化的初始⑶4+⑶25_1~细胞在存在不同剂量的TGF-β I的情况下用板结合的抗⑶3和可溶性抗⑶28刺激72h，然后通过FACS评估GFP的表达。(D)将⑶4+CD25—T细胞在存在TGF- β I或IL-10的情况下如(C)刺激并培养72h，然后通过FACS评估GFP的表达。结果代表至少三次独立实验。如所示，P < 0.05, P < 0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，η = 6只小鼠/组。
[0025]图14.自分泌IL-10对iTreg抑制能力有影响。(A)与分别用DNA和Der-pl蛋白两者或单抗原预处理的DC —起共同培养初始T细胞7天。然后通过FACS评估了 Foxp3-GFP。(B)如(A)从培养基中分离iTreg并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑制能力。(C)在用DNA和蛋白疫苗预处理后的不同天数通过FACS检测了⑶Il+DC表面的IL-10R表达。(D)与用DNA、Der-pl蛋白两者和IL-10R siRNA预处理的DC —起共同培养初始T细胞。通过FACS评估了 iTreg诱导。(E)如(D)从培养基中分离iTreg细胞并与效应T细胞一起共同培养以评估其抑制能力。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。如所示，*, P < 0.05, **, P < 0.01与对照或首次接受试验的组不匹配，η = 6只小鼠/组。
[0026]图15.研究了 TGF-b和IL-10功能的模型并且其涉及通过联合免疫对iTreg进行诱导。图 15A 通过 Western 印迹显示了纯化的 CD4+CD25TFp+iTreg 和 CD4+CD25+GFP+nTreg中活化的T细胞I和2 (NFAT1和NFAT2)的核或细胞质核因子。将组蛋白或GAPDH分别用作核或细胞质蛋白的上样对照。(B)TGF-P和IL-10对联合免疫的不同阶段有影响。[0027]图16.对真核和原核表达构建体中pVAX-Der-pl表达的分析。(A)通过用Der-pl特异性引物进行的RT-PCR分析从用pVAX-Der-pl转染的幼仓鼠肾(BHK21)细胞分离的RNA。泳道I，DNA分子量标准；泳道2，得自经转染的BHK21细胞的RNA ；泳道3，得自经转染的PVAX载体BHK21细胞的RNA ;泳道4，得自非转染的BHK21细胞的RNA。通过SDSPAGE (B)和Western印迹(C)进行了对大肠杆菌(E.coli)系统中Der-pl蛋白表达的测定。SDS PAGE 结果 1:未诱导的 pET28a-Der-pl ；2:用 0.1mM IPTG 诱导的 pET28a_Der_pl ；3:用
0.5mM IPTG 诱导的 pET28a_Der_pl ；4:用 1.5mM IPTG 诱导的 pET28a_Der_pl ；5:蛋白分子量标准。箭头指向目标条带。(C)Western印迹结果1:未诱导的pET28a_Der_pl ；2:诱导的pET28a-Der-plo
[0028]图17.对支气管肺泡灌洗液(BAL)中不同细胞的分析。最后一次激发后24h，收集BAL并通过CELL-DYN评估了浸润细胞(总数)和嗜酸性细胞的数量。结果代表三次实验。与模型组相比，*，P < 0.05, **, P < 0.010 (η = 6只猫/组)。
[0029]图18.联合免疫上调源自Foxp3gfp小鼠的⑶4+CD25_T细胞中的GFP表达。通过FACS分析在第二次联合免疫后第7天⑶4+⑶25-T细胞中的GFP表达。结果代表至少三次独立实验。
[0030]图19.用mAb处理后小鼠血清中TGF-β I或IL-10的水平。(A)用ELISA试剂盒检查在第二次联合免疫后第3天小鼠血清中的TGF-β I水平。(B)用Flex Set检查在第二次联合免疫后第3天小鼠血清中的IL-1O水平。结果代表至少三次独立实验。与模型组相比，*, P < 0.05, **, P < 0.01, η = 6 只小鼠 / 组。
[0031]图20.TGF-β受体抑制剂抑制Foxp3诱导。与用DNA、Der_pl蛋白两者和TGF-β受体预处理的DC —起共同培养初始T细胞。通过FACS评估了 iTreg诱导。结果代表至少三次独立实验。
[0032]图21.1L-10对由DCreg引起的Treg诱导的阶段无影响。用抗IL-10通过DCreg诱导了 iTreg，然后在7天之后分离。通过效应T细胞的增殖水平评估了这些iTreg的抑制功能。通过MTT法分析增殖水平。结果代表至少三次独立实验。
[0033]图22.研究了 IL-10R siRNA 对 DC 的影响。在用 IL-10R siRNA 或对照 siRNA 处理后第2天测定了 DC表面上的IL-10R水平。结果代表至少三次独立实验。
[0034]图23.阿米洛利在体外加速质粒进入。对RAff264.7 (A, B, C)、JAffSII (D，E)和DC2.4(F，G)监测了含或不含ImM阿米洛利时Cy5-pEGFP进入细胞系的情况，作为2h Cy5+%和第 3 天的 EGFP+Cy5+%。添加 LipofactamineTM2000 (Lipo2000)作为阳性对照。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
[0035]图24.阿米洛利在体内加速质粒进入。在含或不含阿米洛利时，将首次接受试验的C57小鼠用Cy5-pEGFP在后足垫部位经皮下免疫。4小时后，采集淋巴结以测试Cy5+细胞的比例(B)和亚型(C)。η = 3。B中的*，在所有组之中具有统计显著性。
[0036]图25.阿米洛利加速脂筏和小窝依赖性质粒进入。与阿米洛利一起添加脂筏抑制剂Μβ CD或小窝抑制剂菲律平(fillipin)，以阻断细胞系RAW264.7(A，B)、JAWSII (C，D)和DC2.4(E，F)上的内吞途径。然后添加Cy5-pEGFP以在2h内进入并在3天内表达。示出了有相似结果的三次独立实验之一。
[0037] 图26.阿米洛利增强DC的成熟和固有细胞因子分泌。在细胞培养物中添加了含或不含ImM阿米洛利的10 μ g/ml的pcD_S2以进行刺激。对RAW264.7 (A，B，C)、JAWSII (D，E)、DC2.4(F，G)、腹腔巨噬细胞(H，I)和脾DC (J，K)在第3天测试了表面成熟标记CD40、CD80、CD83、CD86、MHC 1、MHC-1I 和分泌进上清液的固有细胞因子 IL-6、TNF-α、IL-1 β、IFN-GAMMA。示出了有相似结果的三次独立实验之一。对于腹腔巨噬细胞和脾DC，n = 3。*和**，在+/-阿米洛利之间具有统计显著性。
[0038]图27.阿米洛利增强针对HBV S2的适应性免疫。A，免疫途径。B，抗S2IgG抗体滴度。C，在后足垫部位中经皮下用Iy g sAg再刺激24h后的迟发型超敏(DTH)反应。添加PBS作为阴性对照。*，在所有组之中具有统计显著性。D和E，体外(D)和体内(E)HBVS208-215特异性裂解，*，在+/_阿米洛利之间具有统计显著性。F和G，体外(F)和体内(G)HBVAlbl转基因小鼠肝脏裂解。A-G，η = 3。
[0039]图28.阿米洛利提高IFN-Y+穿孔素+颗粒酶B+⑶8Τ细胞的比例。将得自pcD-S2+/-阿米洛利免疫小鼠的脾细胞在体外通过10 μ g/ml的S208-215再刺激12h (A-C)或通过10 μ g/ml的skg再刺激24h (D)，然后用多色细胞内染料染色。添加PMA与离子霉素(1nmycin)作为阳性对照。A，计算了 CD8T细胞中的IFN-Y、穿孔素或颗粒酶B阳性细胞作为应答细胞。B，+/-阿米洛利之间应答⑶8T细胞中的细胞因子表达模式。C，阿米洛利剂量对IFN- Y +穿孔素+颗粒酶B+细胞比例的影响。D，响应sAg再刺激的IFN- Y +穿孔素+颗粒酶B+细胞比例。E和F，与腹腔巨噬细胞(E)或脾DC(F)共同培养然后通过S208-215再刺激并染色的⑶8T细胞中的IFN- Y +穿孔素+颗粒酶B+。η > 3。
[0040]图29.1FN- Y _/_损害了 CTL，但阿米洛利仍增加了双阳性细胞和CTL。将特异性裂解计算为在体外(A)和体内(B)S208-215包被的初始脾细胞(靶细胞)与初始脾细胞(对照细胞)的比，或在体外(C)和体内(D)Albl肝细胞(靶细胞)与初始C57肝细胞(对照细胞)的比，其中用pcD-S2+/_阿米洛利免疫的WT或IFN- Y -/-小鼠作为效应CTL。计算了所有组之中或+/_阿米洛利之间的差异。η = 3。E，WT和IFN-Y-/-之间的应答⑶8Τ细胞比例。F，S208-215再刺激后IFN-Y-/-小鼠的细胞因子谱(cytokine pattern)。G，HBsAg再刺激后穿孔素+颗粒酶B+双阳性细胞比例。η = 3。
[0041]图30.⑶401ow是联合免疫诱导的DCreg的标志。Α)为小鼠肌肉注射指定的免疫原。第二天通过针对⑶Ilc和⑶40-ΡΕ的双染，接着进行流式细胞术检查了脾脏DC。为CDllc+细胞分类。将首次接受试验的小鼠用作阴性对照。示出了有相似结果的独立实验。B)为纯化的⑶llc+DC和JAWS II细胞供给指定的免疫原24h，并通过流式细胞术检查⑶40的表达。未经处理的DC或JAWS II细胞用作阴性对照。C)为JAWS II细胞供给P0VA323+0VA323或pVAX+0VA32324h，然后与从已使其对OVA敏感的小鼠制备的CFSE-CD4+T细胞一起共同培养5天。通过FACS分析了 Foxp3和IL-10的表达。为⑶4+细胞分类(gate)。将Foxp3+或IL-10+细胞的数量计算为分类细胞的百分比。D)为JAWS II细胞供给所示的荧光标记免疫原24h，然后针对CD40进行免疫染色。通过共聚焦显微术分析了免疫原摄取和CD40表达的相关性(上图)。使用Nikon EZ-C13.0OFreeViewer软件分析了平均PE荧光(下图)。细胞数为10个/组。[0042]图31.DC通过网格蛋白和小窝介导的内吞作用同时摄取DNA和蛋白免疫原。A)在37°C下用PBS、MDC(50 μ M)或菲律平(10 μ g/ml)预处理JAWS II细胞30分钟，然后供给Cy5-p0VA323+FITC-0VA323 或 Cy5_pVAX+FITC_0VA32324h。用抗 CD40-PE 对细胞染色并通过流式细胞术分析。示出了 Cy5/FITC双阳性细胞(分类)的CD40染色。B)在A中所示的
重复实验的汇总。
[0043]图32.联合免疫活化由Cav-1介导的负向途径。在分析前2天从首次接受试验的小鼠或用指定免疫原免疫的小鼠的脾脏DC中提取总蛋白或RNA。对指定的蛋白和基因进行7 Western 印迹(A、C 和 D)和 RT-PCR 分析。
[0044]图33.使Cav-1和Tollip沉默防止了 DCreg的诱导。A)为WT和Cavl和/或Tollip 敲低 DC 供给 p0VA323+0VA323 或 pVAX+0VA32324h 并分析了 CD40 和 IL-1O 的表达。使用未供给任何免疫原的WT DC作为对照(未经处理)。B)与得自对OVA敏感的小鼠的CFSE-CD4+T 细胞一起共同培养供给了 p0VA323+0VA323 或 pVAX+0VA32324h 的 DC。测定了T细胞增殖和Foxp3+和IL-10+T细胞的数量。
[0045]图34.缺乏Cav-1和/或Tollip的DC在体内不是致耐受性的。将缺乏Cav-1和/或Tollip的JAWS II细胞过继转移到同基因小鼠中(第O天)。然后在第O和7天用IFA中的OVA使小鼠免疫。在第14天，测试了 DTH反应。在第15天，测定T细胞增殖、T细胞中Foxp3的表达和上清液中的ILlO水平。
[0046]图35.联合免疫诱导的DCreg改善炎症性支气管炎。A)实验设计:在第O和7天经腹膜内为Balb/c小鼠注射0.1ml PBS中的lmg/ml的OVA/明矾复合物，随后在第14、16和18天在气管内用100g OVA激发以建立“模型”。在第14、16和18天使对照小鼠经气管内接受PBS并且指定为“虚假(shame)”对照。在第21天，将5 X 105个得自同基因供体小鼠的⑶Ilc+细胞经静脉转移进模型小鼠，每天一次，连续3天。(!! = 3只/组)。转移之前，用或不用菲律平预 处理从首次接受试验的小鼠的脾脏纯化的供体CDllc+细胞，随后用pOVA+OVA或pVAX+OVA共同处理24h。在最终转移后第14天，取血清样品以分析IgE或细胞因子生成的水平。制作肺组织切片以评估疾病严重程度。B)在过继转移指定的DC后通过ELISA分析了抗原特异性IgE的水平。C)在转移指定的DC之前通过CBA检查了 IL-4和IL-5的生成。D)通过H&E染色检查了肺部切片，并在光学显微镜下以XlOO和x200放大倍数进行记录。
[0047]图36.联合免疫诱导的DCreg改善自身免疫性卵巢疾病。A)实验设计:在足垫部位为C57BL/6小鼠注射在CFA中乳化的mZP3蛋白以诱导A0D。14天后，将5X 105个JAWSII细胞经静脉转移进这些经诱导的AOD小鼠中，每天一次,连续3天。(η = 6只/组)。转移之前，为JAWS II细胞供给pcD-mZP3+mZP3或pcD_0VA+mZP324h，接着在37°C下用丝裂霉素C处理(50 μ g/ml) 20分钟。在最终转移后第14天，取血清以分析细胞因子生成，固定卵巢并切片用于评估疾病严重程度。B)通过CBA分析了 IFN-Y、TNF-a和IL-5的生成。示出了有相似结果的独立实验。C)通过对得自每只动物的组织切片的病理学分析评估了疾病的程度。图中的每个点表示一只动物。D)在最终转移后第14天，针对⑶4、Foxp3和IL-1O对每个受体组的脾细胞进行三重染色，并通过流式细胞术分析。为CD4+细胞分类。
[0048]图37.阿米洛利对JAWS II细胞中⑶40表达的影响。在37°C下用阿米洛利(5mM)预处理 JAWS II 细胞 10 分钟，然后用 Cy5-p0VA323+FITC-0VA323 或 Cy5_pVAX+FITC_0VA323共同处理24h。用抗⑶40-PE对细胞染色并通过流式细胞术分析。
[0049]图38.对JAWSII细胞中Cav-1和Tollip的调节。为JAWSII细胞供给指定的免疫原24h。然后提取总蛋白或RNA并通过Western印迹(A)或RT-PCR(B)分析。[0050]图39.通过 RNAi 对 Cav-1 和 Tollip 的沉默。A)用 Cav-1 或 Tollip 特异性 siRNA转染JAWS II细胞。在24h时，通过实时RT-PCR检测了 Cav-1和Tollip的mRNA水平。B)为WT和Cav-1敲低DC供给pOVA+OVA或pVAX+0VA24h。通过Western印迹检测了 NF- κ B的易位。
[0051]图40.最终DC过继转移后第14天对卵巢组织的组织学检查。在光学显微镜下以x40和XlOO放大倍数观察样品。实心箭头指示无炎症性细胞浸润的卵泡；空心箭头指示有炎症性细胞浸润的卵泡。
[0052]图41显示了编码流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的质粒表达载体和相应的线性表达盒的图谱。线性表达盒PcrNP或pcrM2含有CMV启动子、用于剪接的内含子、具有终止密码子和多聚腺苷酸化信号的NP或M2的全长基因。
【具体实施方式】
[0053]本发明涉及这样的发现，通过施用疫苗促进剂、抗原和编码抗原的DNA的组合有效诱导了抗特异性抗原的iTreg细胞。疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂，其为5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利并优选阿米洛利。这种诱导比单独的抗原、单独的DNA、单独的疫苗促进剂、或单独的抗原和DNA好很多。本发明还涉及这样的发现，如果抗原对致耐受性树突细胞(DC)上表达的II类MHC具有高亲和力，则可进一步提高iTreg细胞诱导的效率。含有对II类MHC具有高亲和力的肽抗原和表达相同肽的DNA的组合的疫苗诱导能够抑制自 身免疫性疾病和变态反应的iTreg群。本发明还涉及具有疫苗促进剂的疫苗。疫苗中存在疫苗促进剂促进DNA进入靶细胞。因为iTreg细胞为抗原特异性的并因此更有效抑制抗原特异性T细胞功能以及Thi和Tm细胞刺激，所以iTreg诱导处理伴有比其他处理方法远远更少的副作用。
[0054]本文提供了包含疫苗促进剂、抗原肽和编码肽的DNA的疫苗。抗原肽/DNA刺激iTreg细胞。在一些实施方案中，该肽具有IOOnM的IC5(I，并且对于II类MHC可具有50nM或更低的IC5(I。II类MHC可在致耐受性树突细胞上表达。DNA可包含能够表达该肽的表达载体。载体可选自本领域中的可用载体，并且可以包括pVAX、pcDNA3.0或provax。在一些实施方案中，该肽可以为选自以下的蛋白中所含的氨基酸序列:胰岛素、FSAl、Der-pl、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、葡萄糖-6-磷酸酶、透明带1、2或3、人肌球蛋白、柯萨奇病毒B4结构蛋白VP1、VP2、VP3或VP4、A群链球菌M5蛋白、II型胶原蛋白、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、Pendrin、乙酰胆碱受体α亚基、人S抗原和人IRBP。胰岛素肽可包含氨基酸序列 MRLLPLLALLA(S EQ ID NO: 5)或 SHLVEALYLVCGERG (SEQ ID NO:191)。MOG 肽可包含选自 HPIRALVGDEVELP(SEQ ID NO: 36), VGffYRPPF SR VVHLYRNGKD (SEQID NO:37), LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVL PVLLL (SEQ ID NO:38)、M0G1-22 (SEQ ID NO: 17)、M0G34-56 (SEQ ID NO: 18)和 M0G64-96 (SEQ ID NO:19)的氨基酸序列。甲状腺球蛋白肽可包含选自 NIFEXQVDAQPL(SEQ ID NO:155)、YSLE HSTDDXASFSRALENATR (SEQ ID NO:156)、RALENATRDXFIIC PIIDMA(SEQ ID NO: 157)、LLSLQEPGSKTXSK(SEQ ID NO:158)和EHSTDDXASFSRALEN(SEQ ID NO:159)的氨基酸序列，其中X为3，5，3，5-四碘甲腺原氨酸(甲状腺素)。TPO肽可包含选自 LKKR GILSPAQLLS (SEQ ID NO:160) ,SGVIARAAEIMETSIQ(SEQID NO:161)、PPVREVTRHVIQVS (SEQ ID NO: 162)、PRQQMNGLTS FLDAS (SEQ ID NO:163)、LTALHTLffLREHNRL(SEQ ID NO:16 4)、HNRLAAALKALNAHW(SEQ ID NO: 165)、ARKWGALHQIITL (SEQ ID NO:166), LPGLffLHQAFFSPffTL (SEQ ID NO: 167)、MNEELTERLFVLSNS ST (SEQ IDNO:168)、LDLASINLQRG (SEQ ID NO:169)、RSVADKILDLYKHpDN (SEQ ID NO:170)和 IDVffLGGLAENFLP (SEQ ID NO:171)的氨基酸序列。Pendrin 肽可包含选自 QQQHERRKQERK (SEQ IDNO:172) PTKEIEIQVDffNSE(SE Q ID NO:173)的氨基酸序列。葡萄糖_6_磷酸酶肽可包含选自 IGRP1325 (QHLQKDYRAYYTF) (SEQ ID NO: 8)、IGRP2335 (YTFLNFMS NVGDP) (SEQ ID NO:9), IGRP226238 (RVLNIDLLffSVPI) (SEQ I D NO:10), IGRP247259 (DffIHIDTTPFAGL) (SEQ ID NO:11)、G6Pa se- a 228240 (KGLGVDLLffTLEK) (SEQ ID NO: 12)、G6Pase_ a 249261 (EffVHIDTTPFASL)(SEQ ID NO:13)、UGRP21823tl (FTLGLDLSWS ISL) (SEQ ID NO:14)和 UGRP239251 (EWIHVDSRPFASL)(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。PLP 肽可包含选自 PLP30-49 (SEQ ID NO:28)、PLP40-60 (SEQ ID NO:29)、PLP180-199 (SEQ ID NO:30)、P LP184-199 (SEQ ID NO:31)和PLP190-209(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列。MBP 肽可包含选自 MBP66-88 (SEQ ID NO:21)、MBP85-99 (SEQ ID NO:22)、MBP86-105 (SEQ ID NO:23)、MBP143-168 (S EQ ID NO:24)、MBP83-97 (SEQ ID NO:25)和 MBP85-96 (SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。透明带 3 肽可包含选自 ZP3330342 (NSSS SQFQIHGPR) (SEQ ID NO:42)、ZP3335342 (QFQIHGPR) (SEQ ID NO:43)和ZP3330340 (NSSSSQFQIHG) (SEQ ID NO:44)的氨基酸序列。人肌球蛋白肽可包含选自SLKLMATLFSTYASADTCDSG KGKGGKKKG (氨基酸 614643 ;其中 Ac 为乙酰基)(SEQ ID NO:46)、GQFIDSGKAGAEKL (氨基酸 735-747) (SEQ ID NO:47)和 DE CSELKKDIDDLE (氨基酸 947-960)(SEQ ID NO:48)的a-肌球蛋白肽。柯萨奇病毒B4结构蛋白肽选自表1。群链球菌M5肽可包含选自 NT4(GLKTENEGLKTENEGLKTE) (SEQ ID NO:94)、NT5(KK EHEAENDKLKQQRDTL) (SEQID NO:95)、B1B2(VKDKIAKEQE NKETIGTL) (SEQ IDNO:96)、B2 (TIGTLKKILDETVKDKIA) (SE QID NO:97)、B3A(IGTLKKILDETVKDKLAK)(SEQ ID NO:98)和 C3 (KGLRRDLDASREAKKQ)(SEQ IDNO:99)的氨基酸序列和选自表2的M5肽。该肽可包含氨基酸序列(Q/R) (K/R)RAA(SEQ ID NO:190)。II型胶原蛋白肽可包含选自II型胶原蛋白的残基263-270 (SEQ ID NO:152)、184-198 (SEQ ID NO:153)和 359369 (SEQID NO:154)的氨基酸序列。AChR 肽可包含选自人AChRa 亚基的氨基酸 37-429、149-156、138-167、149-163、143-156、1-181 和 1-437 的氨基酸序列。人 S 抗原可包含选自肽 19(181-VQHAPLEMGPQPRAEATWQF-200) (SEQ ID NO:183)、肽 35(341-GFLGELTSSEVATE VPFRLM-356) (SEQ ID NO: 184)和肽 36 (351-VATEVPFRLMHPQPEDPAKE-370 (SEQ ID NO:185)的氨基酸序列。DNA可包含能够表达肽的表达载体。
[0055]在一些实施方案中，载体选自pVAX、pcDNA30和provax。
[0056]本文还提供了治疗I型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含胰岛素肽。治疗I型糖尿病的方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含疫苗促进剂、抗原胰岛素肽和编码胰岛素肽的DNA，并且其中肽对II类MHC的IC5tl为50nM或更低。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。在一些实施方案中，II类MHC在致耐受性树突细胞上表达。肽由氨基酸序列MRLLPLLALLA(SEQ ID NO:5)或SHLVEALYLVCGERG(SFQ ID NO:191)组成。
[0057]本文进一步提供了治疗多发性硬化的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含疫苗促进剂、多发性硬化自身抗原肽和编码肽的DNA，并且其中肽对II类MHC的IC5tl为50nM或更低。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5_(N_乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。在一些实施方案中，疫苗可包含髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)或少突胶质细胞特异性蛋白(OSP);以及 MOG 的肽。另外，肽可由选自 HPIRALVGDEVELP、VGffYRPPFSRVVHLYRN GKD 和LKVEDPFYWVSPGVLVLLAVLPVLLL 的氨基酸序列组成。
[0058]本文还提供了治疗自身免疫性卵巢疾病的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含透明带蛋白肽。本文进一步提供了治疗屋尘螨变态反应的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含抗原性屋尘螨I肽。
[0059]本文还提供了治疗哮喘的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗包含Der-p1、卵清蛋白或其他变应原。
[0060]本文进一步提供了治疗心肌炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含α -肌球蛋白肽、柯萨奇病毒Β4结构蛋白肽或A群链球菌Μ5蛋白肽。本文还提供了治疗类风湿性关节炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含肽(Q/R) (K/R)RAA(SEQ ID NO: 190)或II型胶原蛋白肽。本文进一步提供了治疗甲状腺炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球 蛋白或Pendrin肽。本文还提供了治疗重症肌无力的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含乙酰胆碱受体肽。本文进一步提供了治疗自身免疫性葡萄膜炎的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含人S抗原肽。
[0061]本文还提供了治疗屋尘螨变态反应的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用疫苗，其中疫苗可包含抗原性屋尘螨I肽和编码肽的DNA，并且其中肽对II类MHC的IC5tl为50nM或更低。
[0062]1.定义.[0063]本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案而非意在进行限制。如说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数个指代物。
[0064]对于本文数值范围的叙述，明确涵盖了其间有相同精确度的每个居间值。例如，对于6-9的范围而言，除6和9外还涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0而言，明确涵盖了数值 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0。
[0065]“肽”或“多肽”是连接的氨基酸序列并且可以为天然的、合成的或天然和合成的修改或组合。
[0066]当提到保护动物免遭疾病时，“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”意指预防、抑制、压制或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。抑制疾病涉及在诱发疾病后但是在其临床表现之前向动物施用本发明的组合物。压制疾病涉及在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的组合物。
[0067]“基本上相同的”可意指第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 个氨基酸的区域上至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。
[0068]“变体”可意指因氨基酸的插入、缺失或保守取代而使氨基酸序列不同但是保持至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体也可以意指氨基酸序列与具有保持至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白基本上相同的蛋白。在本领域中认为氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸置换一种氨基酸，通常涉及微小的变化。可通过考虑氨基酸的亲疏水性指数部分地鉴定这些微小变化。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，可取代具有相似亲疏水性指数的氨基酸并仍保持蛋白功能。在一个方面，取代亲疏水性指数为±2的氨基酸。氨基酸的亲水性也可用于揭露将会产生保持生物功能的蛋白的取代。在肽的背景下对氨基酸亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，该性质据报道是与抗原性和免疫原性密切关联的有用量度，美国专利号4，554，101，通过引用方式全部并入本文。正如本领域中所了解，取代具有相似亲水性值的氨基酸可产生保持生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值在彼此的±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链影响。与观测一致，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭露，了解到可与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链的相对相似性。
[0069]2.疫苗
[0070]本文提供了由疫苗促进剂、抗原和编码抗原的DNA组成的疫苗。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5- (N-乙基-N-异丙基阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利，并且更优选阿米洛利。该疫苗可诱导抑制抗原特异性T细胞功能的抗原特异性iTreg细胞。疫苗中抗原和编码抗原的DNA的组合有效诱导抗特异性抗原的iTreg细胞，比包含单独的抗原或其相应DNA的疫苗有效得多。该疫苗还增强II类MHC呈递和表达以进行iTreg细胞诱导。
[0071]用序列匹配的DNA和蛋白抗原联合免疫在体外和体内诱导⑶IIc+CD^1qwIL-1O+表型的调节性DC(DCreg)，其转而介导抗原特异性耐受。
[0072]常规DC(DC)为可大致分为⑶llc+ra8a+和⑶llc+CD8a_亚型的特化抗原呈递细胞(APC)，两者在免疫性或耐受性的诱导中均有明显的功能可塑性，这具体取决于其成熟状态。未成熟的DC(iDC)可通过将初始T细胞转化成⑶4+FoXp3+调节性T细胞(Treg)而促进耐受。得自疫苗的DNA构建体和序列匹配蛋白的信号可以按协调方式发挥作用以激活将正常DC转化成DCreg的调节性信号。
[0073]DNA和蛋白抗原联合免疫通过使同一 DC主要经小窝介导的内吞作用同时摄取DNA和蛋白免疫原而诱导DCreg。这一事件下调Cav-1的磷酸化而上调Tollip，其转而引发上调SOCSl而下调NF- κ B和STAT-1 α的下游信号转导。NF- κ B的下调解释了联合免疫诱导的DCreg的CD401oW和IL-10+表型。可在体外在原代DC和DC系中通过为其供给DNA和蛋白免疫原短至24h来产生DCreg。体外产生的DCreg可能通过诱导抗原特异性⑶25_iTreg而对治疗炎症性和自身免疫性疾病有效。
[0074]Cav-1是形成小窝的关键蛋白。它还通过区室化许多信号转导分子来调节信号转导。Cav-UTollip和IRAK-1形成复合物以抑制静息状态期间IRAK-1的激酶活性。一旦磷酸化，Cav-1就从复合物中解离，导致细胞溶质中的IRAK-1磷酸化和下游信号转导级联的活化，包括NF-κ B25的易位。DNA和蛋白的同时摄取下调Cav-1的磷酸化，从而防止NF-κ B活化。因此，DNA抗原和序列匹配的蛋白抗原可将正常DC转化成DCreg。为获得DCreg表型和功能需要相同的DC，并且同时摄取事件触发上调SOCSl而下调NF- κ B和STAT-1 α的Cav-1和Tollip相互依赖性信号转导。
[0075]iTreg细胞引起炎症性T辅助性细胞(THelper)和杀伤T细胞(Tmier)减少。iTreg抑制可通过与抗原呈递细胞(包括例如在肺或其他器官中的DC和上皮细胞)相互作用而发生，其中通过降低其迁出分子(egress molecule) SlPl的表达而保持抗原特异性iTreg细胞。相互作用上调了抗原特异性APC的趋化IP-1O的表达，其将CXCR3+炎症性T细胞捕获到上皮细胞(即TH1、TK1等)中。这些捕获的T细胞的20%经历细胞凋亡，然后少数转化成表达ILlO和TGF-β的Treg细胞。因此，炎症性T细胞在比如肺的器官中减少，而诸如哮喘的病症得以改善。
[0076]a.疫苗促进剂(“Na/K泵抑制剂”)
[0077]本文提供了在体外和体内促进DNA进入细胞的化合物。该化合物可以是钠(Na) /钾(K)泵抑制剂。Na/K泵抑制剂可以是5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利。该化合物优选地为阿米洛利，其通常用于管理高血压和充血性心力衰竭。阿米洛利具有以下结构:
[0078]
【权利要求】
1.一种包含疫苗促进剂、抗原肽和编码所述肽的DNA的疫苗，其中所述抗原肽/DNA刺激iTreg细胞并且其中所述疫苗促进剂为Na/K泵抑制剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促进剂包括5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苄阿米洛利或阿米洛利。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促进剂为阿米洛利。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗，其中所述抗原与选自变态反应、哮喘和自身免疫性疾病的病症相关。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述抗原与变态反应或哮喘相关并选自屋尘螨I肽、其片段及其变体。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述抗原与自身免疫性疾病相关并选自胰岛素肽、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白、透明带蛋白肽、屋尘螨I肽、α -肌球蛋白肽、柯萨奇病毒Β4结构蛋白肽、A群链球菌Μ5蛋白肽、(Q/R) (Κ/R) RAA, II型胶原蛋白肽、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、乙酰胆碱受体肽、人S抗原、其片段及其变体。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗，其中载体包含所述DNA。
8.根据权利要求7所述的疫苗,其中所述载体选自pVAX、pcDNA3.0和provax。
9.根据权利要求7 所述的疫苗，其中所述载体和抗原肽的质量比选自5:1和1:5，以及1:1 和 2:1。
10.一种疫苗接种试剂盒，包含疫苗施用装置和根据权利要求4所述的疫苗。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述疫苗施用装置选自疫苗枪、针和电穿孔>j-U ρ?α装直。
12.一种用于治疗自身免疫性疾病的方法，包括向对其有需要的患者施用根据权利要求4所述的疫苗。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为I型糖尿病。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗原选自胰岛素肽、其片段或其变体。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为多发性硬化。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗原选自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞特异性蛋白。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为自身免疫性卵巢疾病。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗原选自透明带蛋白肽、其片段及其变体。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为尘螨变态反应。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗原选自屋尘螨I肽、其片段及其变体。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为心肌炎。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗原选自α-肌球蛋白肽、柯萨奇病毒Β4结构蛋白肽、A群链球菌Μ5蛋白肽、其片段及其变体。
23.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗原选自肽(Q/R)(K/R)RAA、II型胶原蛋白肽、其片段及其变体。
25.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为甲状腺炎。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗原选自甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、pendrin肽、其片段及其变体。
27.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为重症肌无力。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗原选自乙酰胆碱受体肽、其片段及其变体。
29.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗原选自人S抗原、其片段及其变体。
31.根据权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为哮喘。
32.根据权 利要求31所述的方法，其中所述抗原选自屋尘螨I肽、其片段及其变体。
【文档编号】A61P37/00GK103998055SQ201180073866
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2011年9月30日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】B.王, S.耿 申请人:北京艾棣维欣生物技术有限公司