专利名称：硫氧还蛋白在治疗脓毒血症并预防其导致的mods药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用小分子蛋白质药物治疗疾病领域，更具体地说，涉及人源性硫氧还蛋白在发挥器官保护作用而治疗或预防脓毒血症导致的MODS的应用及其机制。
背景技术：
脓毒血症是一种常见而且致命的疾病，其实质是一种被恶性扩大的炎症反应。虽然人们认识炎症反应已有数十年，但最初对于这种炎症反应的定义千变万化。直到1992 年，美国胸内科医师学会(American College of Chest physicians, ACCP)和危症监护医学学会(Society for Critical Care Medicine, SCCM)将其统一定义为全身炎症反应综合症(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，并在此基础上衍生脓毒血症(s印sis)、重症脓毒血症(severe sepsis)和脓毒症性休克(Sepsis shock)。随着脓毒血症的进一步发展，往往会引起机体各个脏器的功能不全，出现多脏器功能障碍综合征 (Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)。由于人口的老龄化，介入性治疗及有创性监护增多，滥用抗生素使耐药菌增多，肿瘤、糖尿病、化疗、放疗、免疫抑制剂的应用，以及医院内感染增多等，使得脓毒血症的发病率也逐年攀升。脓毒血症是当今创伤外科和危重病医学领域中研究的热点课题。脓毒血症是一类与休克和感染等应激打击关系密切，很可能是由失控的全身炎症和细胞氧化代谢障碍所致的急性器宫损伤。因此脓毒血症和MODS密不可分，长久以来其发病率和死亡率一直居高不，尤其是在重症监护室，脓毒血症、MODS是引起死亡主要的原因之一，因此有关于脓毒血症的研究成了医学界一个挑战。目前缺少非常有效治疗脓毒症尤其是伴有MODS的方法，主要是对脓毒症发病机制还没有完全了解，因此建立一个合理的动物脓毒血症模型，有助于了解脓毒血症的发生过程，以及发展成MODS的过程，并为临床上解决脓毒血症提供有力的帮助。正是由于脓毒血症的高发病率、高死亡率，2002年10月欧美国家多个组织共同发起并签署了“巴塞罗那宣言”，呼吁全球医务人员、专业组织、政府、卫生机构甚至公众对该行动的支持，力争5年内将脓毒症的病死率减少25%。因此，人们对于这种疾病治疗的研究一直没有停止过。近来出现许多干预措施来治疗脓毒血症，如早期目标导向治疗(Early goal-directed therapy, EGDT)、激素(corticosteroid)以及重组人活化蛋白 C(recombinant human activated protein C，rhAPC)等等，但这些治疗都存在一定的局限性。在E⑶T问世4年后，Reuben等人调查了英国173个急救部门的实施情况，结果发现只有18. 8%的急救部门才能完整采取EGDT措施。至于激素的使用，一直存在争议，有研究者认为即使能短期改善患者的呼吸机使用天数或者减少ICU的天数，但这并不意味能够降低死亡率。rhAPC用于脓毒血症已有一段时间，虽然著名的PR0TOSS和ADDRESS临床实验证实能够降低脓毒血症的死亡率，但是亚组分析显示，在低危人群中(APACHE II<20)rhAPC没有治疗上的益处。正是由于目前的治疗还不足以解决脓毒血症的一系列问题，所以迫切需要新的治疗方法来干预疾病的进程，改善脓毒血症的预后。之所以出现上述治疗上的困难，主要由于目前对于脓毒血症的发病机制还不是最明确，往往认为其和内毒素(多由革兰氏阴性菌产生)相关。但临床事实是，近一半的患者血培养阴性，因为脓毒血症还可以继发于各种创伤、烧伤、胰腺炎等。即，对于脓毒血症导致的MODS，经过抗生素治疗可在疾病前期抢的关键治疗时间窗，而在病程发展中，细菌或病灶内细菌会释放出大量内毒素至血液，而对于此部分的损伤，抗生素治疗无效。细菌内毒素具有十分复杂的生物学活性，可引起一系列病理生理改变，包括休克、弥散性血管内凝血 (DIC)、引起或加重MODS至多器官衰竭(MFS)等。因此，拮抗内毒素及阻断或减弱其介导的损伤对脓毒血症及其导致的MODS具有重要临床意义。脂多糖(LPQ是革兰阴性细菌细胞壁的组成部分，包括脂质A(Lipid Α)、核心多糖、特异性多糖三个成分。习惯上即将LPS称为内毒素，其中由脂质A发挥内毒素活性，氧化应激及其后的脂质过氧化反应被证实是LPS 致死的重要原因。到目前为止，由于MODS的复杂病因及LPS所导致的广泛器官、组织损伤， 目前其治疗主要以支持疗法为主，包括抗生素和补液及升压药的使用。尽管近30年以来， 抗生素一代一代地更新，但脓毒血症及其导致的MODS的病死率并无明显下降。我们可以客观地评价，应用抗生素杀菌抑菌，以及一切常规治疗和支持治疗，并不能改善脓毒血症预后，我们必须探寻治疗的新对策。多粘菌素B(polymyxin B, PMB)虽能够灭活内毒素和抑制革兰阴性细菌，但由于其对肾有毒副作用，以及难以从血液中清除，因此血液给PMB治疗 MODS受到限制。因此，亟需开发一类效果可靠、副反应较少、应用简单的药物填补这一领域的空白。硫氧还蛋白(Trx)系统，包括Trx、Trx还原酶(TrxR)、NADPH和Trx过氧化物酶 (TrxP)，是一个控制细胞氧化/还原(redox)状态和细胞增殖/生存的、在细胞内广泛表达的氧化还原酶系统。在Trx的催化中心含有两个氧化还原敏感的胱氨酸组成的保守序列 胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨酸，即Trx的活性中心。Trx可以还原状态(硫氢键)或氧化状态(二硫键)存在，该活性中心硫氢键和二硫键的可逆转换参与细胞内的氧化/还原过程。因此，Trx系统被认为是除谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)系统之外的另一内源性抗氧化系统。除了氧化/还原酶的活性之外，Trx可通过调节中性粒细胞活性及迁移而发挥抗炎作用。重组人源性硫氧还蛋白(rhTrx)可治疗一些伴有白细胞浸润的疾病，包括细胞因子或抗癌药物诱导的肺损伤、短暂定位性脑缺血、自体免疫性心肌炎等。然而，rhTrx可否用于治疗动物MODS在国内外却鲜有报道。因此，本发明拟阐述的内容是确认rhTrx在治疗或预防动物MODS时的疗效并解释其具体作用机制。
发明内容
本发明的目的在于确认人源性硫氧还蛋白对动物脓毒血症的治疗效果或预防效果、尤其是其对伴发MODS的动物的被损伤器官的修复作用，以及对可能伴发MODS的动物的器官的保护作用，并解释其具体作用机制，以期为应用小分子蛋白质药物治疗或预防疾病领域，如脓毒血症，提供直接依据。本发明公开了人源性硫氧还蛋白在制备治疗动物脓毒血症的药物中的应用，特别是在制备治疗动物脓毒血症引发的MODS的药物中的应用，所述药物用于在患有脓毒血症的动物中，可减轻动物的心脏损伤、肺损伤、肝脏损伤、肾损伤，其中人源性硫氧还蛋白的有效剂量为0. 5mg/kg动物体重。本发明还公开了人源性硫氧还蛋白在制备预防动物脓毒血症引发的MODS的药物中的应用，所述药物保护可能患有脓毒血症动物的器官免于受损，其中人源性硫氧还蛋白的有效剂量为0. 5mg/kg动物体重。上述应用中，所述动物为猪或人。本发明还公开了一种用于治疗或预防动物脓毒血症引发的MODS的药物组合物或药用制剂，其包含治疗有效剂量的人源性硫氧还蛋白和药学上可接受的载体。其中，用腹腔注射0. 5mg/Kg的人源性硫氧还蛋白治疗动物脓毒血症导致的MODS 时，显著提高了危重脓毒血症的生存率。人源性硫氧还蛋白治疗动物脓毒血症导致的MODS时，可显著降低血清Trop I、 mb、CKmb含量，即减轻脓毒血症模型的心脏损伤。人源性硫氧还蛋白治疗动物脓毒血症导致的MODS时，可显著降低每分呼吸次数， 并减少肺部渗出，从而防止呼吸窘迫并降低肺损伤。人源性硫氧还蛋白治疗动物脓毒血症导致的MODS时，可显著降低血清AST/ALT、 AST及血清总胆红素浓度，从而减轻致死性脓毒血症模型的肝脏损伤，提高危重脓毒血症的生存率。人源性硫氧还蛋白治疗动物脓毒血症导致的MODS时，可显著降低血清肌酐、尿素含量，即显著降低肾损伤，可维护血液各细胞稳态，即降低血细胞损伤。本发明的研究表明，人重组硫氧还蛋白分子量小，生物学活性强，而且给药后反应迅速，生物利用度好，有着很好的临床应用前景。申请人:还发现1.在用腹腔注射2. 0mg/Kg的LPS制作猪脓毒血症导致的MODS模型时，可使心、 肺、肝、肾等重要器官发生损伤，并出现功能障碍。且实验动物在损伤后8小时内全部死亡。2. Trx可以治疗猪脓毒血症导致的MODS在于可以在在体情况下与LPS发生特异性
纟口口。总之，上述研究证实，硫氧还蛋白可以明显减轻脓毒血症症状，还可以保护脓毒血症动物的器官，如减轻心脏损伤、防止呼吸窘迫、降低肺损伤、减轻肝脏损伤、降低肾损伤等。当可能导致脓毒血症的感染源进入了动物体，给予该动物体硫氧还蛋白后，可以避免脓毒血症及其导致的MODS的发生，提升动物的生存率。本发明的使用对象是发生脓毒血症和/或伴发MODS、尤其是心肺损伤症状严重的患者。本发明简单易行，且无特殊禁忌症，可在大医院、小诊所等广泛使用。
图1腹腔注射2. 0mg/kg的LPS，可成功建立猪脓毒血症导致的MODS模型，以心肺损伤最为明显，并使实验动物全部死亡；A 2. 0mg/kg的LPS使得实验动物全部死亡；B 2. 0mg/kg的LPS可造成心脏损伤；C 2. 0mg/kg的LPS造成呼吸窘迫及肺部渗出；D 2. 0mg/kg的LPS造成肝功能受损；
E 2. Omg/kg的LPS造成肾功受损；实验数据经统计学处理后，用均数士标准差表示，* control vs. 2. Omg/kg ；# control vs. 1. 5mg/kg ； Δ :1. 5mg/kg vs. 2. Omg/kg 氺，ρ < 0. 05 ；氺氺，ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001。图2给予Trx治疗，可以减轻动物脓毒血症损伤，以心肺保护作用最为明显，并显著提高动物生存率；A =Trx治疗显著模型生存率；B =Trx治疗显著减轻心脏损伤；C =Trx治疗显著环节呼吸窘迫并减少肺部渗出；D =Trx治疗显著减轻肝脏损伤；E =Trx治疗显著降低肾脏损伤；实验数据经统计学处理后，用均数士标准差表示，* control vs. LPS ；# control vs. LPS+Trx ； Δ :LPS vs. LPS+Trx。氺，ρ < 0. 05 ；ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001ο图3给予Trx治疗，可以减轻动物MODS时血细胞损伤；A =Trx维持嗜碱粒细胞绝对值；B =Trx稳定红细胞计数；C =Trx稳定血细胞比容；D =Trx稳定血小板计数；E:Trx稳定白细胞计数；F =Trx稳定嗜碱粒细胞百分率；G =Trx稳定红细胞分布宽度CV ；H =Trx 稳定红细胞分布宽度 SD ；* :control vs. LPS ；# :control vs. LPS+Trx ； Δ LPS vs. LPS+Trx。氺，ρ < 0. 05 ；氺氺，ρ < 0. 01 ；氺氺氺，ρ < 0. 001。图4猪MODS模型血清中，LPS可以与Trx特异性结合的免疫共沉淀检测图。以下结合附图和发明人给出的实验及其结果对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式1.建立动物MODS模型及研究方案用脂多糖(LPS，2. Omg/kg)处理成年小香猪，检测机体多个器官的损伤情况，并观察动物存活时间。其中，在给予LPS处理后全程采用床旁监护仪监测动物生命体征，并在 LPS后1、2、4、6小时，检测心损三项、肝功七项、肾功两项、血常规等血清学指标，每次抽取血液12ml，并在6小时时行X线平片观察肺部损伤。1)猪MODS模型的建立及Trx治疗体重为15到20公斤的雄性小香猪，随机分组， 每组动物6-8只。动物禁食12h，自由饮水，肌肉注射戊巴比妥(3%，0.8ml/kg)予以镇静。 将实验动物仰卧固定于手术台上，消毒备皮，并使用小棉被为动物保暖。使用22G静脉留置针建立耳缘静脉通路，予盐酸氯胺酮10mg/kg/h和芬太尼5 μ g/kg/h持续镇静麻醉，并随时根据动物麻醉情况进行调整。使用微量注射泵输注乳酸林格氏液补液，补液量按照每个时间点之间的血液损失量进行。动物监护及处理情况以临床护理5岁儿童为参考进行。2)股动脉有创血压监测消毒备皮股动脉搏动处，钝性分离股动脉，结扎股动脉远心端，置肝素化后的4FrPiCC0动脉导管穿刺入股动脉，供抽取动脉血标本用并缝线固定。肝素化生理盐水浸润Picco重症监护仪上的血管能量转换器，并连接动脉导管。观察是否有随脉搏一致的管内血液波动情况，如果没有，说明并未连接成功，继续调整或重新穿刺。3)检测动物一般情况将Picco重症监护仪数值调零，监测动物心率、血压(收缩压、舒张压、平均动脉压)、体温、血氧饱和度、呼吸等各项生理指标。平衡15-30分钟，待各项指标趋于平稳。4)使用LPS按2. Omg/kg剂量腹腔注射建立猪MODS模型LPS (Sigma, L28801)，使用生理盐水稀释到8ml，然后行腹腔注射。使用Trx进行治疗时，在LPS腹腔注射后，立即在腹腔另一侧按照0. 5mg/kg的剂量注射。5)血清样本采集在LPS损伤后1、2、4、6小时，和/或给予1Trx治疗后1、2、4、6、 12、24、48、72、120、168小时进行采集，对照组血清样本采集时间同Trx治疗组。样本分别用于心损三项、肝功七项、肾功两项、血常规、内毒素含量检测、其他实验室检测所用的血清样本量，每次约12ml。6)肺湿干比重处死动物后，用组织钳夹住右肺中叶，取出整个右侧肺叶。擦干净表面血液后，称重。放入80摄氏度烘箱内，烘干3天至重量不再变化。7) X线胸腹平片采集在处理后6小时时，将动物捆绑成仰卧位，并保持持续麻醉状态，行X线胸腹部平片拍摄。8)统计学处理所有数据采用SPSS 11. 5统计软件进行统计分析，测定结果均采用均数士标准差表示。组间统计采用双因素方差分析结果腹腔注射2. Omg/kg的LPS，可成功建立猪MODS模型。如图1所示，2. Omg/ kg的LPS使得实验动物全部死亡。2. Omg/kg的LPS可造成心脏损伤、造成呼吸窘迫及肺部渗出、造成肝功能受损、造成肾功受损，其中，以心肺损伤最为明显。2、对患有MODS的动物给予人源性硫氧还蛋白通过基因重组的方法获得人源性硫氧还蛋白。对患有MODS的动物给予人源性硫氧还蛋白(0. 5mg/kg)，检测机体多个器官的损伤情况，并观察动物存活时间。在LPS腹腔注射后，立即使用0. 5mg/kg的Trx注射入腹腔。为确定Trx最低有效剂量的数值，我们采用了 0. 5mg/kg、2mg/kg两种治疗剂量，结果发现两组治疗结果之间无统计学差异(数据未显示)。检测方法及指标同上。从图2中可以看出，给予人源性硫氧还蛋白治疗后，可以减轻猪MODS损伤。人源性硫氧还蛋白治疗显著减轻心脏损伤，显著缓解呼吸窘迫并减少肺部渗出，显著减轻肝脏损伤，显著降低肾脏损伤，其中，以心肺保护作用最为明显，并显著提高了动物生存率。3、进一步试验，用免疫共沉淀检测LPS与Trx的结合情况，发现Trx治疗MODS时可与LPS发生结合。1)用预冷所需工具，准备干冰，切IOOmg组织；2)加入预冷的 RIPA Buffer ；3)将组织裂解并把悬液转到1. 5EP管中，4°C，缓慢晃动15min (EP管插冰上，置水平摇床上)；
4) 40C，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；5)准备ftOtein A agarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；6)每 Iml 总蛋白中加入 100 μ 1 Protein A 琼脂糖珠(50% )，4°C摇晃 IOmin (EP 管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；7)4°C，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ftx)tein A珠子；8)Bradf0rd法做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1 10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量，分装后，可以在-20°C保存一个月)；9)用PBS将总蛋白稀释到约1 μ g/μ 1，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高(如IOyg/μ 1)；10)加入一定体积的兔抗到500μ 1总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异；11)4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温池，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2h室温孵育；12)加入ΙΟΟμΙ Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温lh，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μ 1 “过渡抗体”(兔抗鼠 IgG)；13) HOOOrpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的 RIPA buffer洗3遍，800 μ 1/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS;14)用60μ 1 2Χ上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混勻，缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μ 1足够上三道)；15)将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20°C，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。16)行SDS-PAGE变性胶电泳，电泳后转膜，并使用Trx抗体、LPS抗体进行检测。4、Trx药代动力学、一般药理、动物急性毒性试验、用药部位刺激和注射用药过敏试验研究采用小鼠、大鼠、家兔作为实验动物，进行毒性、过敏原、半衰期、药物代谢途径、 动物行为及一般情况等。其中小鼠、大鼠采用肌肉注射给药方式，给药量2. 0mg/kg;家兔采用肌肉注射给药方式，给药量同上。结果发现对Trx的药代动力学研究采用双抗体夹心ELISA法，代谢方式符合一室 (im)开放模型，呈一级动力学消除。肌注绝对生物利用度为70.0% (小鼠)；肾、肺组织中分布最高；半衰期在小鼠体内是1小时；药物以降解产物形式主要通过尿液排泄。对Trx的一般药理研究发现对大鼠自发性活动、平衡和一般行为无影响；对心率、 心电图、血压、呼吸频率及幅度无影响。Trx动物急性毒性试验发现小鼠、大鼠的最大耐受量分别为人临床拟用量的675 和253倍，说明本品对小鼠、大鼠均不能引出急性毒性反应。rhTrx毒性太低，无法测得 LD50。Trx用药部位刺激和注射用药过敏试验发现家兔肌肉注射无刺激性，组织大体解剖观察及病检均未见异常，不引起过敏反应。2.研究结果1)外源性给予动物2. Omg/kg的LPS处理，可机体重要器官发生损伤即诱发MODS， 并造成生存率急剧下降；2)给予Trx治疗可以显著降低心、肺、肝、肾等重要脏器的损伤，并提高动物生存率。综上所述，申请人利用动物脓毒血症诱导MODS模型研究发现，该模型小香猪心、 肺、肝、肾功能均受到严重损伤，并且使得动物生存率急剧降低。而给予Trx治疗之后，不仅避免了脓毒血症动物MODS的发生，而且使得动物生存率大大提升。Trx治疗机制与内毒素通过糖基化反应和Trx结合有关，从而明显减轻脓毒血症及其引发的MODS症状，有潜在的临床应用价值。脓毒血症可以出现在多系统的多种疾病中，发生率也相对较高。除导致致死性休克、弥漫性血管内凝血等，脓毒血症通常还会直接或间接损害心、肺、肝、肾等重要脏器，诱发MODS，病死率极高。因此脓毒血症的主要治疗原则之一减少内毒素的产生和吸收，申请人则在国际上首次发现硫氧还蛋白可通过糖基化反应中和内毒素，从而减轻机体重要脏器损伤，促进各个器官功能回复，在脓毒血症中发挥器官保护作用；且人源性重组硫氧还蛋白分子量小，生物利用度好；相比于动物源性制剂，免疫原性小；腹腔注射，简单方便。因此，它在脓毒血症及其引发的MODS的治疗方面有着良好的应用前景。
权利要求
1.人源性硫氧还蛋白在制备治疗动物MODS(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)的药物中的应用，所述药物用于在患有MODS的动物中，可降低血清Trop I、mb、CKmb 含量，即减轻患有MODS疾病的动物的心脏损伤；可降低每分钟呼吸次数，并减少肺部渗出， 从而防止呼吸窘迫并降低肺损伤；可降低血清AST/ALT、AST及血清总胆红素浓度，从而减轻由致死性脓毒血症引起的肝脏损伤，提高危重脓毒血症的生存率；可降低血清肌酐、尿素含量，即降低肾损伤，可维护血液各细胞稳态，即降低血细胞损伤。
2.人源性硫氧还蛋白在制备预防动物MODS的药物中的应用，所述药物保护可能患有 MODS的动物的器官免于受损。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述器官为心脏、肺、肝脏、肾脏。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于所述动物为猪。
5.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于所述动物为人。
6.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于其中人源性硫氧还蛋白的有效剂量为0. 5mg/kg动物体重。
全文摘要
本发明公开了一种人源性小分子抗氧化抗炎蛋白质一硫氧还蛋白(Trx)在制备治疗脓毒血症及预防其导致的多器官功能障碍(MODS)中的应用；硫氧还蛋白可以明显减轻脓毒血症症状，还可以保护患有脓毒血症疾病动物的器官，防治MODS的发生，如减轻心脏损伤、防止呼吸窘迫、降低肺损伤、减轻肝脏损伤、降低肾损伤等。当可能导致脓毒血症的感染源进入了动物体，给予该动物体硫氧还蛋白后，可以避免MODS的发生，提升动物的生存率。
文档编号A61P7/00GK102552887SQ20121000673
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者刘静祎, 屈延, 许爱斌, 陶凌 申请人:陶凌