专利名称：抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水牛髓样触发受体1基因(TREMl)，尤其是一种抑制水牛TREMl基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
背景技术：
水牛是我国南方重要的农业生物资源，它具有适应性强、耐高温高湿、易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，如今已成为极具开发价值的家畜品种。然而，水牛的低繁殖力、较高的疾病发生率却严重制约了我国水牛产业的发展。其中，布氏杆菌病引起的母牛流产、不育在实际生产中极其常见，这不仅给畜牧业造成重大的经济损失，而且严重威胁人类健康。长期以来，对布氏杆菌病的治疗手段主要是使用抗菌素和疫苗，前者容易产生耐药性，后者免疫效果不稳定、持续时间短。因此，如何有效控制布氏杆菌病仍是一项重大挑战，亟需寻求一种新的防治途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抑制水牛TREMl基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案抑制水牛TREMl 基因表达的 shRNA，该 shRNA 为 shRNA_TREM194 或 shRNA_TREM294， 它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；loop环的碱基序列为TTCAAGAGA ；终止信号的碱基序列为TTTTTTT ；shRNA-TREM194的正义链具有序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ. ID. No. 4的碱基序列；shRNA-TREM294的正义链具有序列表SEQ. ID. No. 5的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ. ID. No. 6的碱基序列。上述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，该载体是pSicoR-GFP-shTREM-194 或 pSicoR-GFP-shTREM-294。上述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，该慢病毒表达载体由合成的shRNA-TREM194或shRNA_TREM294分别克隆入慢病毒表达载体 pSicoR-GFP 中而得。上述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA在抑制水牛TREMl基因表达方面的应用。上述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛TREMl基因表达方面的应用。上述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
上述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。发明人通过了解布氏杆菌病发生的分子机制，研究其信号转导通路为其防治提供新的思路和方向。髓样触发受体1 (TREMl)是专一表达于中性粒细胞、CD14单核/巨噬细胞等髓样细胞表面的跨膜糖蛋白，由其介导的信号通路在炎症反应和级联放大中起重要作用，它还与Toll样受体-4(TLR-4)在LPS所致炎症反应中存在协同效应。因此，作为革兰氏阴性菌脂多糖LPS诱导的免疫反应信号路径中一个重要的靶基因，抑制TREMl基因的表达有可能改变一些其他相关因子的表达。为此，发明人利用分子和细胞生物学技术，首先克隆得到水牛髓样触发受体 1 (TREMl)全长编码区，构建了水牛TREMl基因融合蛋白表达载体，设计并构建水牛TREMl基因shRNA慢病毒表达载体；然后，采用脂质体转染方法将水牛TREMl基因融合蛋白表达质粒和其shRNA慢病毒表达载体共转入293细胞，收集细胞检测水牛TREMl基因在293细胞中的表达，快速筛选获得高效抑制水牛TREMl基因的shRNA干扰序列。本发明研究工作包括以下基本步骤<1>水牛TREMl基因的克隆、融合蛋白表达载体的构建及其表达检测克隆得到水牛TREMl基因mRNA的ORF全长序列，经过测序验证序列正确后，将其定向插入PDsRed-Nl载体中，构建水牛TREMl基因的融合蛋白表达载体，酶切验证阳性重组质粒pDsRed-Nl-TREMl ；重组质粒pDsRed-Nl_TREMl经脂质体转染方法导入293细胞，细胞培养4 后，荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况；收集细胞，采用RT-PCR方法检测水牛 TREMl基因在293细胞中的表达。<2>shRNA的设计及其慢病毒表达载体的构建、细胞检测针对黄牛TREMl基因[GenBank :NM_206970. l]CDs序列，参照siRNA设计原理，选择 5 个 siRNA 序列作为靴位点(96-104bp，194_213bp，294-312bp, 578_596bp，643_661bp)， BLAST比对确认以上序列与其他基因序列无同源性。将其设计为shRNA结构，shRNA结构包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环(TTCAAGAGA)，19nt的siRNA反义链和终止信号(TTTTTTT)，shRNA 两端引入酶切位点 XhoI、NotI。分别命名为 shTREM_96，shTREM-194, shTREM294, shTREM578, shTREM643。同时选择一个无关序列 shTREM_1864(N. C)作为阴性对照。合成shRNA序列并克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中，酶切和测序验证。shRNA 慢病毒表达载体(pSicoR-GFP-shTREM-96/194/^94/578/643/N. C)经脂质体转染方法导入 293细胞，转染4 后，荧光显微镜下观察细胞水平上各shRNA片段表达情况。<3>抑制水牛TREMl基因表达shRNA序列的筛选采用共转染的方法，将目的基因水牛TREMl基因表达载体(靶质粒)与shRNA表达载体(干扰质粒)分别以不同剂量比例经脂质体共转染入293细胞，转染4 后，荧光显微镜下观察细胞荧光情况。通过实时定量PCR(Real-Time RT-PCR)方法在mRNA水平检测 TREMl基因的表达，计算各shRNA片段抑制效率。通过上述步骤，发明人快速获得了本发明的高效稳定抑制水牛TREMl基因表达的 shRNA序列shTREM-194和shTREM494。实验显示，当靶质粒(pDsRed-Nl-TREMl)与干扰质粒(shTR-96/194/294/578/643)以 1 3 比例转染时，shTR-194 和 shTR-294 对 TREMl 的抑制效率分别为36. 93%和20. 76% ；以1 1的比例共转染时，shTR-194和shTR-294的抑制效率分别为46. 14%和50. 73%。这展示了其在布氏杆菌病防治中的一定的应用前景， 也为下一步在巨噬细胞系中，研究TREMl基因的抑制对脂多糖LPS诱导的免疫反应信号转导路径中其他相关因子的影响奠定了重要的实验基础。
图1是水牛TREMl基因融合蛋白表达载体pDsRed-Nl_TREMl结构示意图。图2是抑制水牛TREMl基因表达的shRNA慢病毒表达载体结构示意图。图3是靶质粒和干扰质粒共转染(剂量比1 3) 293细胞实时荧光定量PCR检测图。图4是靶质粒和干扰质粒共转染(剂量比1 1)293细胞实时荧光定量PCR检测图。
具体实施例方式一、相关表达载体的构建1.水牛TREMl基因表达载体的构建根据GenBank中收录的牛TREMl基因CDs序列[GenBank :NM_206970. 1]设计弓丨物，并在上下游引物的5，端(CTCGAG和GGTACC)分别引入XhoI.Kpnl酶切位点，引物为TREMl-上游 5，CTCGAGAGAACAGTTGGAGTCAGTGC-3，(序列表 SEQ. ID. No. 13)，TREMl-下游 5，GGTACCGACCTATGCGTGACAGCAAA-3，(序列表 SEQ. ID. No. 14)。从屠宰场取水牛新鲜脾脏组织，放入预先加有Iml RNA保护剂的^iil EP管中。用 Trizol裂解法提取总的RNA，反转录为cDNA。以水牛脾脏cDNA为模板，扩增得到水牛TREMl 基因的ORF全长序列(序列表SEQ. ID. No. 21)，扩增长度为7Mbp，将PCR产物回收后插入 PMD18-T载体，命名为pMD18-T-TREMl，用BioI和KpnI酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳可看到长度分别为2. 7kp和715bp的条带，证明已成功插入。将重组质粒pMD18-T-TREMl 送上海生工测序，测序结果经Blast比对，与NCBI中黄牛TREMl基因同源性为97.2%。用BioI和KpnI双酶切pMD18_T_TREMl，胶回收7Mbp的片段。用同样的酶线性化 pDsRed-ΝΙ载体。将TREMl基因片段定向插入载体pDsRed-Nl中，重组质粒用XhoI和KpnI 进行酶切鉴定正确。水牛TREMl融合蛋白表达载体pDsRed-Nl-TREMl结构如图1所示。2. shRNA慢病毒表达载体的构建采用siRNA设计软件，针对TREMl基因ORF序列，选择5个不同的靶位点作为靶序列(96-104bp，194-213bpJ94-312bp，578-596bp，643-661bp)，并将其设计为包含 19nt 的 siRNA正义链、9nt的loop环(TTCAAGAGA)和19nt的siRNA反义链的shRNA结构，分别命名为 shTREM-96，shTREM-194，shTREM294, shTREM578, shTREM643 ；同时选择一个无关序列 shTREM-1864(N. C)作为阴性对照(见表1)。合成5条shRNA序列和1条阴性对照序列，并克隆入慢病毒表达载体PSicoR-GFP中，测序验证，并用BioI和NotI双酶切验证。构建的 shRNA表达载体结构如图2所示。表IshRNA序列结构
权利要求
1.一种抑制水牛TREMl基因表达的shRNA，其特征在于该shRNA为shRNA_TREM194或 shRNA-TREI\C94，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA ；所述终止信号的碱基序列为TTTTTTT ；所述shRNA-TREM194的正义链具有序列表SEQ. ID. No. 3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ. ID. No. 4的碱基序列；所述shRNA-TREiC94的正义链具有序列表SEQ. ID. No. 5的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ. ID. No. 6的碱基序列。
2.根据权利要求1所述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，其特征在于该载体是pSicoR-GFP-shTREM-194 或 pSicoR-GFP-shTREM-294。
3.根据权利要求2所述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于所述慢病毒表达载体由合成的所述shRNA-TREM194或shRNA_TREM294分别克隆入慢病毒表达载体PSicoR-GFP中而得。
4.根据权利要求1所述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA在抑制水牛TREMl基因表达方面的应用。
5.根据权利要求2所述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛TREMl基因表达方面的应用。
6.根据权利要求1所述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
7.根据权利要求2所述抑制水牛TREMl基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA，该shRNA为shRNA-TREM194、或shRNA-TREM294，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号。该shRNA能高效抑制水牛TREM1基因的表达。本发明还公开了上述shRNA的慢病毒表达载体及其构建方法。实验证实，应用本发明的shRNA可有效稳定地抑制水牛TREM1基因表达，展示了在布氏杆菌病防治中的一定的应用前景，也为进一步了解TREM1在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用奠定了基础。
文档编号A61K48/00GK102517287SQ20121000652
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者乔树叶, 李湘萍, 李美青, 石德顺, 路新梅 申请人:广西大学