专利名称：视黄酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用的制作方法
视黄酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及视黄酸促进细胞RXRa蛋白表达的新应用。
背景技术：
视黄酸，又称维生素甲酸、维甲酸、异维A酸等，是动物体内维生素A的代谢中间产物。分子式=C20H28O2,分子量300. 44，CAS号302-79-4，熔点180°C。人体摄入β _胡萝卜素后，会在需要时被人体转换成维生素Α。维生素A的功能是通过不同的分子形式实现的 对于视觉起作用的是视黄醛，对生殖过程起作用的是视黄醇，而视黄酸及其代谢产物则对其它功能具有重要作用。自然界大约有100种化学结构与β胡萝卜素相似的类胡萝卜素 (carotenojds).主要存在于黄色或红色的植物中。β _胡萝卜素在肠道被肠粘膜β _胡萝卜素加氧酶氧化生成2个分子的视黄醇，即维生素A (简称VA)。后者被吸收入体内被氧化成视黄醛，再进一步被氧化成视黄酸(又称维甲酸retinoic acid简称RA)，视黄酸是一种脂溶性的小分子物质，属于维生素A的衍生物，是细胞生长、分化增殖、凋亡的调节因子，参与胚胎发育、组织分化、肿瘤生长等过程。视黄酸必需与其受体，即视黄酸受体结合后，形成蛋白质-核酸的结合形式才能发挥生物学作用。
视黄酸的受体包括两类视黄酸受体(RAR)和视黄醇类X受体(RXR)，RAR和R)(R作为细胞内独立而又相互关联的两大受体信号系统，它们又分别包括α，β和Y三种亚型， 每种亚型在各种组织和细胞中的表达不同，导致其多重、复杂的生理功能。
RXR是留体激素受体超家族中研究较为深入的成员。由于它能与其他核受体形成异源二聚体，调控特定基因的转录活性，从而产生不同的生物效应，其选择性配体可作为治疗淋巴瘤、皮肤癌和糖尿病等疾病潜在的药物。发明内容
本发明的发明目的是提供一种视黄酸的新应用，即视黄酸在制备促进细胞RXRa 蛋白表达药物中的应用，视黄酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。本发明同时要求保护视黄酸作为调控乳腺癌增殖的生物标记物的应用。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象，观察视黄酸(ATRA)对乳腺癌细胞增殖的影响及ATRA对细胞RXRa蛋白表达水平的影响，结果发现(1)在100 1000 nM/L范围内，ATRA可抑制细胞的增殖，并且存在 ATRA的浓度依赖性，即ATRA浓度越高，对MDA-MB-231细胞的生长抑制效果越明显；O) 100 nM/L的ATRA作用乳腺癌细胞MDA-MB-23148h后，可抑制细胞的增殖；(3) 100 1000 nM/ L的ATRA作用乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞72小时后，可诱导RXR α的表达增加，并且存在 ATRA的浓度依赖性，即ATRA浓度越高，诱导RXR α的表达越明显。
因此，本发明要求保护视黄酸在制备促进细胞RXRci蛋白表达药物中的应用，优选的技术方案中，视黄酸的浓度为lOOnm/L以上，并且作用时间为48小时以上。
本发明要求保护视黄酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用，优选的技术方案中，视黄酸的浓度为lOOnm/L以上，并且作用时间为48小时以上。
本发明要求保护视黄酸作为调控乳腺癌增殖的生物标记物的应用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.本发明首次发现浓度为lOOnm/L以上的视磺酸作用人乳腺癌细胞48小时以上后可以促进细胞RXRa蛋白表达，抑制细胞增殖。
图1为实施例一中不同浓度的ATRA作用72小时后，对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖的影响；图2为实施例一中100 nM/L的ATRA作用不同的时间，对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖的影响；图3为实施例一中不同浓度的ATRA作用72小时后，对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞 RXRa蛋白表达的影响；图4为实施例一中100 nM/L的ATRA作用不同的时间，对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞 RXRa蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一材料细胞株人乳腺癌MDA-MB-231细胞。RA购买于美国Sigma公司，用乙醇溶解成贮存液，用细胞培养液稀释到最后使用工作浓度。DMEM、PBS、胰酶、MTT、DMS0购自美国Gibco 公司。特级胎牛血清(澳洲源)，购自维森特公司。RXRA抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，化学发光试剂购自Amersham公司。
仪器ELx800型酶联免疫检测仪，Western blot仪器(SDS-PAGE电泳仪，电泳槽， 转膜仪，摇床，离心机，暗室)。
(1)细胞培养:MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37°C，5% 的(X)2培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。
(2)细胞增殖实验细胞以5X103/ml接种于96孔培养板中，每孔200μ1，每组设 20个复孔，同时设立空白对照，待细胞贴壁后给予不同的处理。处理后的细胞，继续培养一定的时间，每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制)20 μ 1，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内的上清培养液，每孔加150 μ 1 DMS0，振荡15min，使结晶物充分融解。选择570 nm波长，空白对照调零，在酶标仪上测定各孔的光吸收值，记录结果，做图分析。
细胞给予以下两种处理①ATRA与细胞增殖的剂量反应关系细胞给予10，50，100，200，1000 nM/L的ATRA处理，作用7 后分别用MTT进行比色检测。
结果发现不同浓度的ATRA作用7 后，对MDA-MB-231细胞的增殖影响与ATRA 的浓度存在关系，在0-10 nM/L时，ATRA可促进细胞增殖，而在100-1000 nM/L范围内，ATRA 可抑制细胞的增殖，并且存在ATRA的浓度依赖性，即ATRA浓度越高，对MDA-MB-231细胞的生长抑制效果越明显，结果见图1。
②ATRA与细胞增殖的时间依赖关系细胞给予100 nM/L的ATRA处理，作用Mh， 48h，72h后，分别用MTT进行比色检测。
结果发现与对照组相比，100 nM/L的ATRA对细胞的增殖作用，与其作用时间有关。ATRA作用Mh内，并未对细胞的增殖产生抑制效应，反而促进细胞的增殖，而作用4 后，可抑制细胞的增殖，结果见图2。
(3) RXRa蛋白表达水平的测定细胞给予不同的处理后，采用flfestern blot，测定RXR α蛋白的表达，具体实验步骤如下50μ g总蛋白，采用10% SDS-PAGE分离，采用电转移方法，将蛋白转至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS冲洗后，加入抗RXRA抗体， 4°C卵育1小时，含0. 1% Tween的PBS冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，4°C卵育1 小时，含0. 1 % Tween的PBS冲洗后，加入化学发光剂进行曝光。测定actin蛋白的表达水平作为样品内参对照。
细胞给予如下处理①细胞给予不同浓度(10，50，100，200，1000 nM/L)的ATRA处理7 后，收蛋白样，测定RXRa蛋白的表达水平，以观察ATRA的浓度与RXRa表达水平的关系；结果发现细胞给予0，10，50，100，200，1000 nM/L的ATRA处理72h后，收蛋白样， Western blot测定RXRa蛋白表达的变化，结果如图3。从图中可以看出，与对照组相比， 100 nM/L的ATRA处理即可诱导RXR α的表达增加，并且存在ATRA的浓度依赖性，即ATRA 浓度越高，诱导RXRa的表达越明显，而10，50 nM/L的ATRA，并不能明显诱导RXRα的表达。
②细胞给予100 nM/L的ATRA处理后，分别作用Mh，48h后，测定RXRα蛋白的表达水平，以观察ATRA的作用时间与RXRa表达的关系；结果发现细胞给予100 nM/L的ATRA处理Mh，48h，7 后，收蛋白样，Western blot 测定RXR α蛋白表达的变化，结果如图4。从图中我们可以看出，100 nM/L的ATRA处理Mh 后即可诱导RXRa的表达增加，且存在时间依赖性。
注本实施例中以未经任何处理的细胞作为对照；统计学处理采用t检验进行差异比较，检验水准a =0.05。
权利要求
1.视黄酸在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
2.视黄酸在制备促进细胞RXRa蛋白表达药物中的应用。
3.视黄酸作为调控乳腺癌增殖的生物标记物的应用。
全文摘要
本发明提供了一种视黄酸的新应用，即视黄酸在制备促进细胞RXRα蛋白表达药物和治疗乳腺癌药物中的应用，以及视黄酸作为调控乳腺癌增殖的生物标记物的应用。本发明以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象，观察视黄酸对乳腺癌细胞增殖的影响及ATRA对细胞RXRα蛋白表达水平的影响，结果发现视黄酸的浓度为100nm/L以上，并且作用时间为48小时以上，ATRA可抑制人乳腺癌细胞的增殖，可诱导RXRα的表达增加。
文档编号A61K31/203GK102526011SQ201210017680
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者徐久宏, 李新莉 申请人:苏州大学