专利名称：狼毒大戟有效成分提取方法及由该成分制备的二萜类药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种狼毒大戟有效成分提取方法，本发明还涉及一种由该有效成分制备的二萜类药物，该药物主要用于乳腺肿瘤的治疗。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的常见病和多发病，也是危害人类生命健康的重要杀手，目前约有90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移，控制转移是决定恶性肿瘤患者预后的关键因素。临床治疗恶性肿瘤主要是采用手术切除、放射性治疗和化学药物治疗等方法，但这些疗法对肿瘤的转移行为控制效果不佳，大约30%新诊断的实体瘤患者已有临床可见的转移灶，而目前发现的抗肿瘤转移剂如维甲酰胺、紫杉醇、阿拉伯半乳糖和肝素等均由化学合成方法得到，毒性比较大，效果不明显。因此，迫切需要一种疗效显著而毒副作用低的抗肿瘤转移天然药物。中药狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)为大戟科植物狼毒大戟的干燥根，多年生草本；高达40cm，有白色乳液；根肥厚肉质，圆柱形，外皮土褐色，含黄色汁液。分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、等省区。春、秋季采挖，除去残茎，洗净泥土，晒干切片。全株有毒，根毒性大。可外用治头癣，杀鼠。全草含刺激性乳汁，皮肤接触后，能引起水泡，误食引起口腔咽喉的刺激、恶心、呕吐、出血性下痢、腹痛、出冷汗、面色苍白、血压下降、烦躁， 严重时精神失常，眩晕、站立不稳、抽搐、痉挛，有时引起死亡。狼毒大戟得到的有毒成分为 12-异丁酰基-13-乙酰基-20-当归酰基佛波醇酯(12-isobutyryl-13-acetyl-20-angel yphorbol)，毒性不强，小鼠耳壳试验半数有效量为2. 5 μ g/ear，持续时间也较短。此外，尚含O-乙酰基-N- (N'-苯酰-L-苯丙氨酰)-L-苯丙氨醇(O-acetyl-N-W -benzoyl- L -phenylalanyl) -L-phenylalaninoI)及树月旨等成分。研究表明，大戟科植物(特别是狼毒大戟)具有抗癌症作用，参见专利CNl500504 ； 王莉平，王义善，张国营等.狼毒对恶性黑色素瘤细胞生长的影响及其分子作用机制的研究[J]，时珍国医国药，2011，22 (5) : 1133-1135。这些试验选用狼毒大戟药粉或粗提取物进行观察，对其有效部位并未详细阐述。专利CN1500504采用了传统水煎煮提取狼毒大戟有效成份。潘勤等采用了乙醇回流提取狼毒大戟有效成份，参见潘勤，施敏锋，闵知大，狼毒大戟中4种Jolkinolide型二萜的二维核磁共振研究，中国药科大学学报，2004年第35卷第I期第16-19页。这些方法二萜类成份提取率低，难以提高治疗效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种狼毒大戟有效成分的提取方法，本发明的要解决的另外一个技术问题还在于提供一种由该有效成分制备的二萜类药物，该方法及所制得的药物具有高效、安全、成本很低的优点。本发明狼毒大戟有效成分的提取方法的技术方案如下该方法取狼毒大戟的根部，采用超临界二氧化碳萃取方法、以无水乙醇为夹带剂进行提取，得到的提取物再以大孔吸附树脂分离，获得具有医用疗效的二萜类活性物质。本发明狼毒大戟有效成分的提取方法的具体步骤包括
I.超临界二氧化碳萃取
取狼毒大戟的根部，阴干后粉碎至14-24目，置超临界二氧化碳萃取釜中萃取，条件为压力25-35MPa、温度40_60°C、以超临界二氧化碳流量100:5-15v/v的比例加入夹带剂乙醇。然后进入分离釜分离40-50°C、5. 5-8MPa。按以上条件萃取4h，超临界二氧化碳流体萃取体积不低于萃取釜体积的8倍，收集分离萃取液。2.大孔树脂分离
萃取液减压回收乙醇至无馏出液、得到的白色粘稠物。用体积比为75:25的石油醚、乙酸乙酯溶液将该白色粘稠物制成混悬液，以lBV/h的流速流过预处理好的大孔吸附树脂柱至有色层约1/3柱体积。再用该石油醚、乙酸乙酯溶液以3BV/h流速洗脱3倍柱体积，得到包括 jolkinolide B> 17-hydroxyjolkinolide B 和 17-hydroxyjolkinolide A 等 14 个化合物。3.本发明药物原料的提取
顺次使用体积比分别为70:30、45:55、40:60的石油醚乙酸乙酯溶液以3BV/h 流速梯度洗脱约3倍柱体积，在薄层层析检测下依次收集含有化合物jolkinolide B 组分的洗脱液、含有化合物17-hydroxyjolkinolide B组分的洗脱液和含有化合物 17-hydroxyjolkinolide A组分的洗脱液。将得到的三种洗脱液分别减压回收石油醚、 乙酸乙酯，放冷，分别得至Ij jolkinolide B富集物，17-hydroxyjolkinolide B富集物和 17-hydroxyjolkinolide A 富集物。本发明由上述狼毒大戟有效成分制备的二萜类药物
将上述三种富集产物按下述重量比例组合成本发明的二萜类药物
25 35:30 35:30 45。对于这三种化合物有过报道，但其提取方法仅局限于实验室研究用，不适合于工业化。参见王金兰，王玉起，李涛等.新鲜狼毒大戟根化学成分研究[J]，中药材，2010， 33(9):1406-1409。本发明采用的超临界二氧化碳萃取具有萃取效率高、处理容量大、通过萃取参数的设定可获得一定的选择性、二氧化碳可循环使用、不污染环境以及条件温和、有利于保留产物的天然活性等特点。大孔吸附树脂分离具有处理量大、主要以水和乙醇作溶剂、经济简便、易于工业化等特点。通过体外抗肿瘤活性实验发现，ETD516 (1)、ETD516 (2)、 ETD516 (3)对乳腺肿瘤细胞Bcap-37的增殖均具有抑制作用，IC5tl分别为3. 07±0. 25 (ug/ ml)、4.35±0.32(ug/ml)和6. 59 ±0. 54(ug/ml)。其作用是通过抑制蛋白激酶B活性调控PI3K / Akt信号转导通路，进而抑制Bcap-37细胞增殖。体内研究发现，ETD516 (I)、 ETD516 (2)、ETD516 (3)对荷Bcap-37裸鼠移植瘤增殖的抑制率分别为49. 46%,38. 24%和 35. 85%。
具体实施例方式实施例I取狼毒大戟的根部，阴干后，打成14-24目的粉状，投入超临界二氧化碳萃取釜中，萃取条件25 MPa，55°C，超临界二氧化碳流体流量100:10%(v/v)的比例加入夹带剂无水乙醇。分离釜分离8 MPa、40°C。按以上条件萃取4 h，收集分离釜分离出的萃取液。萃取液减压回收乙醇至无馏出液、得到的白色粘稠物。该白色粘稠物用石油醚 乙酸乙酯(75:25)制成混悬液，该液以lBV/h的流速流过预处理好并以水平衡的大孔吸附树脂柱(直径5cm、长100cm)，至有色层约1/3柱体积。首先用石油醚乙酸乙酯(75:25) 以3BV/h流速洗脱3倍柱体积；然后用石油醚乙酸乙酯(70:30)溶液以3Bv/h流速梯度洗脱约3倍柱体积、在薄层层析检测下收集含有化合物jolkinolide B组分的洗脱液；用石油醚乙酸乙酯(45:55)溶液以3BV/h流速梯度洗脱约3倍柱体积、在薄层层析检测下收集含有化合物17-hydroxyjolkinolide B组分的洗脱液。用石油醚乙酸乙酯(40:60)溶液以3BV/h流速梯度洗脱约3倍柱体积、在薄层层析检测下收集含有化合物17-hydroxyjolkinolide A组分的洗脱液。将含有化合物jolkinolide B组分的洗脱液减压回收石油醚、乙酸乙酯至几乎无懼出，放冷，得到形态为白色固体的jolkinolide B富集物。将含有化合物17-hydroxyjolkinolide B组分的洗脱液减压回收石油醚、乙酸乙酯至几乎无馏出，放冷，得到形态为无色针晶的17-hydroxyjolkinolide B富集物。将含有化合物17-hydroxyjolkinolide A组份的洗脱液减压回收石油醚、乙酸乙酯至几乎无馏出，放冷，得到形态为无色针晶的17-hydroxyjolkinolide A富集物。实施例2
取狼毒大戟的根部，阴干，粉碎成14-24目的药粉。取等量药粉分别投入超临界二氧化碳萃取釜中，按表I中列出的超临界二氧化碳萃取条件进行萃取，超临界二氧化碳流体萃取体积为萃取釜体积的8倍。然后进行大孔树脂分离，得到的产物中含有化合物 jolkinolide B组分的洗脱液,将其命名为化合物I,含有化合物17-hydroxyjolkinolide B组分的洗脱液,将其命名为化合物2,含有化合物17-hydroxyjolkinolide A组份的洗脱液，将其命名为化合物3相对于药粉的含量列入表I中。表I
誦压力m乙 IffctW药粉中含量(|Ag>MPaV(ν ν)化合物I化含物2化合》3I3040100.01210.29430.18592355050.0128030210J89232560150.01450.31540.1877
实施例3
本发明药物的制备
将例I中三种富集产物按下述比例组合成二萜类药物ETD516 (I)。
jolkinolide B 富集物17_hydroxy jo Ikino I i de B 富集物 17-hydroxyjolkinolide A 富集物==25:30:45
实施例4
本发明药物的制备
将例I中三种富集产物按下述比例组合成二萜类药物ETD516 (2)。 jolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide A 富集物=30:30:40 实施例5
本发明药物的制备
将例I中三种富集产物按下述比例组合成二萜类药物ETD516 (3)。jolkinolide B 富集物17_hydroxy jolkinol ide B 富集物 17-hydroxyjolkinolide A 富集物富=35:35:30。实施例6
本发明药物的疗效分析通过动物体外抗肿瘤活性实验发现，ETD516 (1)、ETD516 (2)、 ETD516 (3)对乳腺肿瘤细胞Bcap-37的增殖均具有抑制作用，IC5tl分别为3. 07±0. 25 (ug/ ml)、4.35±0. 32 (ug/ml)和6. 59 ±0. 54 (ug/ml)。其作用是通过抑制蛋白激酶B活性调控PI3K / Akt信号转导通路，进而抑制Bcap-37细胞增殖。体内研究发现，ETD516 (I)、 ETD516 (2)、ETD516 (3)对荷Bcap-37裸鼠移植瘤增殖的抑制率分别为49. 46%,38. 24%和 35. 85%。其中，ETD516 (I)在剂量 I. 55mg/kg、0. 78mg/kg 和 0. 39mg/kg 腹腔注射应用 14 天，肿瘤抑制率分别为78. 70%,64. 72%和59. 35%。
权利要求
1.一种狼毒大戟有效成分提取方法，其特征是该方法取狼毒大戟的根部，采用超临界二氧化碳萃取方法、以无水乙醇为夹带剂进行提取，得到的提取物再以大孔吸附树脂分离，获得具有医用疗效的二萜类活性物质。
2.根据权利要求I所述狼毒大戟有效成分提取方法，其特征是该方法的具体步骤包括A.超临界二氧化碳萃取取狼毒大戟的根部，阴干后粉碎至14-24目，置超临界二氧化碳萃取釜中萃取，条件为压力25-35MPa、温度40_60°C、以超临界二氧化碳流量100:5-15v/v的比例加入夹带剂乙醇；然后进入分离釜分离40-50°C、5. 5-8MPa ;按以上条件萃取4h，超临界二氧化碳流体萃取体积不低于萃取釜体积的8倍，收集分离萃取液；B.大孔树脂分离萃取液减压回收乙醇至无馏出液、得到的白色粘稠物；用体积比为75:25的石油醚、乙酸乙酯溶液将该白色粘稠物制成混悬液，以lBV/h的流速流过预处理好的大孔吸附树脂柱至有色层约1/3柱体积；再用该石油醚、乙酸乙酯溶液以3BV/h流速洗脱3倍柱体积，得到包括 jolkinolide B> 17-hydroxyjolkinolide B 和 17_hydroxyjolkinolide A 等 14 个化合物。
3.根据权利要求2所述狼毒大戟有效成分提取方法，其特征是该方法的具体步骤包括根据权利要求I所述狼毒大戟有效成分的提取方法，其特征是该方法还包括C.部分.药物原料的提取顺次使用体积比分别为70:30、45:55、40:60的石油醚乙酸乙酯溶液以3BV/h 流速梯度洗脱约3倍柱体积，在薄层层析检测下依次收集含有化合物jolkinolide B 组分的洗脱液、含有化合物17-hydroxyjolkinolide B组分的洗脱液和含有化合物 17-hydroxyjolkinolide A组分的洗脱液；将得到的三种洗脱液分别减压回收石油醚、 乙酸乙酯，放冷，分别得至Ij jolkinolide B富集物，17-hydroxyjolkinolide B富集物和 17-hydroxyjolkinolide A 富集物。
4.一种利用权利要求3所述狼毒大戟有效成分提取方法中获取的有效成分制备的二萜类药物，其中各种原料组分的重量配比是jolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide A富集物=25 35:30 35:30 45。
全文摘要
本发明公开了一种狼毒大戟有效成分提取方法及利用该成分制备的二萜类药物，该方法取狼毒大戟的根部，采用超临界二氧化碳萃取方法、以无水乙醇为夹带剂进行提取，得到的提取物再以大孔吸附树脂分离，获得具有医用疗效的二萜类活性物质。本发明采用的超临界二氧化碳萃取具有萃取效率高、处理容量大、通过萃取参数的设定可获得一定的选择性、二氧化碳可循环使用、不污染环境以及条件温和、有利于保留产物的天然活性等特点。大孔吸附树脂分离具有处理量大、主要以水和乙醇作溶剂、经济简便、易于工业化等特点。
文档编号A61P35/00GK102603765SQ20121002278
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月2日 优先权日2012年2月2日
发明者刘吉成, 崔红霞, 李晓明, 牛英才, 王晓丽 申请人:齐齐哈尔医学院