专利名称：药用真菌瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，属于天然产物有效成分的提取领域。
背景技术：
瓦尼木层孔菌(Phellinus vaninii Ljub),又名杨黄,属于担子菌纲非裙菌目锈革孔菌科木层孔菌属真菌。瓦尼木层孔菌在我国主要分布于吉林的长白山和黑龙江的小兴安岭地区，多生长在杨树活立木或倒木上，是杨树特有的一种寄生菌。
瓦尼木层孔菌在有些地区也被当作桑黄(鲍式层孔菌(Phellinus baumii)、裂蹄层孔菌(Phellinus Iinteus)、火木层孔菌(Phellinus igniarius))入药。由于过度开发采集，野生桑黄资源迅速枯竭，急需寻找新来源或替代品，瓦尼木层孔菌与桑黄有相近或相似的药理活性与功效，被认为是未来能够代替桑黄药用的品种来源。
早在1968年，日本科学家发现，野生桑黄子实体的提取物对小鼠肉瘤S180肿瘤细胞有直接抑制作用，其抑制率为96.7%，并发现桑黄中发挥抗癌作用的物质为多糖。近几十年来，日本、韩国等对桑黄的药用价值进行研究后发现桑黄抗癌效果比灵芝、加里斯茸、 PL-2、PL-5还好，是目前国际公认的生物抗癌领域中药效最好的药用真菌之一。大量的研究结果表明桑黄多糖能有效抑制癌细胞的生长并防止其扩散转移，这主要是通过细胞调节和体液免疫而起作用的。另外，国内外研究表明，桑黄还具有肝纤维化抑制、抗氧化、抗血管生成、降血糖、抗菌消炎等药理作用。
目前，关于瓦尼木层孔菌的研究报道比较少，中国知网上仅有20余篇相关文献， 文献显示其化学成分主要是多糖类、黄酮类、多酚类和留醇类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化等作用。为了开发瓦尼木层孔菌，需要对其进行进一步的研究。为提高药效、富集纯化有效部位，需要一种能够对瓦尼木层孔菌的多糖部位进行进富集的制备工艺。发明内容
根据现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是:提供一种瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，提取分离纯化并最终得到较高纯度的瓦尼木层孔菌多糖，有效地富集瓦尼木层孔菌的多糖有效成分，降低提取物中的杂质含量。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种药用真菌瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过筛；
(2)用乙醇水溶液浸提脱脂2 3次，弃去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；
(3)将干燥后的原料用热水提取三次，滤液用纱布过滤，合并滤液后减压浓缩，放置冷却至室温；
(4)向冷却后的浓缩液中加乙醇，搅拌均匀，冷藏醇沉；
(5)将醇沉物离心，用乙醇洗涤沉淀，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。
所述步骤⑴中，粉碎后的原料过5 30目筛。
所述步骤⑵中，脱脂所用乙醇浓度为70 100%，瓦尼木层孔菌原料与乙醇的比例为1:1 50，浸提时间为I 24小时。
所述步骤(3)中，瓦尼木层孔菌原料与水的比例为1:1 50，提取温度为70 100°c，提取时间为I 5小时，浓缩后的体积与提取液体积比为1: 5 20。
所述步骤(4)中，乙醇的浓度为70 90%，冷藏温度为O 5°C，醇沉时间为I 72小时。
所述步骤(5)中，离心时间为5 30分钟，离心机转速为1000 10000r/min，洗涤次数为I 3次。
本发明所用的瓦尼木层孔菌(Phellinus vaninii Ljub)采集自辽宁省丹东市,标本保存于山东大学药学院天然药物化学标本室，编号为PV20100901。
优选的一种瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过5 30目筛；用70 100%浓度的乙醇水溶液浸提脱脂 2 3次，浸提时间为I 24小时，料液比为1:1 50，弃去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；将干燥后的原料用热水提取三次，料液比为1:1 50，提取温度为70 100°C， 提取时间为I 5小时，滤液用细纱布过滤，合并滤液后减压浓缩至适当体积，浓缩后的体积与提取液体积比为1: 5 20，放置冷却至室温；向冷却后的浓缩液中加乙醇至浓度为 70 90%，搅拌均匀，冷藏醇沉，冷藏温度为O 5°C，醇沉时间为I 72小时；将醇沉物离心5 30分钟，离心机转速为1000 10000r/min，用乙醇洗涤沉淀I 3次，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。
更优选的一种瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过5 30目筛；用70 95%浓度的乙醇水溶液浸提脱脂 2 3次，浸提时间为I 24小时，料液比为1: 10 30，弃去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；将干燥后的原料用热水提取三次，料液比为1: 10 50，提取温度为100°C，提取时间为I 5小时，滤液用细纱布过滤，合并滤液后减压浓缩至适当体积，浓缩后的体积与提取液体积比为1: 5 20，放置冷却至室温；向冷却后的浓缩液中加乙醇至浓度为80%， 搅拌均匀，冷藏醇沉，冷藏温度为O 5°C，醇沉时间为I 72小时；将醇沉物离心10分钟， 离心机转速为4000r/min，用乙醇洗涤沉淀3次，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。
所需设备包括:高速中药粉碎机(粉碎细度5 40目)、旋转蒸发仪、高速离心机、 真空干燥箱、紫外可见分光光度计。
真菌多糖的含量测定方法在本领域是公知的，如硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、3，5- 二硝基水杨酸法等，本发明瓦尼木层孔菌多糖含量测定所使用的方法为硫酸苯酚法。
本发明是先用较高浓度的乙醇将瓦尼木层孔菌原料浸提脱脂，再用热水提取多糖成分，然后醇沉离心得到粗多糖。
本发明的有益效果是:有效地富集瓦尼木层孔菌的多糖有效成分，降低提取物中的杂质含量，根据该方法制备得到的瓦尼木层孔菌粗多糖含量高·达60.5% ;工艺简单、成本低，在较小能耗、较少有机溶剂使用的情况下对瓦尼木层孔菌多糖进行提取分离并纯化，特别适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述:
实施例1
取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过10目筛；取过筛后的原料50克，用浓度为90%的乙醇水溶液浸提脱脂3次，浸提时间为24小时，料液比为1: 5，弃去浸提液，剩余原料自然晾干；将干燥后的原料用热水提取三次，料液比为 I: 10，提取温度为100°C，提取时间为3小时，滤液用细纱布过滤，合并滤液后减压浓缩至体积与提取液体积比为1: 10，放置冷却至室温；向冷却后的浓缩液中加乙醇至浓度为 90%，搅拌均匀，冷藏醇沉4小时，冷藏温度为O 5°C ;将醇沉物离心20分钟，离心机转速为4000r/min，用乙醇洗涤沉降物3次，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。粗多糖共 1.5克，产率为生药材的3.0%，多糖含量用硫酸苯酚法测定为60.5%。
实施例2
取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过30目筛；取过筛后的原料50克，用浓度为70%的乙醇水溶液浸提脱脂2次，浸提时间为2小时，料液比为1: 45，弃去浸提液，剩余原料自然晾干；将干燥后的原料用热水提取三次，料液比为I: 40，提取温度为80°C，提取时间为1.5小时，滤液用细纱布过滤，合并滤液后减压浓缩至体积与提取液体积比为1: 20，放置冷却至室温；向冷却后的浓缩液中加乙醇至浓度为 80%，搅拌均匀，冷藏醇沉72小时，冷藏温度为O 5°C ;将醇沉物离心10分钟，离心机转速为8000r/min，用乙醇洗涤沉降物3次，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。粗多糖共1.4克，产率为生药材的2.8%，多糖含·量用硫酸苯酚法测定为59.7%。
权利要求
1.一种药用真菌瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤:(1)取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过筛；(2)用乙醇水溶液浸提脱脂2 3次，弃去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；(3)将干燥后的原料用热水提取三次，滤液用纱布过滤，合并滤液后减压浓缩，放置冷却至室温；(4)向冷却后的浓缩液中加乙醇，搅拌均匀，冷藏醇沉；(5)将醇沉物离心，用乙醇洗涤沉淀，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。
2.根据权利要求1中所述的瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(I)中，粉碎后的原料过5 30目筛。
3.根据权利要求1中所述的瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤⑵中，脱脂所用乙醇浓度为70 100%，瓦尼木层孔菌原料与乙醇的比例为1:1 50，浸提时间为I 24小时。
4.根据权利要求1中所述的瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤⑶中，瓦尼木层孔菌原料与水的比例为1:1 50，提取温度为70 100°C，提取时间为I 5小时，浓缩后的体积与提取液体积比为1: 5 20。
5.根据权利要求1中所述的瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤⑷中，乙醇的浓度为70 90%，冷藏温度为O 5°C，醇沉时间为I 72小时。
6.根据权利要求1中所述的瓦尼木层孔菌多糖的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，离心时间为5 3 0分钟，离心机转速为1000 10000r/min，洗涤次数为I 3次。
全文摘要
本发明属于天然产物有效成分的提取领域，其特征在于包括以下步骤取瓦尼木层孔菌原料，挑选剪除附着的木屑，将原料烘干，粉碎，过筛；用乙醇水溶液浸提脱脂，弃去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；将干燥后的原料用热水提取三次，滤液用纱布过滤，合并滤液后减压浓缩，放置冷却至室温；向冷却后的浓缩液中加乙醇，搅拌均匀，冷藏醇沉；将醇沉物离心，用乙醇洗涤沉淀，沉降物烘干后即得瓦尼木层孔菌粗多糖。降低提取物中的杂质含量，根据该方法制备得到的瓦尼木层孔菌粗多糖含量高达60.5％；工艺简单、成本低，在较小能耗、较少有机溶剂使用的情况下对瓦尼木层孔菌多糖进行提取分离并纯化，特别适合工业化生产。
文档编号A61P31/04GK103254321SQ20121003792
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者何茂群, 娄红祥, 李伟, 曹桂东, 仝加, 朱叙伟, 刘德杰, 杨文宁, 李雪改, 吴焕军 申请人:瑞阳制药有限公司, 山东大学