专利名称：中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新天然抗菌肽，具体是指一种中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术：
抗菌肽是一类小分子多肽，一般由小于100个氨基酸残基组成，大多数带有一定量的正电荷。抗菌肽具有抑制细菌、真菌、原生生物(Nicolas et al.，1995)及抗病毒 (Mohan et al. , 2010)、抗肿瘤(Papo et al.，2005)等活性，是一类广谱抗菌多肽，并对真核细胞无毒。目前抗菌肽成为近年来研究的新热点，研究的内容包括抗菌肽的分离与纯化，氨基酸序列的分析，抗菌肽在各个组织中的表达水平，蛋白质构型与功能的关系，抗菌肽的作用机理(Cammue et al. , 1994 ；Cuesta et al.，2008)，动植物转抗菌肽基因工程(李文楚等，1996)，改造合成抗菌肽基因并应用基因工程表达抗菌肽基因。抗菌肽由于具有独特的杀菌机制，稳定的理化性质，广谱抗菌活性，不容易产生耐药性等特点，被认为是抗菌药物的潜在替代品，存在于动物体上的抗菌肽是免疫系统的重要组成部分，具有重要的生物学作用，主要表现在具有广谱抗菌活性、抗病毒作用、抗原虫作用、抗肿瘤活性、免疫佐剂等几个方面。抗菌肽具有广谱抗菌活性。大量的研究报道了抗菌肽的抗菌功能，几乎所有的抗菌肽对一些革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用。抗菌肽的氨基酸带有正电荷，而细菌细胞膜脂质富含磷脂首基而带有负电荷，因此抗菌肽可以选择性的吸附在细菌细胞膜表面， 降解细胞膜，已经证明抗菌肽epinecidin-Ι及其类似的合成物，可以破坏革兰氏阴性菌外膜(Pan et al.，2009)。研究表明，合成的印inecidin-l，THl_5和TH2-3多肽可以降解鸭疫里默氏杆菌的外膜(Pan et al. ,2010) 0日本比目鱼hepcidin的研究结果表明26个氨基酸的JF2短肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和格氏乳球菌具有抗菌活性，但对迟缓爱德华氏菌没有抗菌活性；另一个19个氨基酸的JFl短肽没有表现出抗菌活性(Hirono et al.，2005)。表达罗非鱼肝脏抗菌多肽 (TH) 2-3的转基因斑马鱼，可以抵抗革兰氏阴性菌海洋弧菌的感染(Hsieh et al.，2010)。 在罗非鱼，大西洋鲑和其他一些种类的鱼上发现了编码h印cidin多拷贝的区域(Douglas et al. ,2003 ；Huang et al. ,2007) 除此之外，细菌内毒素和脂多糖(LPS)能够诱导THs， TH2-3基因的表达，但是却不能诱导TH1-5，TH2-2基因的表达(Huang et al.，2007)，可能是hepcidin的多拷贝在鱼类进化过程中演变为不同的功能,而hepcidin在哺乳动物中主要参与铁离子调控和宿主防御。与哺乳动物不同的是，JFl的功能可能是铁离子调控，JF2 的功能可能是抗菌，当然还需要进一步的研究证实这个假说。目前，蛋白质数据库内没有发现有关与中华鲟天然抗菌肽相似的蛋白质多肽。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种中华鲟抗菌肽和编码该氨基酸的基因序列，以及从中华鲟血液总RNA中克隆获得该抗菌肽基因pen-hepcidin及其重组表达蛋白的方法和该蛋白多肽在制备治疗感染性疾病药物和抗菌饲料添加剂中的应用。本发明通过以下技术方案实现本发明提供的一种中华鲟抗菌肽，其特殊之处在于其核苷酸序列如序列表SEQ NO 1所示；插入载体的核苷酸序列如序列表SEQ NO 2所不；其氣基酸序列如序列表SEQNO :3所不；其扩增pen-hepcidin基因的引物，它的DNA序列如下所示正向引物5'ACAYCAGAACffAACAYTC3;，反向引物5'CYACTITTAYAAGGCWTA3'。作为优选方案，其DNA序列及其编码的氨基酸序列如下DNA 序列GM TTC AGC AGA ACG AAC ACT CGA CAG MA CMCAG AAA CAC AGG GAC AM CAA ATC CCC TGG CAT TTT TCA GGACM AAC GTC AAA GCC ATC TTT CCC TGT GCA GAT ACT GCT GCAACT GCT GTC GTA ACA AAG GCT GTG GAT ATT GCT GTA AAT TAA编码的相应氨基酸序列SRTNTRQKQQKHRDKQIPWHFSGQNVKAIFPCADTAATAVVTKAVDIAVN本发明还提供一种制备中华鲟抗菌肽核苷酸的方法，其特殊之处在于它包括以下步骤(I)设计PCR引物，所述的引物对的DNA序列如下正向引物5'ACAYCAGAACffAACAYTC3;，反向引物5'CYACTTTTAYAAGGCWTA3'；(2)提取中华鲟血液总RNA，反转录后进行PCR扩增，PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本发明还提供一种中华鲟抗菌肽的应用，其特殊之处在于所述的中华鲟抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或耐药菌株感染性疾病的药物中或者作为饲料添加剂的应用。本发明使用的微生物巴斯德毕赤氏酵母GS115/pPICZ a A-pen-hepcidin Pichiapastoris GS115/ pPICZaA-pen-h印cidin，已于2012年I月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为NO. M2012007。本发明用RT-PCR方法，从中华鲟血液总RNA中克隆获得该抗菌肽基因 pen-hepcidin及其重组表达蛋白。根据序列的保守性，设计一对兼并引物(Fl，Rl);表达引物(F2，R2)加入EcoR I 和Not I酶切位点，并在下游引物中加入终止密码子。引物设计如下Fl :5，-ACAYCAGAACWAACAYTC-3’Rl :5，-CYACTTTTAYAAGGCWTA-3’F2 :5，-CGGAATTCAYCAGAACffAACAYTCG-3 EcoR IR2 :5’ -TAGCGGCCGCTTAATTTACAGCAATATCCAC-3’Not I用表达引物(F2，R2)对重组质粒进行PCR扩增，目的片段与表达载体pPICZ a A都经过限制性内切酶EcoR I和Not I分步双酶切，T4连接酶16°C连接过夜，转化大肠杆菌 T0P10,构建真核重组表达质粒pPICZ a A-抗菌肽，并送华大基因公司测序鉴定。重组表达质粒pPICZ α A-抗菌肽通过BstX I单酶切线性化、电泳，纯化回收酶切产物。电转化感受态的毕赤酵母工程菌GS115，转化后涂布含ZeocinTM培养基，筛选具有高抗性的转化子。先用BMGY培养液(含甘油)激活培养约24h，OD600值达2_6时，收集菌液，换BMMY培养液，在28°C，250rpm条件下开始甲醇诱导表达。每隔24h，向锥形瓶中加入终浓度为O. 8%的甲醇，并补充适量的无菌水，同时诱导pPICZ a A空载体酵母菌。72h后收集上述甲醇诱导表达后的上清液，用饱和度为85%的硫酸铵浓缩酵母诱导菌表达上清，对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性、抑菌效价和热稳定性测定，初步判断中华鲟抗菌肽的生物活性。本发明的抗菌肽对部分革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性，且对耐药菌株也有明显的作用，可用于制备治疗感染性疾病的药物或作为饲料添加剂等应用。
图I :是本发明中华鲟抗菌肽pen-kpcidin基因RT-PCR扩增产物。图2 :是本发明中重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定图3 :是本发明中重组抗菌肽对大肠杆菌抑菌活性测定图4 :是本发明中重组抗菌肽对无乳链球菌抑菌活性测定图5 :是本发明中重组抗菌肽对温和气单胞菌抑菌活性测定图6 :是本发明中重组抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌活性测定图7 :是本发明中核苷酸序列的序列表SEQ NO 1图8 :是本发明中插入载体的核苷酸序列的序列表SEQ NO 2图9 :是本发明中氨基酸序列的序列表SEQ NO 3图中图I中M :DL2000DNA标准；1、2 :中华鲟抗菌肽pen-hepcidin扩增产物。图2中重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定1 :氨苄青霉素10yg;2 pPICZ αΑ酵母转化子诱导产物；3 :pPICZ a A-pen-hepcidin转化子诱导产物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 转化子诱导产物 II。图3中重组抗囷妝对大肠杆囷抑囷活性测定I :氣节青霉素10 μ g ;2 pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin转化子诱导产物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 转化子诱导产物 II。图4中重组抗菌肽对无乳链球菌抑菌活性测定1 :氨苄青霉素10yg;2 pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin转化子诱导产物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 转化子诱导产物 II。图5中重组抗菌肽对温和气单胞菌抑菌活性测定1 :氨苄青霉素10μ g ;2 pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin转化子诱导产物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 转化子诱导产物 II。图6中重组抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌活性测定1 :氨苄青霉素10μ g ;2 pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3 pPICZ a A-pen-hepcidin转化子诱导产物I ;4 pPICZ a A-pen-hepcidin 转化子诱导产物 II。
具体实施例方式实施例I :中华鲟抗菌肽基因的克隆(I)引物设计根据NCBI/GenBank上已登录鱼类hepcidin序列信息，根据序列的保守性， 用Primer 5. O软件在cDNA序列ORF的上下游区域，设计一对兼并引物(Fl，Rl) ；F1 5， -ACAYCAGAACWAACAYTC-3， Rl : 5，-CYACTTTTAYAAGGCWTA-3，。(2) Trizol法提取血液总RNA从中华鲟尾动脉用无菌一次性注射器吸取血液，常温静置一段时间后，常温下 IOOOrpm离心30min,弃上清液,沉淀即为血细胞。实验用的玻璃器皿经O. I %的DEPC水处理，150°C烘烤4h。塑料器皿经O. I % DEPC 水浸泡过夜，121°C、20min高温高压灭菌。金属用具经lmol/L的NaOH浸泡2h，经O. 01 %的 DEPC水彻底冲洗后，37 °C烘干。各试剂用无RNase的O. 01 % DEPC水配置。总RNA抽提按 Trizol说明书进行。(3) cDNA第一条链的合成及PCR扩增I)反转录合成第一链，以提取的中华鲟血液总RNA为模板进行反转录，反应体系为40 μ L,即
权利要求
1.一种中华鲟抗菌肽，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQNO 1所示；插入载体的核苷酸序列如序列表SEQ NO 2所示；其氨基酸序列如序列表SEQ NO 3所示；其扩增 pen-epcidin基因的引物,它的DNA序列如下所示正向引物5' ACAYCAGAACffAACAYTC ，反向引物5' CYACTTTTAYAAGGCffTA 。
2.根据权利要求I所述的中华鲟抗菌肽，其特征在于其DNA序列及其编码的氨基酸序列如下DNA 序列GM TTC AGC AGA ACG AAC ACT CGA CAG MA CMCAG MA CAC AGG GAC AAA CAA ATC CCC TGG CAT TTT TCA GGACAA AAC GTC AAA GCC ATC TTT CCC TGT GCA GAT ACT GCT GCAACT GCT GTC GTA ACA AAG GCT GTG GAT ATT GCT GTA AAT TAA编码的相应氨基酸序列SRTNTRQKQQKHRDKQIPWHFSGQNVKAIFPCADTAATAVVTKAVDIAVNo
3.—种如权利要求I或2所述的制备中华鲟抗菌肽核苷酸的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)设计PCR引物，所述的引物对的DNA序列如下正向引物5' ACAYCAGAACffAACAYTC 3'，反向引物5' CYACTTTTAYAAGGCffTA 3'；(2)提取中华鲟血液总RNA，反转录后进行PCR扩增，PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO 1所不的核苷酸序列。
4.一种如权利要求I或2所述的中华鲟抗菌肽的应用，其特征在于所述的中华鲟抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或耐药菌株感染性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用，具体是指一种新的中华鲟天然抗菌肽pen-hepcidin和编码该基因的氨基酸序列，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物和饲料添加剂中的应用。本发明用RT-PCR方法，从中华鲟血液总RNA中克隆获得该抗菌肽基因pen-hepcidin，其DNA序列如序列表中SEQ ID1序列所示。该基因编码的蛋白(pen-hepcidin)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID3序列所示。经氨基酸序列分析，在目前的蛋白质数据库内没有发现有与该抗菌肽相似的蛋白质多肽，属于一种新型的抗菌肽。本发明的抗菌肽对部分革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性，且对耐药菌株也有明显的作用，可用于制备治疗感染性疾病的药物或作为抗菌饲料添加剂等应用。
文档编号A61K38/17GK102584974SQ201210040919
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者袁改玲, 陈思思, 高宇 申请人:华中农业大学