专利名称：一种ctla4融合蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫抑制领域，具体涉及ー种融合蛋白及其制备方法和用途。
背景技术：
CTLA4,即细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4(Cytotoxic T Lymhocyte-AssociatedAntigen 4)和 CD28 (Cluster of Differentiation 28),均是由 T 淋巴细胞表达的免疫球蛋白，它们在氨基酸序列和蛋白质结构上均类似，且在基因水平上具有高度同源性。B7分子是介导T细胞激活过程的共刺激信号通路的重要分子，CTLA4和⑶28它们均是B7分子的天然受体。CD28可与B7分子作用，传递、增强和放大免疫反应，促进T细胞的活化。CTLA4与B7的结合力是CD28与B7结合力的10倍，其容易与B7分子结合从而阻止⑶28分子与B7分子结合，进而抑制T细胞活化。活化T细胞介导的移植物排斥是器官移植中器官功能丧失的最主要的原因，T细胞的异常活化也是各种自身免疫疾病，如类风湿性关节炎，多发性硬化等疾病的病因。针对活化T细胞的免疫抑制剂是控制移植排斥和自身免疫性疾病的重要手段。CTLA4具有抑制T细胞活化的活性，可将其制备成免疫抑制剂，然而，CTLA4分子由三个功能区域组成，包括胞外区、跨膜区和胞内区，导致其在细胞内的分布非常特别，绝大多数分子表达在胞内，并且呈极性的分布于高尔基体的成熟面，要获得大量的CTLA4，需要将其结构进行改进，使其由胞内表达变为胞外分泌。构建仅含有CTLA4胞外功能区域的CTLA4融合蛋白是改变其表达方式和去除其分布的限制性的主要方法，而与抗体恒定区结构域连接形成融合蛋白CTLA4Ig,不仅可以去掉CTLA4分布的限制性,还可以延长期半衰期，因此，构建CTLA4Ig是制备大量CTLA4的主要方式。目前，已经有关于人、猪、狗的CTLA4Ig融合蛋白的报道，然而，没有关于猴的CTLA4Ig融合蛋白的报道。由干与人类之间亲密的进化关系，恒河猴被广泛的用作自身免疫性疾病和器官移植的动物模型。但由于免疫反应通常具有高度的种属特异性，在利用恒河猴所开展的测试中更应该使用猴特异的免疫抑制剂。因此，构建猴特异性的CTLA4Ig融合蛋白是ー个急需解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的猴特异性的融合蛋白mmCTLA4Ig。本发明提供了ー种基因，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子。本发明还提供了ー种重组载体，它包含前述基因。其中，所述的重组载体是重组pPIC 9K 质粒。本发明还提供了ー种重组菌，它包含前述重组载体。其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。本发明还提供了前述基因编码的蛋白质。其中，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO 2 所示。
本发明还提供了制备前述蛋白质的方法，包含如下步骤i、取前述的重组菌，接种到BMGY培养基上，培养基的pH为6. 0，28°C，280rpm培养至其对数生长期，其OD6tltl = 2 6 ;ii、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度28°C，转速250rpm，进行诱导表达，诱导剂为甲醇，诱导起始重组菌密度为40 80AU/ml，培养pH 6. O 8. O ;诱导剂浓度0· 5% 5. 0% (v/v);诱导时间24 96h ；i ii、收集培养物上清，分离纯化，即得到目的蛋白。其中，所述步骤ii诱导表达的参数为诱导起始的重组菌密度60 80AU/ml ;培养pH 6. O ;诱导剂浓度3% ;诱导时间72h 96h。本发明还提供了前述蛋白质在制备CD28分子拮抗剂中的用途。其中，所述用途为蛋白质在制备拮抗CD28分子与B7分子相互作用的拮抗剂中的用途。本发明还提供了前述蛋白质在制备免疫抑制剂中的用途。所述免疫抑制剂为猴特异性的免疫抑制剂。本发明还提供了一种CD28分子拮抗剂，其有效成分为前述蛋白质。其中，所述的拮抗剂为拮抗CD28分子与B7分子相互作用的拮抗剂。 本发明最后提供了一种免疫抑制剂，其有效成分为前述蛋白质。本发明提供的融合蛋白mmCTLA4Ig可阻止⑶28分子与B7分子结合，进而抑制T细胞活化，具有明显的免疫抑制作用，可以用于制备免疫抑制剂，且具有猴特异性，解决了目前利用恒河猴所开展的测试只能使用其他种属来源的免疫抑制剂的问题。
图lmmCTLA4胞外段基因序列电泳鉴定2mmCTLA4胞外段基因序列测序3人抗体IgGl恒定区基因序列电泳鉴定4pPIC 9K-mmCTLA4Ig 的质粒结构图5编码本发明融合蛋白mmCTLA4Ig的基因序列图6重组菌阳性克隆检测结果图7 以 anti-hlgGlFc 作为抗体对 6 个阳性克隆(GS115-pPIC9K_mmCTLA4Ig)的发酵产物进行western blotting的电泳结果图8本发明融合蛋白mmCTLA4Ig的氨基酸序列图9毕赤酵母表达体系中诱导起始细胞密度对重组蛋白mmCTLA4Ig的表达量影响的SDS-PAGE分析图，10，20，40，60和80分别表示细胞密度为10，20，40，60和80AU/ml图10毕赤酵母表达体系中诱导时间对重组蛋mmCTLA4Ig的表达量影响的SDS-PAGE分析11毕赤酵母表达体系中诱导物甲醇浓度对重组蛋mmCTLA4Ig的表达量影响的SDS-PAGE分析12毕赤酵母表达体系中诱导培养基pH对重组蛋白mmCTLA4Ig的表达量影响的SDS-PAGE分析13纯化后重组蛋白mmCTLA4Ig天然存在聚合状态的分析结果图
图14纯化后重组蛋白mmCTLA4Ig的糖基化鉴定结果15纯化后重组蛋白mmCTLA4Ig对K562 (B7_)/Raji (B7+)细胞结合能力的比较图16纯化后重组蛋白mmCTLA4Ig对ConA刺激的淋巴细胞增殖的抑制率与mmCTLA4Ig浓度的关系 图17纯化后重组蛋白mmCTLA4Ig对同种异体细胞刺激的淋巴细胞增殖抑制率与mmCTLA4Ig浓度的关系
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例I融合蛋白mmCTLA4Ig的制备一、重组菌的构建I、外周血单个核淋巴细胞的制备外周血单个核淋巴细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cells, PBMCs)是通过Ficoll-Hypaque密度梯度法离心获得取5_15ml用肝素抗凝的健康猴血，用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS，137mMNaCl, 2. 68mM KC1,8. ImM Na2HPO4,1. 47KH2P04, pH 7. 2)稀释，然后小心的铺到等体积的Ficoll (I. 077)溶液上面。室温下400g离心30min，离心后的溶液出现了明显的四个分层，从上而下第二层乳白色的细胞就即为PBMCs。将收集到的PBMCs用PBS洗涤两遍，并用含有100U/ml青霉素，100mg/l四环素和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞至IXlO6密度培养。2、恒河猴总RNA的获得将恒河猴PBMCs细胞培养在37°C，5 % CO2的湿润环境里，并用5 ii g/ml的Con A连续刺激48-72h。4°C下8，OOOg离心2min，弃上清，收集约3 X IO6个细胞；在上述细胞中加入0.6ml RNAiso Plus，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置5min后12，OOOg, 4°C，离心5min,收集上清；往得到的上清中加入l/5RNAiso Plus体积量的氯仿，剧烈振荡15秒至溶液充分乳化，室温静置5min后12，000g，4°C离心15min，收集上清；向得到的上清液中加入等体积的异丙醇上下颠倒，室温静置IOmin后12，000g,4°C离心lOmin，弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的冰冻こ醇Iml洗涤沉淀，4°C下12，OOOg再次离心5min后小心弃去こ醇，得到的沉淀即为恒河猴总RNA。 室温干燥沉淀2 5min,直至沉淀由白色变成透明状态，加入20 y I的RNase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打至RNA沉淀完全溶解后于_80°C保存。结果显示，每IXlO7个淋巴细胞可以获得20ii g的总RNA。3、恒河猴总cDNA的获得按照Takara试剂盒(PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit,Takara,Japan)说明书操作，用PrimeScript II RTase和引物Oligo d(T)primer将步骤2得到的恒河猴总RNA反转得到恒河猴总cDNA混合物。
4、恒河猴CTLA4胞外区基因的克隆根据恒河猴的CTLA4基因胞外段125个氨基酸的基因序列，并引入6个组氨酸(His)的基因序列和EcoR I/Avr II限制性内切酶酶切位点基因序列，设计引物如下Pl :5，-TTACGAATTCCATCACCATCACCATCACGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGT(包含EcoRI酶切位点) P25，-CTTGTACCTAGGGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGGATCA-3，(包含 Avr 11 酶切位点)以Pl和P2所示的核苷酸序列为引物，以步骤3得到的恒河猴总cDNA混合物为模板，以高保真酶invitrogen Platinum Pfx为聚合酶进行扩增。PCR 扩增条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 lmin，68°C延伸 lmin，共30个循环。经检测，PCR扩增获得了含有EcoRI/Avrll酶切位点、6His标签的长度为405bp的恒河猴CTLA4(mmCTLA4)胞外段序列，PCR扩增结果如图I所示。PCR产物经小量胶回收试剂盒(大连宝生物公司)纯化后，以EcoRI/AvrII(Takara)双酶切，然后克隆于质粒pPIC 9K上。用EcoRI/Avrll (Takara)双酶切鉴定，鉴定的阳性克隆再测序验证，测序正确的质粒命名为pPIC 9K-mmCTLA4，测序结果如图2所示，其中，第63bp 437bp为(mmCTLA4)胞外段序列。5、人抗体IgGl恒定区基因的克隆根据人抗体IgGl恒定区的基因，即hlgGlFc的铰链区和CH2/CH3的基因片段，并引入Avr I I/Not I限制性内切酶酶切位点基因序列，设计如下引物P3 :5’ -CGTACCTAGGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC-3’ (包含 AvrII 酶切位点)P4 :5’ -CAGTGCGGCCGCCTAITTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’ (包含 Not I 酶切位点)以P3和P4所示的核苷酸序列为引物，以商业化IgGl-Fc质粒为模板，以高保真酶invitrogen Platinum pfx为聚合酶进行扩增。PCR扩增条件如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火lmin，68°C延伸lmin,共30个循环。经检测，PCR扩增获得了含有Avr I I/Not I双酶切位点的815bp长度的人抗体IgGl恒定区基因，PCR扩增结果如图3所示。6、融合蛋白表达质粒的构建以Avr I I/Not I双酶切人抗体IgGl恒定区基因，回收约800bp的DNA片段，然后连接到同样经Avr I I/Not I双酶切的pPIC抓-^^了^^中’转化大肠杆菌感受态^口^^用EcoR I/Not I双酶切鉴定，将含有pPIC9K-mmCTLA4Ig质粒的阳性克隆命名为ToplO-pPIC9K-mmCTLA4Ig,该质粒的结构如图4所示。用EcoR I/Not I 双酶切 pPIC 9K_mmCTLA4Ig，回收 1214bp 的 DNA 片段，该片段的测序结果如图5所示，该基因片段对应的DNA序列如下EcoRI(l 6bp)_6his(7 24bp) -mmCTLA4 胞外段(25 399bp)_Avr II (400 405bp)-IgGFc (406 1206bp)_Not1(1207 1214bp)。7、重组菌的构建和融合蛋白mmCTLA4Ig的制备(I)阳性重组菌的制备
用限制性内切酶Sal I (Takara)单酶切步骤6构建得到的pPIC9K-mmCTLA4Ig质粒，使其线性化；后将线性化的pPIC 9K_mmCTLA4Ig用Gene Pulser system (Bio-Rad)电穿孔(conditions 1. 5k V，200 Q，and 25 y F)，使其进入感受态毕赤酵母GSl 15菌株；电转混合物在组氨酸缺陷的最小量葡萄糖培养基(MD, histidine-deficient minimal dextroseplates，0. 4u g/ml biotin，20mg/ml D—glucose，り/mg/ml yeast nitrogen base，15mg/m丄agar)上培养，筛选His+的克隆。 从上述MD板上挑取7个生长状态良好的单克隆培养在YPD(10mg/ml yeastextrat, 20mg/ml peptone, 20mg/ml D-glucose)液体培养基中，28°C, 40h 振动培养。室温下IOOOOg, 5min离心收集菌体,用Tris-EDTA悬起细胞沉淀,煮沸IOmin,冰冻30min,再煮沸lOmin，离心收集上清作为PCR模板。以质粒pPIC 9K的通用引物P5和P6作为引物P55' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'P65' -GCA A ATGGCATTCTGACATCC-3'以高保真酶invitrogen Platinum pfx为聚合酶进行扩增。PCR扩增条件如下94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，共30个循环。经电泳检测，扩增结果如图6所示，7个单克隆的PCR扩增中有6个获得了约1220bp的DNA片段。表明有6个阳性克隆，并将阳性克隆命名为GS 115-pPIC9K-mmCTLA4Ig0(2)融合蛋白mmCTLA4Ig的制备发酵根据invitrogen毕赤酵母表达手册 分别培养PCR结果阳性的6个单克隆，得到发酵产物；纯化取发酵产物，4°C下20000g，离心lOmin，收集酵母培养物上清；将上清用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0,500mM NaCl，IOmM imidazole)透析过夜;次日添加约 5ml 的Ni-NTA(Qiagen)到透析上清中，使蛋白和Ni-NTA琼脂糖亲和层析凝胶相互结合4 6h ;用 20 30 个柱体积的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0,500mM NaCl，15mM imidazole)洗柱子，洗掉非特异结合的蛋白；用250mM咪唑缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8. 0,500mM NaCl,250mM imidazole)收集目的蛋白。检测以anti-hlgGlFc作为抗体对目的蛋白进行western blotting,电泳结果如图7所示，表明6个阳性克隆均获得了不同表达量的融合蛋白mmCTLA4Ig，融合蛋白的氨基酸序列如图8所示。本实施例证明本发明制备了目的基因片段，并成功地表达得到了本发明融合蛋白mmCTLA4Ig0实施例2本发明融合蛋白mmCTLA4Ig诱导表达条件的优化及其生化性质鉴定I、表达条件优化对诱导起始细胞密度、培养基pH、添加的诱导剂甲醇的终浓度、诱导表达时间进行考察，优化GS115-pPIC 9K-mmCTLA4Ig的诱导表达条件将实施例I得到的GS115-pPIC 9K-mmCTLA41 g阳性克隆接种到BMGY培养基(buffered glycerol complex medium,lOmg/ml yeast extract,20mg/ml peptone,0. 4 u g/ml biotin,0. ImM/ml potassium phosphate buffer,67mg/ml yeast nitrogenbase, I % glycerol)中，28 °C，280rpm培养至其对数生长期(0D600 = 2 6)。收集酵母细胞并将其培养在 BMMY 培养基(buffered methanol complex medium, lOmg/ml yeastextract,20mg/ml peptone,0. 4 μ g/ml biotin,0. ImM/ml potassium phosphate buffer,67mg/ml yeast nitrogen base,0. 5-5% methanol)中，进行诱导表达。(I)诱导起始细胞密度
在起始细胞密度梯度0D600 = 10，20，40，60或80，培养基pH = 6，添加的诱导剂甲醇的终浓度为3%，诱导时间72h的条件下进行诱导表达，收集本发明融合蛋白mmCTLA4Ig。通过SDS-PAGE银染鉴定，结果如图9所示，起始接种细胞密度为10或20AU/ml时，本发明融合蛋白的表达量极少，几乎无积聚，起始接种细胞密度增加到40AU/ml时，本发明融合蛋白的表达量显著提高，起始接种细胞密度增加到60 80AU/ml时，mmCTLA4Ig的表达量更高。(2)诱导时间在起始细胞密度梯度0D600 = 80，培养基pH = 6，添加的诱导剂甲醇的终浓度为3%，诱导时间0h，24h，48h，72h*96h的条件下进行诱导表达，收集蛋白mmCTLA4Ig。通过SDS-PAGE银染鉴定，结果如图10所示，诱导时间为24h时，本发明融合蛋白表达量极少，随着诱导时间的增加，本发明融合蛋白的表达量增加，诱导时间达到72h以后，表达量的增加幅度较小。(3)加入甲醇浓度在起始细胞密度梯度0D600 = 80，培养基pH = 6，添加的诱导剂甲醇的终浓度为0%、0. 5%、1%、3%或5% (v/v)，诱导时间72h的条件进行诱导表达，收集融合蛋白mmCTLA4Ig0通过SDS-PAGE银染鉴定，结果如图11所示，甲醇浓度为0%和0. 5%时，本发明融合蛋白的表达量少，甲醇浓度为3%时，本发明融合蛋白的表达量达到峰值，在甲醇浓度增至5%时，蛋白的表达量反而下降。(4)培养基 pH在起始细胞密度梯度0D600 = 80，培养基pH = 6. 0，6. 5，7. 0，7. 5或8. 0，添加的
诱导剂甲醇的终浓度3%，诱导时间72h的条件进行诱导表达，收集融合蛋白mmCTLA4Ig。通过SDS-PAGE银染鉴定，结果如图12所示，pH6. O 8. O时，本发明融合蛋白均
大量表达，且表达量无显著差别。实验说明，诱导起始细胞密度为40 80AU/ml，培养基pH6. O 8. 0，甲醇浓度为3 5% (v/v)，培养时间为24h 96h时，可以表达得到本发明融合蛋白。经过优化，本发明融合蛋白的最佳表达条件诱导起始细胞密度60 80AU/ml，培养基pH6. 0，每日添加3%甲醇浓度，连续培养72h 96h收集蛋白。2、本发明融合蛋白mmCTLA4Ig天然存在聚合状态分析及糖基化鉴定(I)对重组蛋白mmCTLA4Ig的天然聚合状态的分析用未添加β -巯基乙醇的上样缓冲液和添加了 β -巯基乙醇上样缓冲液分别上样相同的蛋白量。通过SDS-PAGE银染鉴定。将被SDS-PAGE分开的蛋白转移至PVDF (Bio-Rad)上(Transfer buffer 25mM Tris,192Mm glycine,15 % methanol ；constantvoltage lOOV-lh),并用 HRP 标记的抗体 anti-hlgGlFc 孵育，进行 westernblotting (anti-hlgGlFc)检测，最后用显色底物(Millipore, Billerica, MA, USA)显色并采集图片。
结果如图13所示，银染图上用￠-巯基こ醇(2-ME)处理的蛋白电泳在大约55kD处有单一条带，没有添加P -巯基こ醇的蛋白电泳在55kD、IlOkD处各有I条条带；westernblotting结果表明，mmCTLA4Ig存在两种不同的形式即ニ聚体和单体。上述结果证明，本发明制备的融合蛋白mmCTLA4Ig主要是以ニ聚体的形式存在。(2)对重组蛋白mmCTLA4Ig的糖基化状态的鉴定用N-糖苷酶(Glycosylase, Sigma, USA) 37 °C 条件下处理蛋白 mmCTLA4Ig lh。对N-糖苷酶处理前后的蛋白mmCTLA4Ig进行SDS-PAGE银染鉴定，并进ー步进行westernblotting 分析。结果如图14所示，在N-糖苷酶的作用下mmCTLA4的分子量大概下降了 4-5KD，说明本发明制备的融合蛋白mmCTLA4Ig是糖基化的。实验证明，在本发明提供的表达条件下，可以表达得到本发明融合蛋白。而且，经过鉴定，本发明表达得到的融合蛋白天然存在聚合状态主要以ニ聚体和糖基化形式存在，与天然CTLA4蛋白的性质相似。实施例3融合蛋白mmCTLA4Ig的B7阳性细胞结合能力鉴定I、实验材料细胞株Raji (编号TcHu44，人Burkitt’s淋巴瘤的瘤细胞株)和K562(编号，人慢性髓源白血病细胞株)均购于中国科学院细胞库，Raji细胞株为B7阳性，K562细胞株为B7阴性细胞株。2、实验方法FITC标记蛋白先用IM Na2CO3调整蛋白溶液的pH到8. 5，然后按照待标记蛋白的20倍摩尔量添加溶解于ニ甲基甲酰胺的FITC，室温避光孵育lh，4°C下用PBS缓冲液透析除去没有结合到蛋白上的FITC。基于人CTLA4是可和人B7分子結合，我们用FITC标记本发明融合蛋白mmCTLA4Ig(实施例I所述方法制备)，与B7阳性和B7阴性的细胞株Raj i (B7+)和K562 (B7-)进行染色，观察本发明融合蛋白mmCTLA4Ig对细胞的结合是否具有B7配体依赖性。分别取Raji (B7+)和 K562 (B7-)，用 PBS 洗涤两次，4°C 下 300g 离心 5min，用 300 ylPBS 重悬起 I X IO5 细胞，并与 1.0 1.5iig FITC-mmCTLA4Ig 在 4°C孵育 lh。然后用PBS洗涤细胞两次，分别用流式细胞仪和荧光显微镜观察蛋白与细胞的结合状況。3、实验结果重组蛋白mmCTLA4Ig对细胞的结合状况如图15所示流式细胞仪观察结果显示mmCTLA4Ig能够结合到Raji细胞上，不能结合到K562上；荧光显微镜观察结果显示孵育后Raji细胞的荧光强度明显强于K562细胞。本实施例证明，本发明制备的融合蛋白mmCTLA4Ig与天然的CTLA4具有相似的性质，能特异性的与B7+细胞结合，可阻止CD28分子与B7分子结合，进而抑制T细胞活化。
实施例4重组蛋白mmCTLA4Ig对淋巴细胞增殖抑制的体外功能鉴定1、实验材料恒河猴约2 3岁，均被饲养在四川大学华西医院实验动物中心；小鼠为Balb/C和C57小鼠，均为8周龄雄鼠；人的外周血淋巴细胞是由健康志愿者提供。人和猴PBMCs的获得取5_15ml肝素抗凝的健康猴血或人志愿者的血，用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS, 137mM NaCl, 2. 68mM KC1，8. ImM Na2HPO4,1. 47KH2P04, pH 7. 2)稀释，然后小心的铺到等体积的Ficoll (I. 077)溶液上面。室温下400g离心30min，离心后的溶液出现了明显的四个分层，从上而下第二层乳白色的细胞就即为PBMCs。收集到的PBMCs用PBS洗涤两遍，并用含有100U/ml青霉素，IOOmg/1四环素和10 %胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞至I X IO6密度培养。老鼠的淋巴细胞的获得先将小鼠处死，75%酒精浸泡I 2min，剔除脾脏周围的脂肪和结缔组织，洗涤脾脏；然后用镊子取出脾脏放在筛网上，添加5ml无血清1640戳破研磨，用8ml无血清1640将细胞从筛网上冲下来，1200rpm离心3min收集细胞。室温用Tris-NH4Cl裂解红细胞3min。补充无血清1640至离心管中，1200rpm离心3min后弃上清。重复洗涤一次。用含有血清的1640重悬细胞并进行培养。本发明融合蛋白mmCTLA4Ig :按照实施例I所述方法制备。UCon A刺激的淋巴细胞增殖的抑制试验以不添加淋巴细胞且不添加本发明融合蛋白mmCTLA4Ig的孔作为空白对照，以不添加mmCTLA4Ig的孔的淋巴细胞增殖设为100%，分析mmCTLA4Ig对Con A刺激引起的淋巴细胞增殖的影响。收集恒河猴、人、老鼠的淋巴细胞，按5X IO5细胞/孔接种于96孔板中，再加入ConA(终浓度5 μ g/ml)至250ul培养体系；按照梯度浓度加入本发明融合蛋白mmCTLA4Ig 0/5/10/20/30/40 μ g/ml (至少2个复孔)；第3天根据BrdU试剂盒说明书(CellProliferation ELISA,BrdU, Roche Applied Science)测定本发明融合蛋白 mmCTLA4Ig 对淋巴细胞的增殖抑制作用；用酶标仪测定370nm处吸光值。结果如图16所示，本发明融合蛋白mmCTLA4Ig对ConA刺激的猴源、人源、鼠源的淋巴细胞的均有抑制作用，且抑制率随着蛋白浓度的增加而增加；另一方面，本发融合蛋白对猴源淋巴细胞的抑制作用明显强于对人源和鼠源淋巴细胞的抑制作用，其中，融合蛋白的加入量为5 μ g/ml时，差异最为显著，对猴源淋巴细胞的抑制率为85%，对鼠源淋巴细胞的抑制率为45%，对人源淋巴细胞的抑制率为50%。2、同种异体淋巴细胞混合培养增殖反应以不添加任何淋巴细胞且不添加本发明融合蛋白mmCTLA4Ig的孔作为空白对照，将不添加本发明融合蛋白mmCTLA4Ig的孔的淋巴细胞增殖设为100%，分析本发明融合蛋白mmCTLA4Ig对同种异体淋巴细胞刺激引起的淋巴细胞增殖的影响。收集恒河猴、人、老鼠新鲜分离的淋巴细胞作为反应细胞，按5X IO5细胞/孔接种于96孔板中，经丝裂霉素C(25y g/ml，37°C，15min)处理后的相同数目的同种异体淋巴细胞作为刺激细胞，二者混合培养；第5天根据BrdU试剂盒说明书(Cell ProliferationELISA,BrdU, Roche Applied Science)测定本发明融合蛋白mmCTLA4Ig对淋巴细胞的增殖抑制作用，
结果如图17显示，本发明融合蛋白mmCTLA4Ig对同种异体淋巴细胞刺激的猴源、人源、鼠源的淋巴细胞均有抑制作用，且抑制率大体随着本发明融合蛋白浓度的增加而增加；另一方面，本发融合蛋白对猴源淋巴细胞的抑制作用明显强于对人源和鼠源淋巴细胞的抑制作用，其中，融合蛋白的加入量为5μ g/ml时，差异最为显著，对猴源淋巴细胞的抑制率为75%，对鼠源淋巴细胞的抑制率为45%，对人源淋巴细胞的抑制率为50%。本实施例证明了融合蛋白mmCTLA4Ig具有明显的免疫抑制作用，且具有高度种属特异性。综上，本发明成功地制备了融合蛋白mmCTLA4Ig，该融合蛋白可阻止⑶28分子与B7分子结合，进而抑制T细胞活化，同时，该融合蛋白具有明显的免疫抑制作用，且具有高度种属特异性，可用于制备猴特异性的免疫抑制剂，具有良好的应用前景。
权利要求
1.一种基因，其特征在于所述基因是核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子。
2.一种重组载体，其特征在于包含权利要求I所述的基因。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体是重组pPIC9K质粒。
4.一种重组菌，其特征在于它包含权利要求2或者3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述的重组菌为重组毕赤酵母。
6.一种蛋白质，其特征在于它由权利要求I所述的基因编码。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO 2所示。
8.一种制备权利要求6或者7所述蛋白质的方法，其特征在于包含如下步骤 i、取权利要求4或者5所述的重组菌，接种到BMGY培养基上，培养基的pH为6.O，28°C，280rpm培养至其对数生长期，其OD6tltl = 2 6 ;ii、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度28°C，转速250rpm，进行诱导表达，诱导剂为甲醇，诱导起始重组菌密度为40 80AU/ml，培养pH :6. O 8. O ;诱导剂浓度O.5% 5. 0% (v/v);诱导时间24 96h ； i i i、收集培养物上清，分离纯化，即得到目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤ii诱导表达的参数为诱导起始的重组菌密度60 80AU/ml ;培养pH :6. O ;诱导剂浓度3% ;诱导时间72h 96h。
10.权利要求6或者7所述的蛋白质在制备CD28分子拮抗剂中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述蛋白质在制备拮抗CD28分子与B7分子相互作用的拮抗剂中的用途。
12.权利要求6或者7所述的蛋白质在制备免疫抑制剂中的用途。
13.—种CD28分子拮抗剂，其特征在于其有效成分为权利要求6或者7所述的蛋白质。
14.根据权利要求13所述的拮抗剂，其特征在于所述的拮抗剂为拮抗CD28分子与B7分子相互作用的拮抗剂。
15.—种免疫抑制剂，其特征在于其有效成分为权利要求6或者7所述的蛋白质。
全文摘要
本发明提供了一种基因，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID NO1所示的DNA分子。本发明还提供了上述基因编码的融合蛋白及其制备方法和用途。本发明提供的融合蛋白mmCTLA4Ig可阻止CD28分子与B7分子结合，进而抑制T细胞活化，具有明显的免疫抑制作用，可用于制备免疫抑制剂，尤其是适合于恒河猴的免疫抑制剂。
文档编号A61K47/48GK102618565SQ20121005129
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者万琳, 刘珊, 卢晓风, 朱升云, 杨浩, 程惊秋 申请人:四川大学华西医院