专利名称：一种预防帕金森病的中药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物，具体地说，是一种预防帕金森病的中药组合物。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常见的神经系统退行性疾患， 主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的药物。但长期应用后大部分患者会出现症状波动、运动障碍和精神症状。加之实验室发现高浓度多巴胺(dopamine， DA)和左旋多巴由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死。因此，联合其他药物共同预防H)和H)运动并发症十分迫切。此外，研究发现纹状体GRKs和Arrestins表达的变化与H)的发展关系密切。近年研究表明，帕金森病运动并发症的发生与表达Dl受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的憐酸化蛋白-32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症(levodopa-induced dyskinesia, LID)的发病。目前认为使用左旋多巴控释剂、多巴胺受体激动剂、B型单胺氧化酶(monoamine oxidase-B type,MAO-B)抑制剂和儿茶酌氧位-甲基转移酶抑制剂(eateehol-O-methyl transferase inhibitor,C0MTI)可延缓运动并发症的出现。但这些药物往往副作用较大， 容易形成耐药性，不宜长期服用。我国在中医药预防PD方面积累了丰富经验，总结其预防原则是益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则。中国专利文献CN100409867C公开了一种熄风止颤胶囊，提供了由白芍、钩藤等组成的复方中药，预防ro，改善震颤症状、肌强直、运动不能症状。李敏等提出了补肾活血中药可以改善ro患者运动并发症症状，且疗效随预防时间延长而增加，该补肾活血中药由山萸肉10g，何首乌15g，丹参15g，水蛭6g等中药组成，但没有公开其他中药成分 (详见李敏等.补肾活血颗粒预防帕金森病运动并发症临床研究.中华中医药杂志， 2011, 26(6) : 1296-1299.)。但是关于一种预防帕金森病的中药组合物目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中药组合物在制备预防帕金森病的疾病药物中的应用。本发明的再一的目的是，提供一种预防帕金森病的中药组合物。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种中药组合物在制备预防帕金森病的疾病药物中的应用，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻5-12份、黄芪5-10份、熟地黄5-10份、白芍药5-15份、当归5-10份、钩藤5_10份、僵蚕2_10份。所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻6-10份、黄芪6-9份、熟地黄6-9份、白芍药8-13份、当归6-7份、钩藤6-9份、僵蚕4_6份。所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻8份、黄芪8份、熟地黄8份、 白芍药10份、当归7份、钩藤8份、僵蚕6份。所述的中药组合物在制备预防帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种预防帕金森病的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻5-12份、黄芪5-10份、熟地黄
5-10份、白芍药5-15份、当归5-10份、钩藤5-10份、僵蚕2_10份。所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻6-10份、黄芪6-9份、熟地黄
6-9份、白芍药8-13份、当归6-7份、钩藤6-9份、僵蚕4_6份。所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻8份、黄芪8份、熟地黄8份、 白芍药10份、当归7份、钩藤8份、僵蚕6份。所述的中药组合物在制备预防帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。所述的中药组合物的剂型是片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。本发明优点在于
1、本发明的中药组合物，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、 无毒副作用、价格低等优点，采用益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，从病原根本入手，对症下药，以达到预防的效果；
2、制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的预防帕金森病和帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
附图I是不同剂量组中药对ro大鼠模型AIM总分的影响，#小剂量组与西药组比较，均P〈0. 05 ;*中剂量组与小剂量组比较，均P〈0. 05 ;+大剂量组与中剂量组比较，均 Ρ〈0·05。附图2是不同剂量中药组合物对ro大鼠模型剂峰旋转次数的影响，#西药组与小剂量组比较，均p〈0. 05 ;*中剂量组与小剂量组比较，均P〈0. 01 ；+大剂量组与中剂量组比较，均 Ρ〈0· 05。附图3是中药组合物不同剂量对H)模型大鼠纹状体区GRK6的影响的免疫组化结果，I为假手术组，2为ro对照组，3为西药组，4为TCM-小剂量组，5为TCM-中剂量组，6为 TCM-大剂量组；U为未损伤侧，L为损伤侧；*ro对照组与假手术组比较P〈0. 01，#西药组与 PD对照组比较Ρ〈0· 05，+TCM组与西药组比较，均Ρ〈0· 05。附图4是中药组合物不同剂量对H)模型大鼠纹状体区GRK6的影响的Western结果，1、2为假手术组，3、4为H)对照组，5、6为西药组，7、8为TCM-小剂量组，9、10为TCM-中剂量组，11、12为TCM-大剂量组；1、3、5、7、9、11为未损伤侧，2、4、6、8、10、12为损伤侧;* 与假手术组比较，P〈0. 01 ；#与PD对照组比较，ρ〈0· 05 ；+TCM与西药组比较，ρ〈0· 01。附图5是中药不同剂量对F1D运动并发症大鼠模型纹状体区β -arrestinl的影响的免疫组化结果，I为假手术组，2为H)对照组，3为西药组，4为TCM-小剂量组，5为TCM-中剂量组，6为TCM-大剂量组；U为未损伤侧，L为损伤侧。附图6是中药不同剂量对F1D运动并发症大鼠模型纹状体区β -arrestinl的影响的Western结果，1、2为假手术组，3、4为H)对照组，5、6为西药组，7、8为TCM-小剂量组， 9、10为TCM-中剂量组，11、12为TCM-大剂量组；1、3、5、7、9、11为未损伤侧，2、4、6、8、10、 12为损伤侧。附图7是中药不同剂量对ro运动并发症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-3 2 (Thr75)表达的影响的免疫组化结果，A假手术组，B为H)对照组，C为西药组，D为TCM-小剂量组，E为TCM-中剂量组，F为TCM-大剂量组。附图8是中药不同剂量对ro运动并发症大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32 (Thr75 )表达的影响的Western结果，I为假手术组，2为LID对照组，3为西药组，4为 TCM-小剂量组，5为TCM-中剂量组，6为TCM-大剂量组。附图9是中药不同剂量对H)运动并发症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响的免疫组化结果，A假手术组，BSro对照组，C为西药组，D为TCM-小剂量组，E为 TCM-中剂量组，F为TCM-大剂量组。附图10是中药不同剂量对H)运动并发症大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响的Western结果，I为假手术组，2为H)对照组，3为TCM-小剂量组，4为TCM-中剂量组，5为TCM-大剂量组。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。本发明提供一种预防帕金森病的中药组合物，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻5-12份、黄芪5-10份、熟地黄5-10份、白芍药5-15份、当归5_10份、钩藤5-10份、僵蚕2-10份。实施例I中药组合物的制备(一)
天麻5份、黄芪10份、熟地黄5份、白芍药15份、当归5份、钩藤10份、僵蚕2份，常规方法煎煮。实施例2中药组合物的制备(二)
天麻6份、黄芪9份、熟地黄6份、白芍药14份、当归6份、钩藤9份、僵蚕3份，常规方法煎煮。实施例3中药组合物的制备(三)
天麻7份、黄芪7份、熟地黄7份、白芍药12份、当归8份、钩藤7份、僵蚕4份，常规方法煎煮。实施例4中药组合物的制备(四)
天麻8份、黄芪8份、熟地黄8份、白芍药10份、当归7份、钩藤8份、僵蚕6份，常规方法煎煮。实施例5中药组合物的制备(五)
天麻9份、黄芪6份、熟地黄9份、白芍药9份、当归9份、钩藤6份、僵蚕5份，常规方法煎煮。实施例6中药组合物的制备(六)
天麻10份、黄芪5份、熟地黄10份、白芍药8份、当归10份、钩藤5份、僵蚕7份，常规
方法煎煮。
实施例7中药组合物的制备(七)
天麻11份、黄芪10份、熟地黄8份、白芍药7份、当归8份、钩藤10份、僵蚕8份，常规
方法煎煮。实施例8中药组合物的制备(八)
天麻12份、黄芪8份、熟地黄6份、白芍药5份、当归6份、钩藤8份、僵蚕10份，常规方法煎煮。需要说明的是，实施例1-8所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。实施例9中药组合物片剂/胶囊剂的制备
取实施例1-8任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加入制药辅料，真空干燥，粉碎制粒，压制成片剂或填充装胶囊。实施例10中药组合物颗粒剂的制备
取实施例1-8任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制粒，干燥，整粒，得颗粒，分装。实施例11中药组合物合剂/ 口服液/糖浆剂的制备
取实施例1-8任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁。再加
6-10倍量水，煎煮O. 5-2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏，或浓缩至稠浸膏干燥制备成颗粒；加适当制药辅料，制成合剂、口服液或糖衆剂。实施例12本发明的中药组合物的临床前试验一、实验方法
I. ro大鼠模型制备根据巴茂文等方法制备ro大鼠模型。取65只大鼠进入实验，其中5只为假手术组，于内侧前脑束(MFB)注射生理盐水。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠， 严格平头颅位固定大鼠于脑立体定向仪，参照包新民所著大鼠脑立体定向图谱，确定右侧前脑内侧束(right medical forebrain, MFB)坐标①前囟后3. 7 mm,矢状缝右侧I. 7 mm, 卢页骨骨膜下7. 8 mm,门齿线2. 4 _ 前囟后4. 4 mm,矢状缝右侧I. 2 mm,卢页骨骨膜下7. 8 mm,门齿线2. 4 mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10 μ I的微量注射器抽取6-0HDA6 μ I (含O. 2%维生素C的生理盐水配置，浓度4 μ g/μ 1)，每点注射3μ 1，留针10 min后退针， 缝合创面。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡(0.5 mg / kg)，平均旋转频率>7次/min为成功H)模型。模型制备与行为学测定将25只成功的H)模型随机分为3大组。(I)PD对照组 PD模型大鼠腹腔注射O. 2%维生素C液29天；(2)西药处理组腹腔注射左旋多巴甲酯+ 苄丝肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/ kg苄丝肼，溶于含O. 2%维生素C的消毒生理盐水中)，2次/d (上午9点和下午5点)，持续29d ; (3)中药组合物小剂量组(TCM-小剂量组)、中药组合物中剂量组(TCM-大剂量组)、中药组合物大剂量组(TCM-大剂量组)给予左旋多巴甲酯/苄丝肼的基础上分别加用本发明的中药组合物，9 ml /kg，每日I次灌胃， 连续4周。中药组合物中剂量组参照实施例4所述的方法制备中药组合物；中药组合物大剂量组按照中剂量组各中药原料药各增加20% ;中药组合物小剂量组按照中剂量组各中药原料药各减少20%。在治疗过程中于第2、8、15、22、29天上午用药后进行大鼠行为学观察和评分。AM评定AM分成4个组分(上肢AM、口面部AM、轴性AM和旋转AM)进行评定， 每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级(0-4):0无；I持续时间小于30s ;2持续时间大于30s，小于60s ；3持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察lmin。AM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上I只大鼠一次用药后各组分AIM最大评分为4分，总AIM 评分为16分。剂峰旋转次数注射左旋多巴后，每5min记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。免疫组化显示纹状体β -arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的变化 结束注射后12h，3%戊巴比妥钠麻醉，左心室灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑后相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5μηι。石腊切片脱腊至水；3%双氧水室温避光孵育5min,以消除内源性过氧化氢酶活性；PH7. 7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(EDTA-Tris-HCl微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min ;兔抗鼠GRK6抗体、兔抗鼠β -arrestinl多克隆抗体、兔抗鼠DARPP-32抗体、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗体、兔抗大鼠总ERK1/2和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2单克隆抗体4°C湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗， 37°C孵育20min ;滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37°C孵育20min ;联苯二胺 (3, 3 " -diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10X40)下观察， 采用0LYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5. I图象处理软件进行半定量分析，计算阳性细胞指数(IOD) =阳性细胞面积X校正光密度值(测量区光密度一背景光密度)。法检测β-arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的表达最后一次注射后3h，3%戊巴比妥钠麻醉，迅速断头取脑，冰上剥离双侧纹状体，超声裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度后，置_80°C冻存备用。40 μ g蛋门样本经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，以电转膜仪转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭2h,按照相应浓度稀释抗GRK6抗体(I 500)、抗β -arrestinl抗体 (1:500)、抗总 DARPP-32 抗体(I 1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75)抗体(I :1000)、抗总 ERK1/2 抗体(I 1000)或抗磷酸化 ERK1/2 抗体(I 500)或抗 β -actin (I 1000),4°C 轻摇孵育过夜。次日加入二抗，室温下摇床孵育I h;滴加ECL显色混合液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。Western blot图像采用SmartView2000图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。统计分析方法
实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所得计量资料以均数土标准差( I 土s)表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P〈0.05 为差异具有统计学意义。
二、结果
I.中药组合物对ro大鼠模型行为的影响
I.I中药组合物对ro大鼠模型各组分AIM评分的影响
就口面部AIM评分而言，第2天各组间均值无显著差异。第8、15、22、29天各组间均值差异显著(/^=4. 981=22. 701=30. 961=23. 27，/X0. 01)。其中小剂量组在第22天口面部 AM评分较西药处理组降低，差异有统计学意义(t=2. 50, P<0. 05)，其余几天差异均无统计学意义；中剂量组第8、15、22、29天口面部AIM评分较小剂量组明显降低，差异有统计学意义(t=2. 86、t=3. 80、t=4. 38、t=6. 54，均/XO. 05);中剂量组与大剂量组比较，仅于第22天大剂量组较中剂量组口面部AIM评分降低，差异有统计学意义( =2. 50，7X0.05)。就上肢AM评分而言，第2、8天各组均值无明显差异，第15、22、29天各组间均值差异有统计学意义0^=15. 12、Α=32. 86、片35. 80，7X0.01)。用药第2天和第8天小剂量组上肢AM评分与西药处理组比较无显著性差异，至用药第15、22、29天小剂量组上肢AM 评分低于西药组，差异有统计学意义( =4. 45、 =4. 47，均7X0.01)。第15、22、29天中剂量组比小剂量组上肢AM评分明显降低，差异有统计学意义( =3.40、 =4.04、 =3. 95，均 Ρ<Λ· 01)。大剂量组与中剂量组之间比较，差异无统计学差异。就轴向AM评分而言，第15、22、29天各组间均值差异有统计学意义(片3.30、 F=2b. 06,/^=36.41, 7X0.01)。小剂量组用药至第22、29天轴向AM值比西药处理组降低， 差异有统计学意义( =3. 93、 =3. 04，均/XO. 05);中剂量组比小剂量组比较，仅于第29天差异有统计学意义( =3. 05，P<Q. 05);大剂量组明显降低了轴向AM值，但与中剂量组比较，仅于第29天有差异( =2. 83，7X0.05)，其它时间点差异无统计学差异。就旋转AM评分而言，第8、15、22、29天各组间均值差异显著(/MO. 50^=11. 62、 /^=18. 92、/^=61. 26，P<0. 01)。小剂量组与西药处理组旋转AM评分比较，差异无统计学意义。中剂量组用药至第15、22、29天，旋转AM评分比西药组明显降低，差异有统计学意义 ( =3. 43、t=5. 11、t=7. 63,均/X0.01);大剂量组与中剂量组比较，第8、15、29天差异明显 ( =3. 81、t=2. 52、 =3. 58,均/*〈0· 05)。表I中药组与西药组AM评分的比较土S，分)
权利要求
1.一种中药组合物在制备预防帕金森病的疾病药物中的应用，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻5-12份、黄芪5-10份、熟地黄5-10份、白芍药5-15份、当归5-10份、钩藤5-10份、僵蚕2-10份。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻6-10份、黄芪6-9份、熟地黄6-9份、白芍药8-13份、当归6_7份、钩藤6_9份、 僵蚕4-6份。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻8份、黄芪8份、熟地黄8份、白芍药10份、当归7份、钩藤8份、僵蚕6份。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的中药组合物在制备预防帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。
5.一种预防帕金森病的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻5-12份、黄芪5-10份、熟地黄5-10份、白芍药5-15份、当归5_10份、钩藤5-10份、僵蚕2-10份。
6.根据权利要求I所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻6-10份、黄芪6-9份、熟地黄6-9份、白芍药8-13份、当归6_7份、钩藤6-9份、僵蚕4-6份。
7.根据权利要求I所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻8份、黄芪8份、熟地黄8份、白芍药10份、当归7份、钩藤8份、僵蚕6 份。
8.根据权利要求5-7任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物在制备预防帕金森病运动并发症的疾病药物中的应用。
9.根据权利要求5-7任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物的剂型是片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、口服液或糖浆剂。
全文摘要
本发明涉及一种中药组合物在制备预防帕金森病的疾病药物中的应用，所述的中药组合物由以下重量份的原料药制成天麻5-12份、黄芪5-10份、熟地黄5-10份、白芍药5-15份、当归5-10份、钩藤5-10份、僵蚕2-10份。本发明优点在于配伍符合中药“君臣佐使”原则，药味数较少，具有疗效高、无毒副作用、价格低等优点，采用益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，从病原根本入手，对症下药，以达到预防的效果；制备方法简单，成本低，对环境友好，适于长期服用，是一种安全有效的预防帕金森病和帕金森病运动并发症的中药组合物，具有良好的应用前景。
文档编号A61K36/8988GK102600372SQ201210063008
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘振国, 吴娜, 袁伟恩, 陈伟, 魏江磊 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院