专利名称：一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药领域领域，尤其涉及一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒及其制备方法。
背景技术：
多糖硫酸酯是多糖衍生物，由多糖链单糖分子上的某些羟基被硫酸根取代而形成。多糖硫酸酯大致可分成两类，一类是天然的硫酸化多糖，如动物糖胺聚糖、褐藻多糖硫酸酯、卡拉胶等。此类药物需通过分离、纯化获得，来源有限，提纯工艺复杂，价格昂贵，产品质量不易控制。另一类是人工半合成产物，通过简单分离获得丰富的天然多糖，经硫酸酯化结构修饰获得多糖硫酸酯，制备工艺简单，产物成本低，易通过控制反应条件按目标产物的结构进行化学合成。我国是食用菌、药用菌生产大国，年产量2000多万吨，占世界总产量的60%以上。以茯苓为例，茯苓国内年产量高达1万多吨。茯苓多糖含量占干菌核的90%以上，提取、纯化相对容易，开发成本低。开发利用真菌多糖这一廉价的丰富资源具有巨大的工业价值。多糖硫酸酯药学活性十分广泛，具有抗凝血、抗血栓形成、抗病毒(HIV、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒等)、降血脂和抗肿瘤等活性，尤其是其抗艾滋病的功能已引起国内外许多研究者的极大兴趣，且硫酸根取代度越高，抗病毒活性越强。1987年原联邦德国的Beyer与Hoechst公司合作，人工合成硫酸化木聚糖用于艾滋病的治疗。硫酸化右旋糖酐钠盐(Dextran sulfate sodium)已是临床治疗II a及II b型高血脂症和保护血管内皮的药物。众多研究表明茯苓多糖多为带少量1，6分支的β -1，3葡聚糖。申请人所在实验室一直从事多糖的硫酸酯化人工半合成及药效学实验研究。目前，已通过中试确定茯苓多糖硫酸酯生产的最佳工艺路线和质量分析监控体系，产品产量、性质稳定，成本较低；药效学实验揭示本茯苓多糖硫酸酯属于低毒或无毒物质，具有抗凝血、抗血栓和抗肾衰作用(参见中国专利 200410013931. 1,200410064766. 2、生物学杂志，2004，21 (1) 36、中国药学杂志，2005，40(12) :908)。但是，不论是天然硫酸化多糖还是人工半合成多糖硫酸酯，由于分子量大，含有大量硫酸基、羧基阴离子基团而呈强极性，口服吸收比较困难。如肝素广泛用于血栓栓塞性疾病、弥漫性血管内凝血等疾病的治疗，给药方式基本为静脉注射和皮下注射，并需要住院观察。为了方便多糖硫酸酯类药物给药，减轻病人和医院的住院负担，开发缓释(降低粘膜出血的副作用)、高效的口服制剂迫在眉睫。采用纳米粒制剂技术，将这类药物和肠吸收载体壳聚糖有机结合，可以实现该类药物口服吸收。口服给药无创伤，最为方便和经济，至今仍为最主要的给药方式。但由于有胃肠粘膜屏障和生物降解，像疫苗、蛋白、多糖这类大分子、极性药物口服生物利用度低或无，长期以来人们一直致力于这类药物的口服制剂的创新与研制，微粒胶体制剂最具代表性的领域。该领域中尤以脂质体和纳米粒的研究最为深入。脂质体的制备重现性差，包封率低，不稳定，对成膜材料质量规格要求高，目前国内少量用于滴眼剂、气雾剂和外敷制剂中。而复合纳米粒制剂由于稳定、包封率高、粒径小(1-1000 nm)、跨肠粘膜吸收性好、制备工艺不使用有机溶剂和超声波等优点正逐步被越来越重视。纳米粒中充当载体的生物化学材料有很多种，壳聚糖是最突出的一种。壳聚糖又名脱乙酰壳多糖，分子结构为β - (1，4) -2-氨基-D-葡聚糖胺，是自然界唯一带正电荷的多糖。壳多糖为排在纤维素后的地球第二大生物资源。壳聚糖不仅价格低廉，还具有很多优良特性，如生物相容性好、可生物降解、无免疫原性、无毒副作用。分子水平的研究认为壳聚糖作为跨肠粘膜促吸收的作用机制是其分子上携带的正电荷连接到肠粘膜上皮细胞膜上，使得细胞间紧密结合蛋白的结构发生改变，从而导致跨膜通道暂时性、可逆性地开放。近年来，我国人口老龄化程度日益加剧，血栓性疾病的发生率不断上升，抗血栓药物市场迅速扩容。根据中国数字医药网的检测数据，2006年，全国使用抗血栓药物总金额在22亿元左右，年增长率为15%-20%。而肝素类产品是目前主要的抗血栓产品，市场份额占抗血栓药物的50%以上。因此开发代肝素的茯苓多糖硫酸酯类药物新剂型，方便病人使用，降低用药成本，提高疗效，减轻副作用，必将有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提出一种成本低、疗效好且方便病人使用的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒及其制备方法。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案
一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于其溶解于7<ρΗ<7. 5的37°C左右的溶液中时，不解聚，其粒径为IOOnm〈粒径<1000nm，+5mN<zeta电位<+40mV，分散系数<0. 3 ；
其是由下述原料制得茯苓多糖硫酸酯、壳聚糖以及乙酸；壳聚糖与茯苓多糖硫酸酯的重量比为10:0.1-10，所述的乙酸的用量需可完全溶解壳聚糖。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于60%，其分子量在0. 5-50万Da之间，所述的乙酸为体积比为0. 1_1%。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于90%。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖分子量在1-5万Da之间。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于茯苓多糖硫酸酯分子量在0. 5 -5. 0万Da之间；单糖硫酸根的取代度为1-3。所述的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤
A、壳聚糖用所述的乙酸完全溶解，茯苓多糖硫酸酯用去离子水配成浓度为0.1%-10%的溶液，在温度为20-80°C，以及50-1000 rpm搅拌下缓慢将茯苓多糖硫酸酯溶液加入壳聚糖溶液中，持续搅拌0. 5-2小时，此时混合液变混浊，得到稳定的纳米胶体溶液；
B、采用喷雾干燥法对所得的纳米胶体溶液进行喷雾干燥，喷嘴干燥温度70-120°C，高温喷雾干燥，即得产品。
所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于所述的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒可与适当的赋形剂进一步制作成缓释或控释制剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、气雾剂、片剂直接服用。包括以下步骤
(1)、茯苓去皮、干燥、粉碎，分3-5次溶于总体积为其10-15倍的0.5 mol/L NaOH中，每次均在4-10 ！浸提多糖5-10 h，合并浸提所得上清液，用10%左右的醋酸将上清液中和至pH6-8，4-10 °C下沉淀过夜，低温离心收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3-5次，再用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，70-90 °C干燥，得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
(2)、在旋转蒸发仪的反应瓶中加入氨基磺酸和有机溶剂，预热至反应温度80°C左右，氨基磺酸完全溶解后加入步骤(1)所得的干燥的茯苓多糖粉末，多糖和有机溶剂的料液比g:mL =1-20:100，氨基磺酸和茯苓多糖的单糖残基的摩尔比为2-5:1，反应温度70-95 °C，反应体系抽真空，旋转反应0. 2-5小时，转速60-150 rpm ；
(3)、反应结束后，冷却至室温，用饱和碱溶液调反应液pH到9-10，继续抽真空除氨，当PH值显著下降至6. 5以下后，再加碱溶液调pH到9-10，再抽真空，如此反复2-10次，直至反应液无氨气味、PH值维持在7以上为止；
(4)、再向步骤(3)所得的反应液中加其3-5倍体积的95%左右的乙醇，沉淀多糖硫酸酯，过滤后再复溶于水，过滤，放入超滤器中脱盐并浓缩，用饱和氯化钡溶液检测浓缩液中硫酸根的残留量，直至无白色沉淀，超滤膜分子截留量为3000-15000 Da，浓缩液用其3_5倍体积的95%左右的乙醇沉淀2-5次，最后收集沉淀，80-105 °C烘干粉碎，即得产品。本发明的原理为
本发明利用分子间的静电作用将茯苓多糖硫酸酯和壳聚糖在合适的酸碱介质中相互包合形成纳米胶体溶液，通过调节主药和载体之间的比例来控制纳米粒粒径大小，以提高药物口服吸收的生物利用度。本发明公开的纳米粒除了具有普通纳米粒优点外，还可以进一步延长药物作用时间，增加产品稳定性，有利于产品长期存放；还可以进一步制作成缓释(控释)制剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、片剂等，即可直接服用，也可以水化后服用。本发明公开的纳米粒可以防治血管栓塞、弥漫性血管内凝血、病毒感染和高血脂等疾病。高效、稳定、安全，生物利用度高，副作用小。Chen Mei-Chin等将脱乙酰壳聚糖与肝素复合制备纳米粒(Biomaterials，2009，30: 6629 - 6637)，发现壳聚糖的分子量和溶液pH对粒度大小和zeta电位影响很大，使用30KD壳聚糖在pH<7的溶液环境下才能获得稳定的纳米粒，绝对生物利用度高达20. 5%。当pH>7后，纳米粒子随pH值的增大而逐步崩解，壳聚糖和肝素解聚，向溶液中释放，当壳聚糖释放足够多时生成沉淀。众所周知，胃部PH值远小于7，壳聚糖-肝素纳米粒可完整存在，但胃的吸收能力十分有限，小肠是吸收药物的主要部位，但从胃向十二指肠的过渡中，由于胰液的分泌，内容物PH值逐步变大，直至大于7，所以上述壳聚糖-肝素纳米粒可能在十二指肠、空肠部位还没有被完全吸收即解聚，影响药效。壳聚糖产地不同、脱乙酰方法不同，所得产品分子量也不同，但一般分子量可达IO5数量级，达不到制备上述纳米粒的要求，使用前必须降解。降解增加成本和工业化难度。本发明主要针对上述纳米粒的制备需要使用小分子壳聚糖和溶液介质PH<7的限制。以茯苓多糖硫酸酯取代肝素作为口服纳米粒的活性成分，有益于降低药物成本。人工半合成茯苓多糖硫酸酯及其壳聚糖纳米粒制备的生产工艺简单，工艺条件温和，对设备无特殊要求，生产过程无固体废料，溶剂可回收套用。茯苓多糖原材料来源丰富。人工半合成茯苓多糖硫酸酯具有和肝素相似的抗凝血、抗血栓药效，通过控制反应条件，可以得到高硫酸根取代度、低分子量的产物，有利于口服吸收和增强药效。本发明的有益效果
1、用茯苓多糖硫酸酯替代肝素，降低成本，弘扬中医文化，将茯苓多糖硫酸酯制备成口服制剂，方便用药，大大降低粘膜出血风险，解决硫酸化多糖的口服不吸收问题，开发缓释、高效的口服制剂，降低这类药物注射给药的粘膜出血副作用，减轻病人和医院的住院负担；
2、纳米粒制备过程中引入高温喷雾干燥，纳米粒结构被“固定化”，使其适合小肠吸收，提高生物利用度，同时壳聚糖也不再需要降解成小分子，可直接使用；
3、本方法制备的纳米粒载药量大、粒径小、pH<7.5的酸碱环境下稳定性高，可在十二指肠、空肠部位以完整纳米粒的形式与小肠粘膜亲和透过，药物在血液中缓释。本发明工艺过程简单，不使用有机溶剂，易放大工业化。
图1为茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒1000倍显微镜照片。
具体实施例方式实施例1
一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于其溶解于7<pH<7. 5的37°C左右的溶液中时，不解聚，其粒径为IOOnm〈粒径<1000nm，+5mN<zeta电位<+40mV，分散系数<0. 3 ；
其是由下述原料制得茯苓多糖硫酸酯、壳聚糖以及乙酸；壳聚糖与茯苓多糖硫酸酯的重量比为10:0.1-10，所述的乙酸的用量需可完全溶解壳聚糖。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于60%，其分子量在0. 5-50万Da之间，所述的乙酸为体积比为0. 1_1%。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于90%。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖分子量在1-5万Da之间。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于茯苓多糖硫酸酯分子量在0. 5 -5. 0万Da之间；单糖硫酸根的取代度为1-3。所述的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤
A、壳聚糖用所述的乙酸完全溶解，茯苓多糖硫酸酯用去离子水配成浓度为0.1%-10%的溶液，在温度为20-80°C，以及50-1000 rpm搅拌下缓慢将茯苓多糖硫酸酯溶液加入壳聚糖溶液中，持续搅拌0. 5-2小时，此时混合液变混浊，得到稳定的纳米胶体溶液；
B、采用喷雾干燥法对所得的纳米胶体溶液进行喷雾干燥，喷嘴干燥温度70-120°C，高温喷雾干燥，即得产品。所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于所述的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒可与适当的赋形剂进一步制作成缓释或控释制剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、气雾剂、片剂直接服用。实施例2
1、茯苓多糖硫酸酯的制备
(1)采用常规碱溶解-酸沉淀的方法从中药茯苓中提取茯苓多糖，苯酚-硫酸法检测多糖含量为99. 1。索氏抽提和元素分析结果显示，所得茯苓多糖中检测不出蛋白、核酸和脂类物质。粘度法测定粘均分子量为2. 15X IO5 Da
(2)1000ml平底烧瓶中加入吡啶MOml，冷却至4 °C并搅拌，用分液漏斗慢慢滴加氯磺酸40ml，制备磺化试剂；
(3)向磺化试剂中加入二甲基亚砜(IOOml)预先溶胀的12g茯苓多糖，于75-80 °〇下剧烈搅拌反应1小时；
(4)4NNaOH调pH6，减压蒸馏去除水和吡啶，一直到蒸干为止；
(5)反应瓶中加500ml热水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脱色；
(6)3倍量的95%乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯，无水乙醇洗涤，真空干燥，得浅黄色粉末13.4 g ；
(7)改良的BaSO4浊度法检测所得产品硫酸根含量，结果为48.6%，以此计算所得单糖硫酸根取代度为1. 7 ；硝酸银法检测NaCl含量小于0. 15% ；
(8)经醋酸纤维素薄膜电泳，甲苯胺蓝染色，以已知分子量的肝素、硫酸软骨素、透明质酸为对照品，检测所得产品分子量分布范围为0. 6万-4. O万。2、大分子复合法制备茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒
(1)市售高粘度壳聚糖(0. 7-1. O Pa. S)，脱乙酰度>90%，用PH 3的乙酸溶液配成1. 0%乙酸混合溶液，茯苓多糖硫酸酯用去离子水配成0. 1%溶液，在室温25 °C、快速搅拌(800rpm)下将50mL茯苓多糖硫酸酯溶液逐滴加入500mL壳聚糖乙酸混合溶液中，800 rpm持续搅拌1小时。壳聚糖与茯苓多糖硫酸酯的重量比为100: 1。此时，混合液变混浊，为稳定胶体溶液。8D-1500型喷雾干燥机干燥上述胶体溶液，进风温度120°C，出风温度90°C。高温喷雾干燥产品以1%浓度溶解于37 V左右的、pH7. 5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，磁力搅拌(200 rpm) 0. 5小时，纳米粒不解聚。经过马尔文粒度仪检测，粒径732nm,^ia电位+31mV，分散系数为0. 15，显微镜拍出照片如图1(X1000)。结果说明本发明产品为结构稳定的茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，适合十二指肠、空肠等小肠的吸收。实施例3
1、茯苓多糖硫酸酯的制备
(1)采用常规碱溶解-酸沉淀的方法从中药茯苓中提取茯苓多糖，苯酚-硫酸法检测多糖含量为98. 8%。索氏抽提和元素分析结果显示，所得茯苓多糖中检测不出蛋白、核酸和脂类物质。粘度法测定粘均分子量为1.98X 105 Da
(2)1000ml梨形瓶中加入二甲基甲酰胺(DMF) 200ml，水浴加热至80 °C，加入氨基磺酸90 g并完全溶解；(3)加入30g茯苓多糖，氨基磺酸和茯苓多糖单糖残基摩尔比为5: 1，茯苓多糖与DMF的料液比(g:mL)为15:100 ；梨形瓶接旋转蒸发仪70 ！旋转反应3小时，转速110 rpm,抽真空，真空度达0. 095MPa ；
(4)饱和Na2CO3溶液调反应液pH到9.5 ；继续抽真空除氨，当pH值显著下降至6. 5及其以下后，再加Na2CO3溶液调pH到9. 5，再抽真空，如此反复5次，反应液无氨气味、pH值不再因脱氨下降。(5)反应液中加入4倍体积的95%乙醇，沉淀多糖硫酸酯，过滤后再复溶于水，再过滤，放入超滤器中脱盐并浓缩，用饱和氯化钡检测洗脱液中游离硫酸根的残留量，直至无白色沉淀；超滤膜分子截留量为10000 Da0(6)浓缩液用5倍体积95%乙醇沉淀3次，最后收集沉淀，90 °C烘干粉碎，得浅黄色粉末，得率115%。(7)元素分析法检测所得产品硫含量，结果为14. 7%，以此计算所得单糖硫酸根取代度为1. 4 ；
(8)经醋酸纤维素薄膜电泳，甲苯胺蓝染色，以已知分子量的肝素、硫酸软骨素、透明质酸为对照品，检测所得产品分子量分布范围为0. 8万-1. 5万。2、大分子复合法制备茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒
(1)市售中粘度壳聚糖(0.4-0. 65 Pa. s)，脱乙酰度>90%，用pH 3的乙酸溶液配成1.0%乙酸混合溶液，茯苓多糖硫酸酯用去离子水配成0. 5%溶液，在室温20 °C、快速搅拌(900rpm)下将50mL茯苓多糖硫酸酯溶液逐滴加入500mL壳聚糖乙酸混合溶液中，900 rpm持续搅拌1小时。壳聚糖与茯苓多糖硫酸酯的重量比为20: 1。此时，混合液变混浊，为稳定胶体溶液。8D-1500型喷雾干燥机干燥上述胶体溶液，进风温度110°C，出风温度85°C。高温喷雾干燥产品以m浓度溶解于37 V左右的、pH7. 5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，磁力搅拌(200 rpm) 0. 5小时，纳米粒不解聚。经过马尔文粒度仪检测，粒径
电位+24mV，分散系数为0. 13。结果说明本发明产品为结构稳定的茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，适合十二指肠、空肠等小肠的吸收。
权利要求
1.一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于其溶解于7<pH<7. 5的37°C左右的溶液中时，不解聚，其粒径为IOOnm〈粒径<1000nm，+5mN<zeta电位<+40mV，分散系数 <0. 3 ；其是由下述原料制得茯苓多糖硫酸酯、壳聚糖以及乙酸；壳聚糖与茯苓多糖硫酸酯的重量比为10:0. 1-10，所述的乙酸的用量需可完全溶解壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于60%，其分子量在0. 5-50万Da之间，所述的乙酸为体积比为0.1-1%。
3.根据权利要求1所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于90%。
4.根据权利要求1所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于所述的壳聚糖分子量在1-5万Da之间。
5.根据权利要求1所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒，其特征在于茯苓多糖硫酸酯分子量在0. 5 -5. 0万Da之间；单糖硫酸根的取代度为1-3。
6.一种如权利要求1所述的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤A、壳聚糖用所述的乙酸完全溶解，茯苓多糖硫酸酯用去离子水配成浓度为0.1%-10%的溶液，在温度为20-80°C，以及50-1000 rpm搅拌下缓慢将茯苓多糖硫酸酯溶液加入壳聚糖溶液中，持续搅拌0. 5-2小时，此时混合液变混浊，得到稳定的纳米胶体溶液；B、采用喷雾干燥法对所得的纳米胶体溶液进行喷雾干燥，喷嘴干燥温度70-120°C，高温喷雾干燥，即得产品。
7.根据权利要求6所述的一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于所述的口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒可与适当的赋形剂进一步制作成缓释或控释制剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、气雾剂、片剂直接服用。
全文摘要
本发明公开了一种口服茯苓多糖硫酸酯-壳聚糖纳米粒及其制备方法，在搅拌下缓慢将茯苓多糖硫酸酯溶液加入壳聚糖溶液中，持续搅拌，此时混合液变混浊，得到稳定的纳米胶体溶液，采用喷雾干燥法对纳米胶体溶液进行喷雾干燥，喷嘴干燥温度70-120℃，高温喷雾干燥，即得产品。本方法制备的纳米粒载药量大、粒径小、pH<7.5的37℃左右的酸碱环境下稳定性高，可在十二指肠部位以完整纳米粒的形式与小肠粘膜亲和透过，药物在血液中缓释。
文档编号A61P3/06GK102552153SQ201210062938
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月10日 优先权日2012年3月10日
发明者曹明成, 陈群 申请人:合肥承恩生物技术有限公司